Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

이 비디오에서는 Styro Dye FM 1 43의 광전환 절차를 설명합니다. drosophila melanogaster의 시냅스 소포 풀을 연구하기 위해, 먼저 초파리 유충을 해부하여 신경근 접합부(NMJ) 표본을 구성하는 복측 근육을 노출시킵니다. 표본을 FM D가 포함된 완충액에 배양하며, 여기서 회색으로 표시된 부분이 세포막의 라벨링된 모습입니다.

그 다음 전기적 또는 화학적 자극을 통해 물리적 융합을 유도하며, 이후 소낭 막이 내부화됩니다. 자극된 엑소사이토시스(exocytosis)는 FM D로 염색됩니다. 이후 세포 외의 FM 염료를 세척하여 세포막에서 제거하고, 지속적인 고강도 조명 아래에서 조직을 고정합니다. 염료는 완전히 탈색되며, 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine) 침전으로 인해 검은색이 나타납니다.

이 침전물은 투과 전자 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 독일 가본에 위치한 유럽 신경과학 연구소(European Neuroscience Institute)의 Sylvia Olli 연구실 소속 Philippe o Paso입니다. 오늘은 신경근 접합부에서 FM 광전환을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 시냅스 소포의 재활용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 해부 현미경 하에서 작업을 수행합니다. 먼저 소가드(so guard) 코팅 접시에 초파리 유충을 등 쪽이 위로 오게 하여 고정합니다.

주사 바늘을 사용하여 초파리 식염수로 덮어준 다음, 해부용 가위로 등쪽을 세로 방향으로 절개합니다. 그 후 내부 기관을 제거하십시오. 다음으로 표본을 펼친 뒤 다시 한번 페트리 접시에 핀으로 고정합니다.

그 다음, 몇 개의 복측 근육을 사용하여 본 절차에 사용된 FM 염료가 탈색되지 않도록 보호할 수 있습니다. 이 절차는 낮은 조도 조건에서 수행되어야 합니다. 핀셋으로 고정한 초파리 표본을 90 millimolar potassium chloride와 10 micromolar FM.1 43이 포함된 초파리 식염수로 덮어 신경을 화학적으로 자극합니다.

자극 후 상온에서 1분 동안 배양합니다. 자극 용액을 제거하고, 화학 안전 후드 내에서 100 milliliters의 drosophila saline이 담긴 비커에 핀으로 고정한 drosophila가 들어 있는 디쉬를 두 번 담가 세포 외 FM 1 43 dye를 제거합니다.

신경근 접합부 표본을 인산 완충 식염수(PBS)에 희석한 2.5% glutaraldehyde 용액에 넣고 실온에서 45분 동안 고정합니다. 표본을 PBS로 한 번 세척한 후, 시가 접시에서 꺼내 100 millimolar ammonium chloride 용액에 15분 동안 담급니다. 이는 남아있는 glutaraldehyde 고정제의 유리 알데하이드기를 퀀칭하기 위한 것입니다.

일반 PBS를 사용하여 염화암모늄 용액을 세척한 후, 신경근 접합부 준비물을 새 시가 디쉬(cigar dish)에 옮기고 PBS에 녹인 1.5 mg/mL의 필터 처리된 다이아민벤지딘(DAB) 용액에 잠기게 하여 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 백미러가 포함된 램프 하우징과 수은 램프 광원이 장착된 형광 현미경 아래에 시료를 배치하고, 상대적으로 저배율의 건식 대물렌즈를 사용합니다.

샘플을 찾습니다. 그다음 일반적인 청색 여기-녹색 형광 필터 큐브를 사용하여 형광 신호의 초점을 맞춥니다. 신경근 접합부는 근육 위의 밝은 점으로 나타납니다.

다음으로, 동일한 형광 필터 세트를 사용하여 FM D가 완전히 탈색될 때까지 최대 강도로 시료를 조사합니다. 20배 대물렌즈를 사용할 경우 30~45분이면 충분합니다. 다만, 광전환 시간은 조사 강도, 표본 내 DAB의 침투 강도 및 사용된 대물렌즈에 따라 달라집니다.

조사 후, 투과광 아래에서 시료를 관찰하십시오. 광전환이 일어났다면, 암갈색 침전물이 보일 것입니다. 다시 해부 현미경으로 돌아가, 가위로 유충에서 광전환된 부위를 절단하십시오.

해부 현미경으로 돌아갑니다. 그런 다음 가위를 사용하여 유충에서 광전환된 부위를 절단합니다. 이제 화학 안전 후드 내에서 장갑 및 보안경을 포함한 적절한 안전 장비를 착용한 상태로, 샘플을 PBS가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.

시료당 1% 오스뮴 사산화물 300 µL를 준비합니다. 이제 시료를 플라스틱 캡이 있는 유리 플라스크에 넣고, 준비된 오스뮴 사산화물 용액을 첨가하여 고정 과정을 수행합니다. 시료를 배양하는 동안, 30%, 50%, 70%, 90%, 95% 및 100% 에탄올을 포함하는 각각의 용액을 준비합니다.

시료를 PBS로 5분씩 4~5회 세척합니다. 매 세척 후에는 피펫에 플라스틱 PE 팁을 사용하여 시료를 새로운 플라스크로 옮깁니다. 마지막 세척 후에는 시료를 깨끗한 유리 플라스크로 옮깁니다.

다음으로, 시료를 일련의 에탄올 용액에 넣어 탈수시킵니다. 먼저 30% ethanol 1 mL에서 배양합니다. 5분 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 에탄올을 제거하고 50% ethanol 1 mL로 교체합니다.

신경근 접합부 표본을 70%, 90%, 그리고 95% 용액에 순차적으로 담가 탈수를 계속합니다. 그 후, 표본을 95% 에탄올 용액에서 수차례 배양한 뒤, 탈수 과정에 이어 100% 에탄올에서 3회 배양합니다. 1:1 비율의 EIN 수지 2 mL를 에탄올에 첨가하고, 표본을 로테이터 인큐베이터에 넣습니다.

100% EIN으로 회전시킨 후 상온에서 2~4시간 동안 유지하고, 남은 에탄올이 증발하도록 샘플을 오픈 플라스크에 넣어 4~6시간 동안 둡니다. 새 EIN을 몰드에 붓습니다. 준비물을 넣고 60 °C에서 36시간 동안 배양합니다.

EIN 매립 시료가 준비되면, 다이아몬드 칼이 장착된 울트라 마이크로톰을 사용하여 50~80 nm 두께의 박절편을 제작합니다. 시료를 얇은 절편으로 자릅니다. 절편은 칼의 워터배스로 흘러가며, 이후 일반적인 EM 그리드로 수집할 수 있습니다.

이제 일반적인 EM 절차를 사용하여 이미징할 준비가 되었습니다. Drosophila melanogaster에서 분리한 신경근 접합부를 고농도 칼륨으로 자극하고, 여기에 표시된 대로 FM 1 43을 사용하여 내포된 막을 염색하였습니다.

일반적인 에피 형광 현미경을 사용하여 신경 말단의 형광을 관찰할 수 있습니다. 연속 조명 하에서 염료는 완전히 탈색되며, 조명이 계속되면 디노벤진 침전으로 인해 검은색이 나타납니다. 이 신경 말단에는 시냅스 소포가 포함되어 있으나, 그 중 어느 것도 광전환되지 않습니다.

이는 조명이 부족하거나 조직 내로 DIA amino benzine의 침투가 제대로 이루어지지 않았기 때문에 발생할 수 있습니다. 반대로, 조명이 너무 과하면 전체적으로 어두운 말단이 되어 소낭이나 소기관을 구분할 수 없게 됩니다. 적절한 양의 조명을 통해 광전환(photo conversion)을 확인할 수 있습니다. 이 현미경 사진은 FM 광전환을 나타내는 어두운 소낭 무리가 보이는 시냅스 버튼(synaptic bouton)을 보여줍니다.

지금까지 fem 염료로 표지된 시냅스 소포를 광전환하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 전환 단계를 위한 조사 시간을 항상 세심하게 보정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.