Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

이 비디오는 Styro Dye FM 1 43의 사진 변환 절차를 보여줍니다. 초파리의 시냅스 소포 웅덩이를 연구하기 위해 먼저 초파리 유충을 해부하여 신경근 접합부 또는 NMJ 제제를 구성하는 복부 근육을 노출시킵니다. 제제는 회색 표지 세포막에 표시된 FM D를 포함하는 완충액에서 배양됩니다.

그런 다음 전기적 또는 화학적으로 자극되어 물리적 융합 소포막이 내재화된 추종을 유도합니다. 자극된 외포작용은 FM D.The extracellular FM 염료로 염색됩니다.그런 다음 원형질막에서 제거하여 조직을 세척하고 지속적인 고강도 조명으로 고정합니다. 염료는 완전히 표백되고 검은 색은 디 아미노 벤과 침전으로 인해 나타납니다.

그런 다음 이 침전물을 투과 em으로 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 독일 가온에 있는 유럽 신경과학 연구소(European Neuroscience Institute)의 실비아 올리(Sylvia Olli) 실험실에서 근무하는 필립 오 파소(Philippe o Paso)입니다. 오늘 우리는 FM 사진 변환 inria neuromuscular junction에 대한 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 시냅스 방광 재활용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 자, 이제 해부 현미경으로 작업을 시작하겠습니다. 초파리 유충 등 쪽을 위로 향하게 하여 보호대가 코팅된 접시에 고정하는 것으로 시작합니다.

주사기 바늘을 사용하여 초파리 식염수로 덮고 등쪽을 세로로 절개 가위를 찾습니다. 그런 다음 내부 장기를 제거하십시오. 다음으로, 준비물을 늘리고 다시 시가 접시에 고정합니다.

그런 다음 여러 복부 근육을 사용하여 이 절차에 사용된 FM 염료를 표백으로부터 보호할 수 있습니다. 이 절차는 저조도 조건에서 수행해야 합니다. 꼬집힌 초파리 제제에 90 밀리몰의 염화칼륨을 함유한 초파리 식염수와 10 마이크로몰 FM.1 43 다이를 함유하여 신경을 화학적으로 자극합니다.

자극 후 실온에서 1분 동안 배양합니다. 자극 용액을 제거하고 고정 된 초파리로 접시를 담그십시오. 100 밀리리터의 초파리 식염수를 채운 비커에서 두 번 준비하여 화학 안전 후드 아래에서 작동하는 세포 외 FM 1 43 다이를 제거합니다.

인산염 완충 식염수 또는 PBS에 2.5%글루타르알데히드를 넣어 실온에서 45분 동안 신경근 접합 제제를 고정합니다. PBS로 제제를 한 번 씻은 다음 시가 접시에서 제거하고 100 밀리몰 염화암모늄에 15 분 동안 담그십시오. 남은 둔근 알데히드 고정액의 유리 알데히드 그룹을 담금질합니다.

일반 PBS를 사용하여 염화암모늄 용액을 세척하고 신경근 접합 제제를 새 시가 접시에 넣고 여과된 밀리리터당 1.5밀리그램에 담그십시오. PBS에 디아민 벤진 또는 DAB를 넣고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 상대적으로 낮은 배율의 건식 대물렌즈를 사용하여 백 미러가 포함된 램프 하우징이 있는 수은 램프 광원이 장착된 형광 현미경 아래에 샘플을 배치합니다.

샘플을 찾습니다. 그런 다음 일반 청색 여기 녹색 형광 필터 큐브를 사용하여 형광 신호에 초점을 맞춥니다. 신경근 접합부는 근육에 밝은 점으로 나타납니다.

다음으로, 동일한 형광 필터 세트를 사용하여 FM D가 완전히 표백될 때까지 최대 강도로 샘플을 비춥니다. 20 x 대물 렌즈를 사용하면 30-45분이면 충분합니다. 그러나 사진 변환 시간은 조명의 강도, 준비물에 대한 DAB의 침투 강도 및 사용된 대물 렌즈에 따라 다릅니다.

조명 후 투과광 아래에서 샘플을 검사합니다. 사진 변환이 이루어진 경우 짙은 갈색 침전물을 볼 수 있습니다. 해부 범위로 돌아가서 가위를 사용하여 유충에서 사진이 변환된 부분을 자릅니다.

분석 범위로 돌아갑니다. 그런 다음 가위를 사용하여 유충에서 사진이 변환된 부분을 자릅니다. 이제 화학 안전 후드 아래에서 작동하고 장갑과 보안경을 포함한 적절한 안전 장비를 착용하고 PBS가 포함된 마이크로 fuge 튜브에 샘플을 넣습니다.

샘플당 300마이크로리터의 1%사산화오스뮴을 준비합니다. 이제 샘플을 뚜껑이 있는 플라스틱 유리 플라스크에 넣고 준비된 사산화오스뮴 용액을 첨가하여 제제를 후붙입니다. 샘플이 배양되는 동안 30, 50, 70, 90, 95 및 100% 에탄올을 포함하는 별도의 용액을 준비합니다.

PBS로 샘플을 각각 5분씩 4-5회 세척합니다. 세척할 때마다 플라스틱 PE를 피펫에 사용하여 샘플을 새 플라스크로 옮깁니다. 마지막 세척 후 샘플을 깨끗한 유리 플라스크에 옮깁니다.

다음으로, 샘플을 일련의 에탄올 용액에 배치하여 탈수합니다. 1ml의 30% 에탄올을 배양하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 5 분 후 목초지 피펫을 사용하여 에탄올을 제거하고 1 밀리리터의 50 % 에탄올로 교체하십시오.

탈수를 계속하고 신경근 접합 제제를 70, 90 및 95% 용액으로 배양합니다. 그런 다음 샘플은 탈수 후 100% 에탄올에서 3회 배양하는 것보다 더 많이 95% 에탄올 용액에서 배양됩니다. 에탄올에 2ml의 일대일 EIN 수지를 첨가하고 샘플을 rotator incubate에 놓습니다.

100% ein에서 회전 후 실온에서 2-4시간 동안 샘플을 열린 플라스크에 넣어 나머지 에탄올이 4-6시간 동안 증발할 수 있도록 합니다. 새로운 EIN을 틀에 붓습니다. 제제를 넣고 섭씨 60도에서 36시간 동안 배양합니다.

EIN 내장 제제가 준비되면 초소형 절편을 사용하여 다이아몬드 나이프를 사용하여 50-80나노미터 얇은 절편 I을 준비합니다. 샘플은 얇은 부분으로 절단됩니다. 섹션은 나이프의 수조로 흐르고 나중에 일반 EM 그리드에서 픽업할 수 있습니다.

이제 제제는 기존 EM 절차를 사용하여 이미지화할 준비가 되었습니다. Drosophila Melan gaster로부터 분리된 신경근 연접은 높은 칼륨과 내재화된 막을 사용하여 자극되었습니다. 여기에 표시된 대로 FM 1 43을 사용하여 염색했습니다.

신경 말단의 형광은 기존의 epi 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 연속 조명에서는 염료가 완전히 표백되고 조명이 계속되면 디노 벤진 침전으로 인해 검은 색이 나타납니다. 이 신경 말단에는 시냅스 소포가 포함되어 있지만 그 중 어느 것도 광으로 변환되지 않습니다.

이는 조명이 충분하지 않거나 조직에서 DIA 아미노 벤젠 침투가 불량하기 때문에 발생할 수 있습니다. 대조적으로, 너무 많은 조명은 적절한 양의 조명 사진 변환을 볼 수 있는 소포 또는 소기관을 구별할 수 없는 전체적으로 어두운 말단을 초래합니다. 이 현미경 사진은 FM 사진 변환을 나타내는 어두운 소포 웅덩이가 보이는 시냅스 부톤을 보여줍니다.

우리는 방금 fem die로 표시된 시냅스 소포를 사진 변환하는 방법을 보여 드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 변환 단계의 조명 시간을 항상 신중하게 보정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.