Name: Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: 학습하세요 연골 결함 치료를 위한 Ferumoxides로 표시된 중간엽 줄기 세포를 이용한 MASI 제작 방법을. MR 영상으로 줄기 세포 이식을 추적하는 비침습적 기술을 익히세요.

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이 작품은 관절염의 국립 연구소 Musculoskeletal 피부병, NIH RO1AR054458에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. Endorem과 hMSCs의 라벨링 <ol><li> 전지는 적어도 18시간 라벨 전에 80 %를 합류로 성장하고 있습니다. </li><li> 이 기간 동안, 라벨 미디어는 100 UG 철 / ML 혈청이없는 미디어의 복용량에있는 예제 Endorem을 추가하여 준비가되어 있습니다. </li><li> 세포가 합류로 성장 후, 문화, 미디어 aspirated되고 세포는 PBS 또는 혈청 무료 매체와 1X 세탁 있습니다. </li><li> 다음, 린스 솔루션 aspirated되고 이전에 준비 라벨 미디어가 추가됩니다. 세포는 다음 37 incubated 아르 ° C, 5 % 4 시간 CO 2. </li><li> 사시간 보육 후, 미디어를 분류하는 것은 aspirated되고 세포는 PBS로 씻어서하고 평소와 같이 trypsinized. </li><li> 일단 trypsinized, 세포는 PBS로 3 배 세탁과 5 분 400rcf에 centrifuged 있습니다. </li><li> 이 세척 단계 후, 전지,​​ resuspended 집계, 생존을위한 평가 및 실험에 필요한으로 사용됩니다. </li></ol> 2. 아가로 오스 준비 <ol><li> 세포로 분류되었습니다 후에 그것은 아가로 오스 솔루션을 준비하는 시간이다. </li><li> 벌금 규모, 아가로 오스 분말 80mg 아무리하고 PBS의 2ml에 추가됩니다. </li><li> 이 솔루션은 다음 부드럽게 떨면서 autoclaved입니다. </li><li> 약 40 분 후, 유체 아가로 오스 솔루션은 압력솥에서 촬영하실 수 있습니다. 볼륨은 측정 preheated PBS와 함께 적절하게 조정해야합니다. </li><li> 그런 다음 솔루션은 42 다운 냉각 ° C </li></ol> 3. 마시 만들기 <ol><li> 아가로 오스 솔루션 원하는 온도에 도달하면 세포는 계산 및 1.5ml Eppendorf 튜브에 마지막 centrifuged 있습니다. </li><li> 원심 분리 후, 뜨는가 폐기되고 세포는 30 X 10 6 세포 / ML의 농도에 도달하는 DMEM과 혼합됩니다. </li><li> 이제 세포는 42 ° C 따뜻한 아가로 오스와 혼합됩니다. </li><li> 감기 피펫 팁은 아가로 오스는 팁 내부 응고를 일으킬 수 있으므로 그것은 뜨거운 멸균 PBS를 pipetting 아래로 앞서 열을 가하다 끝에으로 좋습니다 </li><li> 자, 동질적인 현탁액이 생성되도록 미디어가 최대 촬영과 휴대 미디어 정직과 철저하게 혼합으로 아가로 오스의 같은 볼륨. </li><li> 아가로 오스는 응고 정도로 진정되지 않도록 믹싱 동안 preheated 물 목욕 내부 Eppendorf 튜브 보관하십시오. </li><li> 정지가 동질적인 경우, 세포가 결함에 이식하고 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1793/1793fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 연골의 결함에 이식 hMSCs과 슬개골 시편의 코로나 T2 가중 SE 이미지 (TR 4000 MS / MS TE 18.27).

<ol><li>Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+and+functional+maturation+of+bovine+mesenchymal+stem+cells+in+long-term+agarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Rahfoth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+allograft+chondrocytes+embedded+in+agarose+gel+into+cartilage+defects+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).</li>
<li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+iron+oxide+nanoparticles+for+non-invasive+in+vivo+tracking+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

설명 프로토콜은 철 산화물 nanoparticles와 MSCS를 라벨 및 연골의 결함으로 이러한 레이블 MSCS를 이식하는 재현할 방법을 제공합니다. 이 기술은 마시 장애의 조기 발견을 허용 MR 영상과 연골의 결함에 줄기 세포 이식의 비침습 묘사를 허용합니다. 라벨 세포의 전위 또는 유출은 MR 영상에서 이식 사이트에서 라벨의 실종에 따라 진단할 수 있습니다. 이러한 이벤트의 초기 진단 바람직하고 불필요한 대체 침입 진단 절차에서 환자를 방지합니다. 마시 결과를 진단에 대한 설명 비침습 방법은 관절염의 연골 재생을위한 셀 기반 요법의 성공적인 개발에 도움을 수 있습니다. 우리 프로토콜은 현재 잠복기에 - 생체내 연구에 적용, 원칙적으로 임상 적용됩니다 및 임상 연습에 마시 요법의 평가에 대한 비침습 성과 측정 역할을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; free)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>25399-120</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxides (Endorem)</td><td></td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Typ VII</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9045</td><td>Agarose를 PBS로 희석하여 최종 농도 4%로 조절</td></tr></tbody></table>

ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 mesenchymal 줄기 세포로 표시

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

조직 공학 분야는 특정 세포 기능 조직의 재생을 향해 공학, 세포 생물학 및 의학의 원리를 통합합니다. 매트릭스 관련 줄기 세포 이식 (마시는) arthritic 또는 외상성 관절 부상으로 인해 연골의 결함을 재생하는 것을 목표로하고 있습니다. 성인 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)는 chondrogenic 혈통의 세포로 차별화할 수있는 능력을 가지고 셀 기반의 관절 연골 수리 기술에 대한 유망한 결과를 보여주었다. Autologous MSCS는, 조직의 다양한 격리 수들은 차별의 잠재력을 그대로 유지한 채 셀 문화에 확장 될 수 있으며, 체외에서 생체내 1, 2 chondrogenic 차별을 증명하고있다. 연골의 결함 지역 유지 및 이식 MSCS의 생존을 제공하기 위해 발판도 후속 차별과 확산을 지원하는, 필요합니다. 발판 가이드 조직 형성의 아키텍처 및 줄기 세포에 의해 생산되는 세포외 매트릭스가, 확장 수 있습니다. 이전 조사는 2 % 아가로 오스 비계가 안정 유리 모양의 연골의 개발을 지원할 수 및 면역 반응에게 3 유발하지 않는 것으로 나타났습니다. 마시에 이식 줄기 세포의 장기 보관은 연골의 재생을 위해 중요합니다. 철 산화물 nanoparticles와 MSCS의 라벨링하는 비침습 MR 영상 기법 4 생체내 추적의 장기를 허용합니다. 이 프레 젠 테이션은 철 산화물 nanoparticles와 라벨 MSCS, 연골의 결함으로 이러한 구조의 셀 - 아가로 오스의 구성 및 이식의 생성에 대한 기술을 설명합니다. 분류 구조는 MR - 이미징과 비 invasively 추적할 수 있습니다.

프레 젠 테이션의 목표는 MR 영상과 시각 수있는 연골의 결함에 매트릭스 관련 줄기 세포 이식을 생성하는 높은 재현성 방법을 입증하는 것입니다. 줄기 세포는 아가로 오스와 혼합 FDA 승인 Ferumoxides, 연골의 결함에 심어 및 7T MR 스캐너와 함께 몇 군데으로 표시됩니다.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

조직 공학 분야는 특정 세포 및 조직의 재생을 위해 공학, 세포 생물학 및 의학의 원리를 통합하여...

본 발표의 목적은 줄기세포 기반 치료의 추적을 위해 para oxide가 표지된 HMEs를 이용한 MASI 제작의 쉽고 재현 가능한 방법을 시연하는 것입니다. MR 영상 표지를 위해 배지를 준비하여 T 75 플라스크에 첨가하고 4시간 동안 배양합니다. 그 다음 세포를 트립신 처리하여 분리하고 세척합니다.세 차례 세척 후 세포를 재부유시키고 튜브에 agros gel을 추가합니다. 이제 세포를 연골 결손 부위에 이식할 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 저는 Alex입니다.저는 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 방사선과 조영제 연구실의 High Delta Blink 연구실에서 온 I need re peel입니다. 그리고 저는 조영제 연구실의 Lydia Men입니다.오늘은 산화철 나노입자를 이용해 중간엽 줄기세포를 표지하고, 세포 응집체 구조물을 생성하며, 이 구조물을 연골 결손 부위에 이식하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 자기공명영상을 통해 중간엽 줄기세포를 비침습적으로 추적하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.우선, 라벨링 최소 18시간 전에 세포를 80% 합류도(confluence)까지 배양합니다. 이 시간 동안 세포가 합류도에 도달했을 때 즉시 사용할 수 있도록 라벨링 배지를 준비합니다. 이를 위해 무혈청 배지 1mL당 철 100µg의 용량으로 end durum을 샘플에 첨가합니다.세포가 완전히 성장(confluence)하면, 배양액을 흡입하여 제거하고 PBS 또는 무혈청 배지로 세포를 세척합니다. 그다음, 세척액을 흡입하여 제거하고 준비된 라벨링 배지를 첨가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양합니다.4시간의 배양 후, 표지 배지를 흡입하여 제거합니다. PBS로 세포를 헹군 다음 트립신을 처리합니다. 트립신 처리 후, PBS로 세포를 3회 세척하고 400 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다.이 세척 단계 후에, 세포를 재현탁하고, 세포 수를 측정하고, 생존율을 평가한 다음, 마지막으로 실험에 필요한 대로 사용합니다. 이제 매트릭스 결합 줄기세포 임플란트를 만드는 방법을 살펴보겠습니다. 우선 신선한 아가로스 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오.Agarose가 42 °C로 식으면, 세포 수를 측정하고 1.5 mL eppendorf tube에서 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 혼합하여 30 × 10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다. 세포를 따뜻한 agarose와 혼합하기 전, 뜨겁고 멸균된 PBS를 파이펫으로 흡입 및 배출하여 파이펫 팁을 예열합니다. 이렇게 하면 팁 내부에서 agarose가 응고되는 것을 방지할 수 있습니다.그 다음, 배지와 동일한 부피의 agros를 취하여 세포 배지 현탁액과 충분히 혼합하되, 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. 현탁액이 균질해질 때까지 agros가 식어 응고되지 않도록 혼합 과정 동안 einor 튜브를 예열된 항온수조 안에 보관하십시오. 세포를 결손 부위에 이식하면 이제 MR 영상 촬영 준비가 완료됩니다.이제 몇 가지 대표적인 결과로, 먼저 라벨링 기술과 다음으로 이식 기술을 보여드리겠습니다. 라벨링 후에도 플라스크 내의 세포들은 라벨링 되지 않은 세포들과 동일한 외관을 유지합니다. 예상대로, Caspase three 테스트를 통해 확인한 결과 라벨링 된 세포의 생존율은 변화가 없었습니다.라벨링된 세포와 agros를 결합하면 T2 강조 MR 이미지에서 보이는 것처럼 임플란트 내 신호 손실이 발생하며, 라벨링되지 않은 세포는 신호를 나타내지 않습니다. 세포 agros 구조물의 횡단면을 Prussian blue로 염색합니다. 세포 내 철 축적을 확인합니다.지금까지 산화철 나노입자를 이용해 중간엽 줄기세포를 표지하는 방법, 표지된 세포로 하이드로젤 구조물을 제작하는 방법, 그리고 이를 연골 결손 부위에 이식하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 따뜻한 하이드로젤을 세포 배지 현탁액에 추가하기 전에 피펫 팁을 미리 데우는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.또한 Mr.Imaging 시 기포가 형성되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와...

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

Ferumoxytol, FDA 승인 철 산화물 Nanoparticle과 함께 줄기 세포를 라벨링

토끼의 무릎 관절 chondral 결함의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 매트릭스 시드자가 연골 세포의 이식은 만족 장기적인 결과를 제공 관절 연골 병변의 개조 및 수리를위한 잘 받아 들여진 방법입니다. 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식 (MACT)는 표준화 된 임상 설립 주입 방법을 제공합니다.

토끼 모델에서 Chondral 결함의 리모델링 및 수리를위한 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식

토끼의 무릎 관절 연골 결손의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포의 이식은 조직 공학 분야의 유망한 개발을 제공합니다. 섬유소 세포 혈전의...

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

자가 혈청 인간 중간 엽 기질 세포 (중배엽 줄기 세포)를 배양, 이종 재료 및 기타 부정적인 영향에 의한 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 신선한 중배엽 줄기 세포를 제공 할 수 중배엽 전구 세포의 부분 집합의 복구 할 수 있습니다. 자가 섬유소 응고에 중배엽 줄기 세포를 포함하면 취급이 용이하고 효과적인 수술 주입을 할 수 있습니다.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

여기에 제시된 비침습적 중간엽 줄기 세포(MSC) 전달 및 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 추적을 위한 프로토콜이 제시된다. 초파라마그네틱 산화물 나노입자는 실시간 MRI를 이용한 비강 내 전달 후 생체 내 추적 및 비침습적 MSC 라벨링을 위한 자기 공명 영상(MRI) 프로브로 사용된다.

외상성 뇌 손상 뮤린 모델에서 비강 내 전달 후 MRI를 사용하여 수퍼 파라마그네틱 철 산화물 표지 메젠키말 줄기 세포 추적

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

여기서는 양 무릎에서 통제된 골연골 병변을 생성하는 통합 프로토콜을 제시하여 뼈 및 연골 조직 재생 연구에 적합한 실험 모델을 구축합니다. 프로토콜은 동물 복지에 미치는 영향과 결과 변동을 최소화하는 기법을 사용하여 대퇴골 과과에 전층 골연골 결손을 유도하는 방법을 제시합니다.

전층 골연골 결함의 양 모델 구축 및 평가

학습하세요 연골 결함 치료를 위한 Ferumoxides로 표시된 중간엽 줄기 세포를 이용한 MASI 제작 방법을. MR 영상으로 줄기 세포 이식을 추적하는 비침습적 기술을 익히세요.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

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