Name: 의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 학습하세요 Aplysia californica에서 다중 채널 전극을 제작하고 주입하여 자유롭게 행동하는 동물의 신경근육 활동을 실시간으로 기록하는 방법을. 이 기술은 먹이 섭취 행동의 신경 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 기꺼이 NIH (NS047073에 HJC)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 우리의 어플 리케이션을 위해 사용하는 것이 좋습니다 퀵 - 실상과 그녀의 초기 실험 캐서린 캘에 감사하고 있습니다.

1. 전극 제작 <ol><li> 전극을 만들려면, 약 2 미터 정도의 에나멜 코팅 0.001 인치 직경 스테인레스 스틸 와이어의 한 조각을 잘라 가위를 사용합니다. , 와이어의 각 끝에 퍼티의 작은 공을 첨부 절반 와이어를 접어, 그리고 트위스트 페어를 만들 끝을 스핀, 차등 전극했다. </li><li> 테이프는 별을 이루는 물질을 방지하기 위해 전선의 끝을 모두. 식별을 위해 각 차동 전극 (그림 1A)에 대한 테이프의 다른 색상을 사용하여 네 미분 전극을 확인하십시오. </li><li> 이인치를 떠나 함께 미분 전극의 트위스트 두 상대방에 한쪽 끝을 1 인치에 untwisted. 차동 전극의 나머지 쌍 (그림 1B)와 반복합니다. </li><li> 엔드 untwisted 남아 있는지 확인하고, 두 차동 전극의 두 세트를 트위스트. 전극 어셈블리를 잡고 끝까지 무료로 떠나, 네 개의 차동 전극의 교차점에서 가정용 실리콘 접착제를 적용합니다. 잠깐 만요 및 접착제는 최소한 4 시간 (그림 1C)에 대한 건조하실 수 있습니다. </li><li> 가지를 보온하려면, 나무 같은 조각은 평평, 이동, 표면에있는 전극 어셈블리를 내려 놓 아라. 끝을 밖으로 팬 테이프를 확보. 그냥 가지 전에 전극 어셈블리를 강화하고, 그 테이프 확보 플라스틱의 작은 조각을 사용합니다. </li><li> 해부 현미경에서 실리콘 접착제로 코팅 나뭇가지를 집게를 사용합니다. 1 인치 길이 끝이 동물 내부 것입니다, 그래서 그들은 접착제의 매우 얇은 코팅이 있어야합니다. 접착제 적어도 3 시간 동안 건조하실 수 있습니다. </li><li> 이cm 하나의 차동 전극의 1 인치 길이 끝이 짧게. 각각의 와이어에 실리콘과 에나멜의 1cm를 제거합니다. 레코딩을위한 후크 하나의 나선 컬. 후크의 다른 전선을 구부 멀리, 이것은 접지 와이어 역할을합니다. 나머지 세 전극에 대해 반복합니다. </li><li> 2 인치 엔드에 네 개의 전극 중 하나를 선택합니다. 실리콘을 다쳤고, 그리고 2 개의 와이어의 각 베어 스테인레스 스틸 와이어의 1cm를 노출에서 에나멜을 집게를 사용하십시오. 두 와이어 각 솔더 골드 커넥터. 끝부분을 확보하고 지상과 녹음 핀 사이의 분리를 유지하기 위해 실험실 테이프의 조각을 사용합니다. 나머지 세 전극에 대해 반복합니다. </li><li> 훅 엔드에서 약 1.5 인치 동물 이내에 전극을 고정하는 케이블에 실리콘 접착제의 1~2cm 볼을 연결합니다. 적어도 한 시간 (그림 1D)에 대한 건조하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 전극 어셈블리 제조. (A) 단일 차동 전극은 테이프와 함께 보안의 끝을 함께 접힌과 뒤틀린 와이어로 구성된. (B) 두 개의 차동 전극 끝에 untwisted 공간을 떠나 함께 트위스트. 다른 색깔의 테이프 또는 다른 표시는 끝을 식별하는 데 사용해야합니다. (C) 네개의 차동 전극 테이프가 독특한 색깔로 표시된 각 끝에있는 각각의 전극 별도의 지점과 함께 하나의 케이블을 형성 단일 전극 어셈블리로 결합. (D) 최종 전극 어셈블리의 형식입니다. 왼쪽에서, 각 차동 전극을위한 녹음 및 접지 와이어에 대한 갈고리를이 모습을 드러냅니다 있습니다. 오른쪽, 골드 커넥터 핀은 앰프에 연결하기위한 전선에 납땜했습니다. 실리콘 접착제의 고정 공은 또한 어셈블리의 왼쪽으로 배치되었습니다. </li></ol> 2. 이식을 위해 동물의 준비 <ol><li> 350~450그램에 대한 무게 건강한 동물을 선택합니다. 다시마 작은 조각에 대응, 동물은 5 ~ 3시 사이에 초 간격으로 물기를 생성해야합니다. 전극 이식과 전체 수술은 한 시간 정도 소요됩니다. </li><li> 동물을 마취시키기 위해서, 30 % W / V isotonic MgCl 2를 주사. hemolymph 및 MgCl 2의 손실을 방지하기 위해 사출 사이트는 바늘을 제거하기 전에 superglue에 코팅하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 도식 동물 전극 이식에 대한 고정된 방법을 보여주는 다이어그램과 절개의 위치 (막대로 표시). </li><li> 아래의 발에 절개 트레이에 anesthetized 동물을 배치. 동물 머리에 직면, 동물이 거리에 기대고, 그 측면에 부분입니다 왼쪽 등에 길 영역을 이동. 앞쪽에 촉수 (그림 2) 아래 핀. </li><li> 해부 현미경의 무대에 트레이를 놓습니다. 머리를 제고하고 멀리 절개에서 꼬리에 hemolymph를 수집하기 위해 약 20도 각도에서 트레이를 프로프. </li><li> 해부 가위를 사용하면, eyespot의 오른쪽에 약간의 절개를 시작하고 anteriorly 1.5cm로 1 확장. 절개 오픈을 보유하기 위해 트레이의 가장자리에 부착된 견인기 (; eyespot 나타내는 절개 근처에 참고 막대 그림 2)를 사용합니다. </li><li> 구강 미사를 노출하려면 아래 맑은 멤브레인 올려 포셉를 사용하여피부 및 사용 가위는 기본 절개와 일치하는 열기를 잘라합니다. 견인기에 막의 가장자리를 넣어. </li></ol> 3. 전극 이식 <ol><li> micromanipulator에 전극 어셈블리를 배치하고 동물의 절개를 통해 그것을 이동합니다. </li><li> radular 신경에 액세스하는 가장 어려운이며, 첫번째 접근해야합니다. radular 신경에 액세스하기위한 두 가지 옵션이 있습니다. </li><li> 바람직합니다 첫 번째 옵션은, BN1과 BN2 사이의 구강 신경절에 따라 볼 수 있습니다. radular 신경의 지점이 표시되면 (그림 3, 1 라벨 신경절 이하 RN의 루프) 지점을 리프트에 갈고리로 구부러진 미세 밀고 집게를 사용합니다. </li><li> radular 신경의 지점이 근육 이상 액세스할 수없는 경우 두 번째 옵션은 구강 신경절의 기초 (2 분류 근육 아래에 그림 3, RN)에있는 결합 조직 옆에 I2의 작은 절개를 통해 액세스할 수 있습니다. I2의 절개는 I2 근육의 두 레이어를 통과해야합니다. 스트레이트 집게와 근육 절개의 가장자리에 잡고 RN 지점을 잡아 줬습니다 집게를 사용합니다. </li><li> 갈고리 포셉로 신경을 잡고 있지만, 신경에 전극 후크를 조작하는 포셉의 다른 세트를 사용합니다. </li><li> 신경이 떨어져 구강 대량부터 해제되도록 후크를 마련하기 위해 micromanipulator를 사용하여 다른 신경이나 조직의 취소합니다. 신경을 overstretch하지 마십시오. </li><li> 주사기로 초과 유체에서 김 - 닦고 또는 흡입을 사용하여 전극을 건조. 워터 긴장 자체에 붕괴하는 신경, 또는 신경 아래의 양식에 물이 인감 발생할 수 있습니다. 접착제가 적용되기 전에 각각의 경우에,이 지역이 완전히 건조되어야합니다. </li><li> 후크의 기본은 신경의 바닥과 접촉에 superglue의 작은 소량을 적용합니다. superglue을 설정 Aplysia 호수 또는 hemolymph의 드롭을 적용합니다. 접착제이 젖었 아무것도로 이동해서는 안됩니다 때 와이어와 용기 사이에 접착제를 받고하면 전기 연결을 차단합니다. </li><li> 다시 미끼를 건조시킵니다. 얼음 팩 믹스 퀵 - 실 접착제. </li><li> 완전히 후크의 노출된 전선을 덮고있는 퀵 - 실 접착제의 작은 금액을 적용 핀의 팁,하지만 접지 와이어를 사용하십시오. </li><li> 접착제가이 미끼의 섹션에서 멀리 끌어 경우 접착제를 readjusting 5 분 정도로 설정되어 수 있습니다. 그것 더 이상 스틱은 (그림 4 최종 구성을 보여줍니다) 핀 만졌을 때 때 접착제가 설정됩니다. </li><li> radular 신경 전극이 설정되면, I2 근육에 액세스할 수 있습니다. BN1과 BN2 사이의 영역에서 후크에 푹 집게를 사용하여 부드럽게 위쪽으로 밴드를 당겨 근육의 나머지 부분에서 I2 근육의 2 밴드를 분리합니다. 동일한 절차를 사용하여 전극을 부착합니다. </li><li> 구강 신경 2와 3은 쉽게 액세스할 수 있으며, 전극은 같은 절차에 첨부됩니다. </li><li> 일단 모든 전극은 실리콘 앵커까지 동물에 전극 어셈블리를 슬라이드, 첨부합니다. </li><li> 절개는 동물 내부의 앵커를 유지, 튀어나온 전극 케이블 주위에 폐쇄 봉합해. 좋은 도장을 보장하기 위해 바늘을 Superglue. </li><li> 스티로폼의 작은 블록으로 전극의 다른 끝에있는 금색 커넥터 조언을 넣습니다. 복구 하룻밤에 대한 aerated 격리 컨테이너의 주요 탱크에 동물을 반환합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 구강 덩어리로 알려진 Aplysia 먹이 장치의 도표. 구강 신경 (BN1, BN2, BN3), 종료 구강 신경절의 하단은 다음 근육 아래 틈을되는 radular 신경 (RN)와 전​​극이 연결된 I2 근육의 위치를​​ 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 신경에 연결된 (또는 근육)과 장소에서 접착 단일 전극의 도식 다이어그램. 모습을 드러냅니다 후크의 드 절연 지역 superglue과 장소에 고정 신경 (혹은 근육)과 직접 접촉하고, 전기 퀵 - 실상을 사용하여 액체 매체에서 절연합니다. 접지 전극의 deinsulated 끝에이 유체 매체 노출되는도 있습니다. 4. 녹음 <ol><li> 최소 1.5 시간 동안 녹음 장비에 연결된 동안 aerated 컨테이너에있는 동물을 순응. 동물이 모든 전극 작동 및 소음 것을 적은 있는지 확인합니다 acclimating하는 동안 신호를 모니터링합니다. </li><li> 신경 및 근육 전극의 신호를 기록하기 위해 컴퓨터를 사용하는 동안 먹이 동작을 기록하기 위해 비디오 카메라를 사용합니다. 가 동시에 Axoscope에서 컴퓨터에 추가 채널로 기록되는 동안 카메라보기 디지털 카운터를 제어 평방 웨이브 신호를 사용하여 비디오 및 전극 기록을 동기화합니다. </li><li> 비헤이 비어를 수유하는 데 기술에 의해 elicited 아르모턴 앤드 Chiel 1993 년 scribed. </li></ol> 무척추 동물은 기관 동물 사용 및 관리위원회의 공식 승인을 필요로하지 않지만, 우리는 Aplysia의 모든 트리 트먼트가 손상을 최소화하고 동물에 고통, 그리고 동물이 완전히 anesthetized하는 동안 모든 수술 기법이 완료되는 것을 보장합니다. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1791/1791fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. (A) 근육 (분도기 근육 I2)의 동시 4 채널 레코딩, 그리고 삼키는 응답 중 세 구강 신경 (radular 신경, RN, 구강 신경 2 BN2 및 구강 신경이 3 BN3)에서. 자유롭게 행동 동물의 동시 비디오 녹화에서 (B) 여전히 프레임이 제비의 움직임과 같이 쉽게 시각 수 있도록 흰색 밴드 0.5 cm 간격으로 표시되었습니다 precut의 해초 스트립 (가로 0.5 ㎝)로 동물 피드.

<ol><li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).</li>
<li>Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nbsp%3BNeuromechanics+of+multifunctionality+during+rejection+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica.</a> J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).</li>
</ol>

이 음반이 성공적으로 만들었 주요 혁신 하나의 케이블로 전극을 결합합니다. 두 전극 기록은 이전에 사용 아니고 넷 개인 전극을 확대하는 것은 종종 정상적인 먹이의 움직임을 만들기에서 동물을 방해 수술 adhesions의 형성 결과되었습니다. 한 케이블에 전극을 결합하면 차례로 면역 반응을 감소 동물, 내부 전극의 대량 감소하고 동물보다 자유롭게 이동할 수 있습니다. 이 절차의 또 다른 혁신적인 측면은 신경이나 근육에 전극을 부착 Superglue과 퀵 - 실의 조합입니다. 이전 단지 Superglue 사용했다지만, 두 glues의 조합이 더 안정적으로 작동하고 더 이상 물에 노출되면 약 3 일 이내에 고장 Superglue보다 몇 일간 지속될 수 있습니다. 우리는 그것이 개인 식별 뉴런의 세포 기관에서 기록 또는 자극에 대해 그대로, 행동 동물 세포 전극을 이식 수 있습니다 것을 보여주 [워맨와 Chiel, 1995;. 류 ...

<table><tbody><tr><td>에나멜 코팅 스테인리스 스틸 와이어</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>0.001D, 코팅 h</td></tr><tr><td>가정용 실리콘 II 접착제</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil 접착제</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duro Qwik-Gel 순간접착제</td><td>Henkel Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-M Systems model 1700 증폭기</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>필터 설정: 신경 100-1000Hz, I2 근육 10-1000Hz</td></tr><tr><td>Axoscope 10.1</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>금도금 커넥터 핀</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>금도금 커넥터 소켓</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr></tbody></table>

의 전극 제작 및 주입 aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

의 주요 신경 및 근육에서 녹음<em&gt; Aplysia</em&gt; 수유 동작하는 동안 우리는 손상 동물에서 신경 컨트롤의 패턴을 공부하실 수 있습니다. 동시에 여러 신경 및 근육에서 기록하는 것은 우리에게 신경 활동의 타이밍에 대한 정확한 정보를 제공합니다. 이전 녹음 방법은 두 전극 위해 일한 있지만, 추가적인 신경이나 근육의 연구는 응답에서 응답에 결합하고 있기 때문에 다양성의 어려운 타이밍 및 중단할의 훌륭한 세부 사항을 결정하기 위해 만들어진 여러 동물의 기록을, 평균 필요하고,의 동물을 동물. 네 개인 전극을 이온 주입하면 정상적인 먹이의 움직임을 수행로부터 동물을 방지 adhesions의 형성으로 인해 매우 낮은 성공률이 있습니다. 우리는 정상적인 먹이의 움직임에 대한 허용 동물 내부 전극의 대량 감소 전극 제조의 새로운 방법을 개발했습니다. 그것이 가능한 주일만큼 기간 동안 기록하고, 더 오래 지속 전극의보다 안정적인 절연의 전극 결과를 첨부 glues의 조합을 사용합니다. 우리가 설명하는 제조 기술은 몇 가지 추가적인 전극을 포함하도록 확장할 수있는, 그리고 동물을 척추에 적용할 것입니다.

기술은 넷 이온 주입에 대한 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; 전극의 먹이 행동의 신경근육학 제어를 모니터링하는<em&gt; Aplysia californica</em&gt;.

의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

섭식 행동 중인 Aplysia의 주요 신경과 근육으로부터 신호를 기록하면, 온전한 상태의 동물 내에서 신경 제어 패턴을 연구할 수 있습니다.

다채널 생체 내(in vivo) 기록을 위한 전극 어셈블리를 제작하기 위해, 4개의 차동 전극을 만든 후 개별 차동 전극들이 갈라지도록 함께 꼬아줍니다. 말단 부위에서 마취된 동물을 핀으로 고정하고 안구 지점 측면에 절개를 가합니다. 표적 신경과 근육의 위치를 확인하고 전극을 훅 바닥면의 순간접착제 한 방울에 부착한 뒤, 퀵 씰(quick seal) 밀봉제로 절연 처리합니다.안녕하세요, 저는 Kiss Western Reserve University 생물학과 Halal Thiel 박사님 연구실의 Miranda Collins입니다. 오늘은 SIA, California에서 in vivo 기록을 위한 전극 조립 및 이식 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 SIA의 섭식에 관한 신경근 제어를 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.시작하겠습니다. 전극을 만들려면 가위로 지름 0.001 inch의 에나멜 코팅 스테인리스 스틸 와이어를 약 2피트 길이로 자릅니다. 와이어의 양 끝에 작은 퍼티 공을 부착합니다.와이어를 반으로 접고 끝부분을 회전시켜 차동 전극(differential electrode)이라고 불리는 꼬임 쌍을 만듭니다. 와이어가 풀리는 것을 방지하기 위해 양쪽 끝을 테이프로 고정합니다. 각각 다른 색상의 테이프를 사용하여 4개의 차동 전극을 제작합니다.식별을 위해, 두 개의 차동 전극을 서로 꼬아주되 한쪽 끝은 2인치, 반대쪽 끝은 1인치를 꼬지 않은 상태로 둡니다. 나머지 차동 전극 쌍에 대해서도 동일하게 반복합니다. 두 세트의 차동 전극을 다시 함께 꼬아주며, 이때 양 끝단은 꼬이지 않은 상태로 유지되도록 합니다.전극 어셈블리를 들어 올린 후, 끝부분은 제외하고 4개의 차동 전극이 만나는 접합부에 가정용 실리콘 접착제를 도포하십시오. 그대로 매달아 최소 4시간 동안 접착제를 건조시킵니다. 분지 부분을 절연하려면 전극 어셈블리를 나무판과 같이 평평하고 이동 가능한 표면에 내려놓으십시오.전극 어셈블리가 분기되기 직전 지점에 작은 플라스틱 조각을 사용하여 높이를 높인 후 테이프로 고정하십시오. 끝부분을 부채꼴 모양으로 펼쳐 테이프로 고정하십시오. 해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 분기된 부분에 실리콘 접착제를 도포하십시오.1인치 길이의 끝부분은 동물 내부에 위치하게 되므로, 접착제를 매우 얇게 도포해야 합니다. 접착제가 최소 3시간 동안 건조되도록 둡니다. 하나의 차동 전극에서 1인치 길이의 끝부분을 전극의 양 끝 각각 2cm가 되도록 짧게 자릅니다.포셉을 사용하여 두 전선 모두에서 실리콘과 에나멜을 긁어냅니다. 1 cm의 베어 와이어(bare wire)가 드러나도록 한쪽 전선을 말아 기록용 훅(hook)으로 만듭니다. 그런 다음 다른 전선을 훅에서 떨어지도록 위로 올려 접지선으로 사용합니다. 2인치 길이의 끝부분에 각 전선마다 금색 커넥터 핀을 납땜합니다.테이프 조각을 사용하여 끝부분을 고정하고 접지 핀과 기록 핀 사이에 간격을 유지하십시오. 이 단계들을 반복하여 4개의 차동 전극 모두에 훅과 금색 커넥터가 있도록 합니다. 훅 끝에서 약 1.5인치 떨어진 케이블 부위에 1~2cm 크기의 실리콘 접착제 덩어리를 부착하십시오.전극을 고정하기 위해, 작은 김 조각에 반응하여 3~5초 간격으로 입질을 하는 무게 약 350~450g의 건강한 개체를 선택하고 최소 1시간 동안 건조시킵니다. 전극 식립을 포함한 전체 수술 과정은 약 1시간이 소요됩니다.마취된 동물을 해부 접시에 놓고, 발 부분이 아래로 향하게 하여 동물의 머리를 정면으로 바라보게 배치합니다. 아가미 영역을 왼쪽으로 옮겨 동물이 몸을 약간 옆으로 기울인 상태가 되게 한 뒤, 앞쪽 촉수를 핀으로 고정합니다. 접시를 해부 현미경의 스테이지 위에 올립니다.트레이를 약 20도 각도로 세워 머리 부분을 높이고, 해부 가위를 사용하여 절개 부위에서 떨어진 꼬리 부분에 혈림프를 수집합니다. 눈점의 약간 오른쪽에 절개를 시작하여 머리 방향으로 1~1.5cm까지 확장합니다. 견인기를 사용하여 트레이 가장자리에 고정함으로써 절개 부위가 열린 상태를 유지하도록 합니다.볼 질량을 노출시키기 위해, 핀셋을 사용하여 피부 아래의 투명한 막을 들어 올리고 가위를 사용하여 주 절개선과 일치하도록 개구부를 만듭니다. 막의 가장자리를 리트랙터 안으로 밀어 넣습니다.전극 어셈블리를 마이크로 매니퓰레이터(micro manipulator)에 배치하고 동물의 절개 부위 위로 이동시킵니다. 4개의 전극 각각을 부착하는 데 약 10분에서 15분이 소요됩니다. 먼저 신경에 접근하는 과정을 보여준 후, 마지막 신경에 전극을 부착하는 과정을 보여줄 예정입니다. 하지만 실제로 수행할 때는 다음 신경을 노출시키기 전에 각 신경을 전극에 먼저 부착해야 합니다.척골 신경(ulnar nerve)은 접근하기 가장 어려우므로 먼저 접근해야 합니다. 척골 신경에 접근하는 방법에는 두 가지 옵션이 있습니다. 더 권장되는 첫 번째 옵션은 BN 1과 VN 2 사이의 구강 신경절(buccal ganglion) 아래를 확인하는 것입니다.설하 신경(ular nerve)의 분지가 보이면, 갈고리 모양으로 구부러진 미세 팁 핀셋을 사용하여 해당 분지를 들어 올립니다. 근육 위쪽에서 설하 신경의 분지에 접근할 수 없는 경우, 두 번째 방법으로 구강 신경절(buccal ganglion) 기저부의 결합 조직 옆에 있는 I 2에 작은 절개를 내어 접근하는 것입니다. I 2에 전극을 부착하려면 I 2의 절개가 I 2 근육의 두 층을 관통해야 합니다.갈고리 핀셋을 사용하여 I two 근육 접근 경로의 협신경 2의 두 밴드를 들어 올려 분리하십시오. 여기 협신경 3이 있으며, 이를 통해 전극 부착 방법을 시연하겠습니다. 모든 전극은 지금 협신경 3에서 시연하는 것과 동일한 방식으로 부착합니다.핀셋으로 신경을 고정했다면, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 다른 핀셋으로 전극 훅 하나를 신경에 겁니다. 신경이 구강 덩어리(buccal mass)에서 떨어져 위로 들리도록 훅을 들어 올립니다. 이때 다른 신경이나 조직이 함께 들리지 않도록 주의하며, 0.5 cm 이하로 최대한 적게 들어 올립니다.신경이 과도하게 늘어나는 것을 방지하기 위해, 킴와이프로 전극과 신경의 인접 부위의 물기를 제거합니다. 곤충 핀을 사용하여 접착제를 도포하며, 훅의 밑부분이 신경 하단에 닿는 지점에 소량의 순간접착제를 발라 전극을 고정합니다. 그 후 alysia 식염수나 혈림프 한 방울을 떨어뜨려 순간접착제를 경화시킵니다.그 후 아이스 팩 믹스 위에서 후크를 건조시킵니다. 접착제로 빠르게 밀봉합니다. 이렇게 하면 접착제를 약 30분 동안 작업 가능한 상태로 유지할 수 있습니다.수술 과정 중에 추가적인 혼합이 필요할 수 있습니다. 곤충 핀을 사용하여 갈고리의 노출된 와이어 부분을 소량의 quick seal로 완전히 덮으십시오. 이때 접지 와이어는 피하십시오.접착제가 5분 동안 굳도록 둡니다. 접착제 위치를 다시 조정합니다. 만약 접착제가 후크에서 떨어지면, 다음 신경으로 넘어가기 전에 접착제가 완전히 마를 때까지 기다리십시오.모든 전극의 부착이 완료되면, 실리콘 앵커가 닿을 때까지 전극 어셈블리를 동물 체내로 밀어 넣습니다. 돌출된 전극 케이블 주변의 절개 부위를 봉합하여 닫습니다. 앵커가 동물 체내에 유지된 상태에서, 봉합 부위에 순간접착제를 도포하여 밀봉 상태를 확실히 합니다.전극의 반대쪽 끝에 있는 금색 커넥터 팁을 작은 스티로폼 블록에 삽입하십시오. 동물을 폭기 장치가 설치된 격리 용기에 넣어 메인 수조로 옮긴 후 밤새 회복시킵니다. 기록 장비가 연결된 상태에서 폭기 용기 내에 동물을 최소 1.5시간 동안 적응시킵니다.동물이 적응하는 동안 신호를 모니터링하여 모든 전극이 제대로 작동하는지 확인하고 노이즈 수준이 낮은지 검증하십시오. 컴퓨터를 사용하여 신경 및 근육 전극의 신호를 기록하는 동안 비디오 카메라를 사용하여 섭식 행동을 기록하십시오. 카메라 뷰의 디지털 카운터를 제어하는 사각파 신호를 사용하며, 이 신호가 컴퓨터의 추가 채널로 동시에 기록되도록 하여 비디오와 전극 기록을 동기화하십시오.aScope에서 동물이 섭식할 때, 신경과 근육에 활동성 버스트가 나타납니다. 여기는 I 2의 EMG 활동과 RN BN 2 및 BN 3의 ENG가 포함된 삼킴 패턴의 예시입니다. 지금까지 자유롭게 행동하는 sia의 섭식 행동 중 신경 및 근육 활동을 기록하기 위해 다채널 전극을 제작하고 이식하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 신경을 조심스럽게 다루고 기록용 훅의 전선이 노출되지 않도록 완전히 밀봉하십시오. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을...

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

우리는 extracellularly 기록하고 신경, 근육, 및 개인 식별 뉴런에서 자극 할 수있는 기술을...

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이 비디오는 전극 어셈블리를 마우스의 뇌에 이식하는 기술을 보여줍니다. 어셈블리에는 해마의 활동을 기록하기 위한 양극성 전극과 소뇌에서 기준선 활동을 얻기 위한 참조 전극이 포함되어 있습니다. 마취된 마우스를 입체성 프레임에 놓고 전극 어셈블리를 표적 뇌 영역에 이식합니다. 그런 다음 동물은 전기 생리학적 기록을 수행하기 전에 회복하도록 허용합니다.

전기생리학적 기록을 위해 마우스 뇌에 전극 어셈블리를 이식합니다.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

하나의 단위 전기 생리학 녹음에 사용하기 위해 microwires의 조직 배열을 주입하는 기술 문제를 안겨준다. 이 기술과 필요한 장비를 수행하는 방법이 설명되어 있습니다. 또한, 높은 공간 선택과 별개의 신경 하위 영역에서 기록하는 조직 마이크로 와이어 어레이의 유익한 사용을 설명합니다.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

아피시아 단일 뉴런의 전기 생리 및 분자 분석을 위한 신경리아 준비

이 연구는 두뇌, 심전도, 근, 로컬 필드 전위의 동시 녹음 하 고 자유롭게 움직이는 쥐의 신호를 호흡 하는 방법을 소개 합니다. 이 기법을 실험 비용 절감 및 데이터 분석을 단순화, 뇌 및 말 초 기관 간의 상호 작용의 이해에 기여할 것입니다.

대뇌 피 질의 로컬 필드 전위, 심전도, 치십시오, 그리고 자유롭게 움직이는 쥐에서 리듬 호흡의 동시 녹음

아래에 기재된 것은 자유롭게 움직이는 쥐에서 만성 전기생리학적 기록을 위해 해부학적으로 먼 뇌 영역에 걸쳐 다중 폴리머 전극 어레이를 이식하는 방법이다. 준비 및 외과 이식은 다른 종에서 사용하기 위해 이러한 방법의 적응을 안내하는 디자인 원칙에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

다중 유연한 폴리머 전극 어레이의 만성 이식

여기서 제시된 것은 유발되고 자발적인 근전도 전위내의 생체 내 연대순 기록을 위한 이식형 시스템의 제조를 위한 프로토콜이다. 이 시스템은 신경 손상 다음 후두 근육의 회안의 조사에 적용됩니다.

만성 생체 내 근전도를 위한 이식형 시스템

여기서 Ti3C2 MXene 마이크로 전극 어레이를 제조하고 생체 내 신경 기록용으로 활용하는 방법을 설명합니다.

생체 내 신경 녹음을 위한 Ti3C2 MXene 마이크로 전극 어레이 의 제조

우리는 전극 제조를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 개발했으며 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 영역에 걸쳐 신호를 기록했습니다. 다중 지역 전기 생리학 및 칼슘 신호 기록과 함께 광유전학을 활용하면 발작 점화 모델에서 여러 지역의 신경 활동을 밝힐 수 있었습니다.

Multi-Region In vivo Recording을 위한 유연하고 편리한 전기생리학적 Optrodes를 제작하기 위한 통합 방법

학습하세요 Aplysia californica에서 다중 채널 전극을 제작하고 주입하여 자유롭게 행동하는 동물의 신경근육 활동을 실시간으로 기록하는 방법을. 이 기술은 먹이 섭취 행동의 신경 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

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