Name: Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster의 신경근 접합부에서 FM 1-43 염료의 포토컨버전을 이용한 시냅틱 소포 풀 시각화 방법을. 이 기법은 시냅스 역학 연구에 필수적인 도구입니다.

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Drosophila melanogaster의 연결 근육질 교차로 1) 준비 (NMJ) <ol><li> 표준 Drosophila 호수 (130 MM NaCl, 36 MM의 자당, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 5 MM Hepes, 산도 7.3 4 준비합니다. </li><li> 식염 (1.1)의 준비를 해부하다. Drosophila의 애벌레는 Sylgard 접시에 지느러미 측면까지 pined이며 지느러미쪽에 세로 sectioned이며, 내장은 제거됩니다. 준비 나서 뻗어와 pined 있습니다. 여러 복부 근육 그런 다음 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2) 자극과 FM 염색법 <ol><li> 표백에서 FM 염료를 보호하기 위해, 낮은 조명 조건에있는 모든 다음 단계를 수행하는 것이 좋습니다입니다. </li><li> 신경의 화학적 자극에 대한 높은 칼륨 버퍼가 사용됩니다. KCl 90 MM 및 FM1 -​​ 43 염색 10 μm의를 포함하는 Drosophila 호수 (1.1 참조) 준비합니다. 조명으로부터 보호 솔루션을 유지. </li><li> 실온에서 1 분 이전에 준비를 버퍼로 준비 목욕탕. </li><li> 세포외 FM1 -​​ 43 염료를 제거하는 표준 Drosophila 호수 (1.1)로 씻으십시오. 고정으로 급속하게 진행합니다. </li></ol> 3) 고정 <ol><li> 실온에서 45 분간 인산염 버퍼 호수 (PBS)에 2.5 %의 글루 타 알데히드와 함께 준비 목욕탕. 형태학의 특징을 잘 보존 들어, 글루 타 알데히드는 paraformaldehyde로 선호합니다. </li><li> PBS로 한번 씻어 후 NH 4 Club 호텔의 100 밀리미터에서 15 분 잠수 준비를 두십시오. 이 단계는 남아있는 글루 타 알데히드 정착액의 무료 알데히드 그룹을 담금질하기 위해 수행됩니다. </li><li> 정상 PBS로 NH 4 Club 호텔 솔루션을 씻으십시오. </li></ol> 4) Photoconversion <ol><li> 4 30 분 NMJ 준비를 품어 ° PBS에서 C는 diaminobenzidine (DAB)의 1.5 MG ML - 1을 포함. </li><li> 형광 현미경 샘플을 위치. 상대적으로 낮은 배율 물 침지 목표 (20x 0.5 NA)를 사용하여 형광 신호를 찾아 중점을두고 있습니다. </li><li> FM의 염료가 (그림 1C) 완전히 표백 때까지 최대 램프 강도와 샘플을 조명. photoconversion가 발생하면 제어하려면, FM 염료 표백 단계 이전과 이후 전송 조명 아래의 예제에서 확인하는 것이 좋습니다. photoconversion이 이루어지는 경우, 어두운 갈색 침전물은 (그림 1C) 예정입니다. 조명 시간은 준비에 DAB 보급에 따라 또한 조명의 강도와에 따라 변수이다. 대부분의 준비를 위해 20x 목표를 사용하는 경우 ~ 30-45분의 조명 시간이 최적으로 발견했습니다. 짧은 조명 기간은 높은 배율의 목표 (60x)에 사용됩니다. </li><li> 조명을 위해 우리는 백 흩어진 빛의 광선을 수집하고, 따라서 총 강도를 증가 돌려 거울을 포함하는 램프 주택, 수은 램프를 사용하는 것을 선호합니다. </li></ol> 5) EM에 대한 샘플을 처리 <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> 물이 나무 볼륨에 오스뮴 tetroxide (샘플 당 약 300 μl) 중 하나 볼륨있는 솔루션을 준비합니다. 오스뮴의 tetroxide를 사용하는 것은 장갑 알겠 보호 장비를 사용하여 후드 아래에 이루어져야합니다. 작업 </li><li> 실온 (후드 아래)에서 1 시간 오스뮴의 tetroxide 솔루션의 준비를 품어. </li><li> PBS (4-5 회 5 분)와 함께 광범위하게 씻고 깨끗한 유리 플라스크에 각각의 샘플을 전송합니다. </li></ol></li><li> 탈수 <ol class="lalpha"><li> 30, 50, 70 90, 95 및 에탄올의 100 %를 포함하는 별도의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 5 분 각각의 샘플을 30 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 각 샘플의 50 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 각각의 샘플을 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 각각의 샘플을 90 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> (배를 반복) 5 분 동안 각각의 샘플을 95 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> (배를 반복) 5 분 동안 각 샘플에 100 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 퍼가기 및 추가 처리 <ol class="lalpha"><li> 에탄올 중 하나 볼륨 Epon 수지 1 볼륨을 섞는다. 연속 회전 (2~4시간)에서 준비에 추가합니다. </li><li> 오픈 flasks 100 % Epon에 준비를 놓고, 나머지 에탄올이 증발하도록 (4-6 시간). </li><li> 36 시간 동안 60 ° C에서 금형의 준비를 놓습니다. </li><li> 전자 현미경 처리. 표준 ultramicrotomy 절차를 사용하여 50-80 nm의 얇은 부분의 준비를 처리합니다. </li></ol></li><li> 전자 현미경 이미징 <ol class="lalpha"><li> 준비는 종래의 EM 절차를 사용하여 몇 군데 있습니다. </li></ol></li></ol> 6) 대표 결과 예상 결과는 그림 1C 2에 요약되어 있습니다. 형제의 형성에 조명 절차 결과형광 및 전송 영상 모두에서 표시됩니다 wn의 DAB의 침전물. 조명 중에 첫 번째 사건은 FM 염색의 얼룩과 관련된 형광의 실종이다. 알데히드 정착액에 의해 유도된 배경 형광은 반대로, 실험을 통해 확인할 수 있습니다. 표백은 조명의 시작 후 ~ 10~20분에서 일반적으로 이루어진다. 일반적으로 더 photoconversion 제품이 시점에서 관찰 수 없습니다. 조명은 계속되어야하고, ~ 10 분 후에 준비가 그것은 동시에 자리를하지 않는 이유 DAB 석출 및 FM 염료는 표백 불분명 DAB 축적으로 인해 갈색 그늘 (그림 1C IV)를 설정하는 것이며 그것은 비교적 큰 수 있습니다 산화 DAB의 금액은 집합과 침전하기 전에 축적해야하고, 따라서이 반응은 표백 과정을보다 느린입니다. DAB의 석출 가능성이 불완전으로이 단계에서는, 그러나, 준비, 전자 현미경 처리를위한 준비가되지 않습니다. 우리는 그 동안 준비 (presynaptic 신경 터미널) 완료 변환을 나타내는 어두운 갈색 (또는 검은색) 색상, 가정, 5-10분 이상 기다려야하는 것을 선호합니다. 준비의 일반적인 표면의 약간의 전환 (예를 들어, 신경근육학 교차점에있는 근육 섬유의)은이 단계에서 볼 수 있습니다. 그것은 가능성이 높습니다 autofluorescence (및 / 또는 정착액 형광)에 의해 유도된 DAB의 전환과 관련, 그리고 그것은 프로 시저에 해로운하지 않습니다. 준비 그러면 전자 현미경에 대한 처리이며, 어두운 (레이블) vesicles의 존재를 확인하여야한다. 우리가 5,6하기 전에 보여주는 것처럼, 이러한 vesicles가 아닌 표시된 것들보다 훨씬 밀도 있고, 따라서 쉽게 (그림 2B) 구분합니다. 잘 vesicles의 다른 유형을 구별의 기회를 증가하려면 섹션에 대한 대비를 향상 포스트 얼룩은 (NO uranyl 아세테이트 또는 리드의 구연 산염의 얼룩) 수행되지 않을 것입니다, 오스뮴의 얼룩은 대부분의 세포 요소를 관찰하기에 충분하고, 같이하지 않습니다 DAB의 침전물로 어두운. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : FM 염료하고 photoconversion을 위해 사용합니다. (A) 자극하에 FM 염료를 사용하여 vesicles를로드하고 distaining에 대한 고전적인 실험의 단계를 나타냅니다. (I)는 버퍼를 포함하는 FM 염료에 샘플을 품어. (2) FM 색소의 존재에 소포의 융합을 유도하기 위해 (전기 또는 화학적으로) 자극. (3) 자극 후 subsequence의 endocytosis가 세포 버퍼에있는 사람들 FM 색소 몇 가지 vesicles을로드합니다. (IV) 버퍼와 함께 세탁하여 세포 FM 염료를 교체하십시오. (V) 새로운 자극이 exocytosis에 따라 자신의 FM 염료를 공개로드 vesicles을 유발합니다. (B) 도식의 머리, 다리와 FM1 - 43 염료의 꼬리를 보여주는. Drosophila NMJ에 photoconversion의 실험 (C) 예. (I) 외부 염료 분자와 고정을 세척 FM1 - 43와 NMJ를 로딩 후 신경 단말기의 형광은 종래의 epifluorescence 현미경 (63x)로 볼 수 있습니다. (II - III) 지속적인 조명 아래 염료가 완전히 표백됩니다. (4) 조명이 계속되면 검은 색깔은 diaminobenzidine의 침전으로 인해 나타납니다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : EM 그들의 photoconverted 샘플 예제 (A) 이미지 시냅스 vesicles를 포함하는 신경 터미널을 보여줍니다,하지만이 photoconverted되며 이것은 충분한 조명이나 조직에서 가난한 diaminobenzidine의 침투를 가지고 있지으로 인해 발생할 수 있습니다.. (B) FM photoconversion 겪은 여러 어두운 (가득) vesicles와 시냅틱 부통. 더 vesicles 또는 organelles는 구별할 수없는 전반적인 어두운 조명 터미널에서 결과의 (C) 초과. 스케일 바는 200 나노미터를 나타냅니다.

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
<li>Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li>
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<li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li>
</ol>

몇 가지 중요한 단계를 고려해야한다 : <ul><li> DAB 보육은 준비 철저한 세척과 담금질 후에 실시하여야한다. 그렇지 않은 반응 글루 타 알데히드는 DAB과 상호 작 용할 수 있으며 (일반적으로 고밀도 전자되지 않은 평면 결정의 형태로)의 강수량을 일으킬 것입니다. 이 강수량이 넘치게 이루어지는 준비는 전자 현미경에 대한 거의 사용할 수 있습니다. </li><li> 조명 시간은 다른 조명 시간을 몇 가지 동일한 준비를 테스트하여 최적화해야합니다. 우리의 경험에서 최적의 변환 (그림 2B)은 약 5 분 시간 창 (예 : 35 사이에 40 분 조명의 시작 후)에 이루어진다. 부족 조명 (그림 2A)이 표시 organelles 부족, 및 / 또는 부분적으로 표시된 organelles (예 : 자신의 부피의 절반 밖에에서 DAB를 포함 나타나는 vesicles)에 의해 특징입니다. 긴 조명 반면, DAB 변환 제품이 축적을 통해 변환, 결과는 cytosol (그림 2C)에 organelles과 탈출을 왜곡. 준비가 거의...

<table><tbody><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen</td><td>F10317</td><td></td></tr><tr><td>Epon 수지</td><td>Plano GmbH</td><td>R1030</td><td></td></tr><tr><td>di-aminobenzidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyde</td><td>AppliChem</td><td>A3166</td><td>EM 등급</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>104186298</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대물렌즈 20x 0.5 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>건식 대물렌즈</td></tr><tr><td>100W Hg 램프</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>후면 거울 포함 램프 하우징</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>1007-980</td><td></td></tr><tr><td>MRm 카메라</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>0445-554</td><td>이미지 획득</td></tr><tr><td> excitation 필터 (HQ 470/40)</td><td>AHF</td><td>F49-671</td><td></td></tr><tr><td>다이크로익 필터 (495 DCLP)</td><td>AHF</td><td>F33-100</td><td></td></tr><tr><td>emission 필터 (HQ 500 LP)</td><td>AHF</td><td>F42-018</td><td></td></tr><tr><td>전자현미경(EM)</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proscan CCD HSS</td><td>Proscan Electronic Sys.</td><td></td><td>1024 x 1024</td></tr></tbody></table>

styryl 염료의 photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

플라즈마 막 (exocytosis)와 시냅스 vesicles의 융합은 신경 전달 물질 릴리스와의 연결을 통신에 필요한 단계입니다. 그들이 새로운 엑소과 endocytosis주기 (소포 재활용)을 받아야 때까지 vesicles 그런 다음, 플라즈마 막 (endocytosis)에서 검색 및 신경 터미널 내에 vesicles의 일반 수영장과 함께 그룹화됩니다. 이러한 프로세스는 이러한 전자 현미경, 전기 생리학 녹음, amperometry 및 커패시턴스 측정과 같은 기술을 사용하여 다양한 연구하고 있습니다. 중요한 것은 지난 20 년간 동안 찬란 분류 마커의 숫자는 광학 기술들이 재활용 역학 vesicles를 추적할 수있게 나타났다. 가장 일반적으로 사용되는 마커 중 하나는 styryl 또는 FM 염료 1, 구조적, 모든 FM 염료는 친수성 머리와 아로마 링과 하나 이상의 이중 채권 (그림의 1B)을 통해 연결된 lipophilic 꼬리가 포함되어 있습니다. vesicles의 수영장 레이블 클래식 FM 염료의 실험 (전기 또는 높은 K +와 함께) 신경의 자극 동안 염료와 준비 (그림 1Ai)를 목욕으로 구성되어 있습니다. 이것은 최근 endocytosed vesicles (그림 1A I - III)에 소포 재활용 및 염료의 후속 로딩을 유도. 염료, 염료없는 욕조에서 자극의 두 번째 라운드로 vesicles 로딩 후 exocytosis를 통해 FM 릴리스 (그림 1A IV - V), 형광 강도 감소 (destaining)를 모니터링하여 다음 수있는 프로세스를 실행하는 것입니다. FM 염료는 소포 재활용 분야에 크게 공헌했지만, 그것은 종래의 형광 현미경을 사용하여 개별 vesicles의 정확한 지방화이나 형태를 결정하는 것은 불가능합니다. 그런 이유로, 우리는 어떻게 FM 염료가 photoconversion 통해 전자 현미경을 사용하여 endocytic 마커로도 사용될 수 있습니다 여기에 설명합니다. photoconversion 기술은 강한 조명 아래의 반응 산소 종을 생성하는 형광 염료의 속성을 이용. 찬란 분류 준비는 diaminobenzidine (DAB)을 포함하는 솔루션에 빠져들와 조명입니다. 염료 분자에 의해 생성되는 반응 종족은 어두운 모습을 쉽게 전자 현미경 2,3로 구분할 수 안정, 불용성 침전물을 형성 DAB를 산화. DAB에만 형광 분자 (반응 산소 종은 단기 살고 있으므로)의 바로 근처에 산화되기 때문에, 기술은 찬란 표시된 구조는 전자 - 밀도 침전물을 포함 될 것을 보장합니다. 기술은 따라서 적극적으로 organelles을 재활용의 정확한 위치와 형태의 연구를 수 있습니다.

FM의 염료는 시냅스 역학의 이해에 귀중한 도움이되었습니다. FMS는 일반적으로 다른 자극 조건 동안 형광 현미경으로 다음 있습니다. 그러나, 전자 현미경과 함께 FM 염료의 photoconversion는 시냅스 부튼스의 다른 ultrastructure 구성 요소 간의, 서로 다른 시냅스 소포의 수영장의 시각화 수 있습니다.

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

시냅스 소포가 세포막과 융합되는 과정(세포외 배출)은 신경전달물질의 방출과 신경세포 간 통신에 필수적인 단계입니다.

이 영상은 Styro Dye FM 1 43의 광전환 절차를 보여줍니다. drosophila melanogaster의 시냅스 소포 풀을 연구하기 위해, 먼저 초파리 유충을 해부하여 신경근 접합부(NMJ) 표본을 구성하는 복측 근육을 노출시킵니다. 준비된 표본을 FM D가 포함된 버퍼에서 배양하며, 여기에서 회색으로 표시된 부분이 세포막에 라벨링된 모습입니다.그 후, 물리적 융합을 유도하기 위해 전기적 또는 화학적 자극을 가하며, 뒤이어 소낭 막이 내입됩니다. 자극된 엑소사이토시스는 FM D로 염색됩니다. 그 다음 세포외 FM 염료를 세척하여 세포막에서 제거하고, 지속적인 고강도 조명 하에서 조직을 고정합니다. 염료는 완전히 탈색되며, di amino Ben 침전으로 인해 검은색이 나타납니다.이 침전물은 투과 전자 현미경(TEM)으로 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 독일 괴팅겐에 있는 유럽 신경과학 연구소의 Sylvia Olli 연구실 소속 Philippe o Paso입니다. 오늘은 신경근 접합부 내에서 FM 광전환을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 시냅스 소포 재순환을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 해부 현미경 하에서 작업을 수행합니다. 먼저 소 가드(so guard)가 코팅된 디시에 초파리 유충을 등 쪽이 위로 오게 하여 핀으로 고정합니다.주사기 바늘을 사용하여 초파리 식염수로 덮고, 해부 가위로 등쪽을 세로로 절개하십시오. 그런 다음 내부 장기를 제거하십시오. 다음으로, 시료를 펼친 후 다시 시가 접시에 핀으로 고정하십시오.그 다음, 몇 개의 복측 근육을 이용하여 이 절차에 사용되는 FM 염료가 퇴색되지 않도록 보호할 수 있습니다. 이 절차는 저조도 환경에서 수행해야 합니다. 집게로 고정한 초파리 표본을 90 millimolar potassium chloride와 10 micromolar FM.1 43이 포함된 초파리 식염수로 덮어 신경을 화학적으로 자극하십시오.자극 후 실온에서 1분 동안 배양합니다. 자극 용액을 제거하고, 화학 안전 후드 내에서 100 milliliters의 초파리 식염수로 채워진 비커에 핀으로 고정된 초파리가 담긴 접시를 두 번 담가 세포 외 FM 1 43 염료를 제거합니다.신경근 접합부 준비물을 인산 완충 식염수(PBS) 내 2.5% glutaraldehyde에 넣고 상온에서 45분 동안 고정합니다. 준비물을 PBS로 한 번 세척한 후, 시가 접시(cigar dish)에서 꺼내 100 millimolar ammonium chloride에 15분 동안 담급니다. 이는 남아 있는 glutaraldehyde 고정제의 유리 알데하이드기를 퀀칭(quench)하기 위함입니다.일반 PBS를 사용하여 염화암모늄 용액을 세척하고, 신경근 접합부 표본을 새 시가 접시(cigar dish)로 옮긴 후 필터링된 1.5 mg/mL의 Diamine benzidine 또는 DAB/PBS 용액에 담가 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 백미러가 포함된 램프 하우징과 수은 램프 광원이 장착된 형광 현미경 아래에 샘플을 배치하고, 상대적으로 저배율의 건식 대물렌즈를 사용합니다.시료를 찾습니다. 그런 다음 일반적인 청색 여기-녹색 형광 필터 큐브를 사용하여 형광 신호의 초점을 맞춥니다. 신경근 접합부는 근육 상의 밝은 점으로 나타납니다.다음으로, 동일한 형광 필터 세트를 사용하여 FM D가 완전히 퇴색될 때까지 최대 강도로 시료를 조사합니다. 20배 대물렌즈를 사용하는 경우 30분에서 45분이면 충분할 것입니다. 하지만 광전환 시간은 조사 강도, 표본 내 DAB의 침투 강도 및 사용되는 대물렌즈에 따라 달라집니다.조사 후 투과광 하에서 시료를 관찰합니다. 광전환이 일어났다면 짙은 갈색 침전물이 보여야 합니다. 다시 해부 현미경으로 돌아가 가위로 유충에서 광전환된 부위를 절단합니다.해부 현미경으로 돌아갑니다. 그런 다음 가위를 사용하여 유충에서 광전환된 부위를 절단합니다. 이제 장갑과 보안경을 포함한 적절한 안전 장비를 착용하고 화학 안전 후드 아래에서 작업하며, 샘플을 PBS가 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.시료당 1% 사산화오스뮴 용액 300 µL를 준비합니다. 이제 시료를 플라스틱 캡이 달린 유리 플라스크에 넣고, 준비된 사산화오스뮴 용액을 첨가하여 고정 과정을 수행합니다. 시료를 배양하는 동안 30%, 50%, 70%, 90%, 95% 및 100% 농도의 에탄올 용액을 각각 따로 준비합니다.PBS로 샘플을 5분씩 4~5회 세척합니다. 매 세척 후에는 피펫에 플라스틱 PE 팁을 장착하여 샘플을 새 플라스크로 옮깁니다. 마지막 세척 후에는 샘플을 깨끗한 유리 플라스크로 옮깁니다.다음으로, 시료를 일련의 에탄올 용액에 넣어 탈수시킵니다. 우선 30% ethanol 1 mL에서 배양합니다. 5분 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 에탄올을 제거하고 50% ethanol 1 mL로 교체합니다.신경근 접합부 표본을 70%, 90%, 그리고 95% 용액 순으로 배양하여 탈수 과정을 계속합니다. 그 다음, 표본을 95% 에탄올 용액에 배양하고, 탈수 후 100% 에탄올에 세 번 배양합니다. 1:1 비율의 EIN 수지를 에탄올에 2 mL 첨가하고 표본을 회전 배양기에 넣습니다.100% EIN에서 회전시킨 후 실온에서 2~4시간 동안 유지하고, 샘플을 오픈 플라스크에 넣어 남은 에탄올이 4~6시간 동안 증발하도록 합니다. 신선한 EIN을 몰드에 붓습니다. 준비물을 넣고 60 °C에서 36시간 동안 배양합니다.EIN 임베딩 시료가 준비되면, 다이아몬드 나이프가 장착된 초박절단기(ultra microtome)를 사용하여 50 내지 80 nanometer 두께의 박절편을 제작합니다. 시료를 얇은 절편으로 절단합니다. 절단된 절편은 나이프의 워터 배스(water bath) 위로 흘러나오며, 이후 일반적인 EM 그리드로 수집할 수 있습니다.이제 일반적인 EM 절차를 사용하여 이미징할 준비가 되었습니다. Drosophila melanogaster에서 분리한 신경근 접합부를 고농도 칼륨으로 자극하였으며, 내재화된 막은 여기에서 보여주는 바와 같이 FM 1 43으로 염색되었습니다.신경 말단의 형광은 일반적인 에피 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 연속 조명 하에서 염료는 완전히 표백되며, 조명이 계속되면 디노벤진 침전으로 인해 검은색이 나타납니다. 이 신경 말단은 시냅스 소포를 포함하고 있으나, 그 중 어느 것도 광전환되지 않습니다.이는 조명이 부족하거나 조직 내 DIA amino benzine 침투가 원활하지 않아 발생할 수 있습니다. 반대로, 조명이 너무 강하면 전체적으로 터미널이 어둡게 나타나 소포나 소기관을 구별할 수 없게 됩니다. 적절한 양의 조명을 사용하면 광전환(photo conversion)을 확인할 수 있습니다. 이 현미경 사진은 어두운 소포 군집이 보이는 시냅스 버튼(synaptic bhuton)을 보여주며, 이는 FM 광전환이 일어났음을 나타냅니다.지금까지 fem dye로 표지된 시냅스 소포를 광전환하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 전환 단계의 조사 시간을 항상 주의 깊게 보정하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 보고서는 첨부 presynaptic 부튼스을 유지 가능한 개별 뉴런의 기계적 분리를위한 기술을 보여줍니다. Vibrodissociated 뉴런은 빠른 생산, 뛰어난 약리 제어 및 인접 세포의 영향없이 향상된 공간 클램프의 장점이 있습니다. 이 방법은 시냅스 요소 및 패치 - 클램프 녹화 영상에 사용될 수 있습니다.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

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이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

이 비디오는 재활용된 시냅스 소포의 광학 분석을 위해 배양된 뉴런을 준비하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 시냅스 소포 단백질의 형광 태깅과 면역 염색을 포함하여 뉴런 내의 재활용된 소포를 라벨링하고 시각화합니다.

Preparing Cultured Neurons for Optical Analysis of Recycled Synaptic Vesicles(재활용된 시냅스 소포의 광학 분석을 위한 배양 뉴런 준비)

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이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

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