액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

안녕하세요, 제 이름은 Jay Harkins입니다. 저는 Protein Discovery의 연구 과학자입니다. 오늘은 새로운 gel free 8, 100 Fractionation 시스템을 사용하여 분자량 기반 분획을 통해 높은 회수율을 달성하는 방법이 얼마나 간단한지 보여드리겠습니다.

gel free를 사용하면 채널당 최대 1 mg의 총 단백질을 로딩할 수 있으며, 약 90분 만에 최대 8개의 샘플을 재현성 있게 분획할 수 있습니다. 이 시스템은 기기, 일회용 카트리지, 그리고 실험 수행에 필요한 모든 버퍼를 포함하고 있습니다. 이제 시작해 보겠습니다.

먼저 최대 8개의 500 µL 튜브를 준비하고 각각에 라벨을 부착하여 절차를 시작하십시오. 각 튜브에 최대 112 µL의 부피로 최대 1 mg의 단백질 샘플을 첨가합니다. 샘플 내 단백질의 양은 샘플의 복잡성에 따라 달라집니다.

본 시연에 사용된 조직 균질액과 같이 더 복잡한 시료의 경우, 채널당 150에서 200 µg을 사용했을 때 최적의 결과가 나타납니다. 다음으로, 젤 프리 카트리지 키트에 제공된 5x 시료 버퍼 30 µL를 첨가합니다. 각 단백질 시료에 1 M DTT 8 µL를 첨가합니다.

그 후, 각 샘플에 물을 첨가하여 최종 부피를 150 µL로 맞춥니다. 다음으로, 샘플을 변성시키기 위해 바이알을 95 °C에서 5분 동안 가열합니다. 가열된 샘플이 상온까지 식도록 둡니다.

포일 파우치에서 gel free 8, 100 카트리지를 꺼냅니다. 플레이트 실러를 제거하여 폐기합니다. 피펫을 사용하여 카트리지 구획에서 보관 완충액을 제거합니다.

카트리지의 8개 챔버를 모두 사용하는 경우, 카트리지를 뒤집어 구획 내의 보관 버퍼를 배출합니다. 다음으로, 각 양극 버퍼 저장소에 8 mL의 겔 프리 러닝 버퍼를 첨가합니다. 각 음극 버퍼 저장소에는 6 mL를 첨가하고, 각 수집 챔버에는 100 µL를 피펫으로 분주합니다.

8채널 100~200 µL 피펫을 사용하여 음극 완충액 저장조에서 시료 로딩 챔버로 흘러 들어간 완충액을 제거하여 버리고, 즉시 로딩 챔버에 시료를 로딩합니다. 시료 로딩이 완료되면 카트리지를 GelFree 8, 100 분획 스테이션에 장착합니다. 그런 다음 전극 어레이를 내리고 덮개를 닫습니다. 기기 터치스크린 디스플레이의 프로그래밍이 용이한 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 사용 가능한 사전 프로그래밍된 메소드 목록으로 이동합니다.

메서드 버튼을 눌러 적절한 방법을 선택하십시오. retrieve 버튼을 누른 후, 미리 프로그램된 방법의 해당 번호를 입력하십시오. 화면의 키패드를 사용하여 okay를 누릅니다. 그런 다음 apply 버튼을 누르십시오.

적용된 방법이 메인 화면 하단에 표시됩니다. 미리 프로그램된 각 방법은 특정 분자량 범위 내의 단백질을 분리하도록 설계된 설정 전압과 시간 기반의 일시 정지로 구성됩니다. 적절한 방법을 선택한 후, 메인 화면의 채널 버튼을 누르십시오.

그런 다음 분석에 사용할 채널을 선택합니다. 8개 채널을 모두 선택하려면 '모두 선택'을 누릅니다. 그런 다음 '완료'를 누릅니다.

메인 화면으로 돌아가려면 안전 덮개가 닫혀 있는지 확인하고 화면 하단의 표시등이 녹색인지 확인하십시오. 이제 시작(start) 버튼을 눌러 실험을 시작하십시오. 시스템이 작동하는 동안 화면 왼쪽 상자에 표시되는 원들은 각 채널의 상태를 나타냅니다. 녹색 원은 해당 채널이 활성화되었음을 나타냅니다.

인가된 전압과 전류는 채널 상태 표시 원의 오른쪽에 표시됩니다. gel free 8, 100은 분석법에 지정된 간격으로 분획 수집을 위해 자동으로 일시 정지합니다. 분획 수집을 위해 기기가 일시 정지되면, 일시 정지 상태임을 알리는 텍스트 상자가 나타나고 상태 표시 원이 노란색으로 변합니다.

카트리지 내부에서 양극과 음극 저장조 사이에 일정한 전압이 인가됩니다. 이 전위 하에서 단백질 혼합물은 전기영동에 의해 로딩 챔버에서 특수하게 설계된 정밀 캐스트 내부로 이동합니다. 단백질들은 먼저 스태킹 젤(stacking gel) 내에서 날카로운 밴드 형태로 농축된 후, 분리 젤(resolving gel)에서 각자의 분자량에 따라 분리됩니다.

단백질이 젤에서 용출됨에 따라 액상에서 포집 및 농축됩니다. 수집 챔버에는 젤 성분이 없습니다. 이후 기기 작동을 일시 정지합니다.

미리 선택한 시간 간격에 따라 피펫을 사용하여 분획을 수집합니다. 그런 다음, 관심 있는 두 번째 분자량 분획을 포집하기 위해 전위차를 다시 인가합니다. 원하는 모든 분획이 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다.

각 카트리지에는 8개의 독립적인 전기영동 채널이 포함되어 있어, 사용자는 필요한 만큼의 채널을 가동하고 사용하지 않은 채널은 나중에 사용할 수 있도록 보관할 수 있습니다. 분획물을 제거하려면 기기의 덮개를 열고 내장된 채널 피펫을 사용하십시오. 각 수집 챔버에 있는 150 µL의 액체를 수집 튜브나 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

분획물을 제거한 후, 각 채널에 100 µL의 gel free running buffer를 넣고 두 번씩 파이펫팅하여 수집 챔버를 두 번 세척합니다. 세척 후, 수집 챔버에 gel free running buffer 100 µL를 다시 넣습니다. 덮개를 닫고 resume 버튼을 누릅니다.

GelFree 8100은 다음 시간 간격까지 작동합니다. 실험의 총 남은 시간은 화면 오른쪽에 표시됩니다. 시간 표시창 위의 버튼을 눌러 남은 시간, 경과 시간 및 일시 정지 상태 간에 전환할 수 있습니다.

모든 분획의 수집이 완료되면, 등전점 전기영동이나 겔 전기영동과 같은 추가적인 후속 준비 과정 또는 액체 크로마토그래피, 질량 분석법이나 면역 친화성 분석에 즉시 사용할 수 있습니다. 본 시연에서는 각각 200 micrograms의 단백질 샘플 8개를 각각 12개의 분획으로 나누어 총 96개의 분획을 얻었습니다. 분획 결과를 시각화하기 위해, 소 간 균질액 샘플의 12개 분획에서 각각 일정량을 취해 표준 1D 겔에서 전기영동을 수행한 후 은 염색을 실시하였습니다.

이 그림에서 보는 바와 같이, 단백질 샘플은 3.5 kilodaltons에서 150 kilodaltons까지의 분자량 범위에 걸쳐 12개의 서로 다른 분획으로 분리되었습니다. 여기에 표시된 겔은 대량의 단백질을 뚜렷한 분자량 분획으로 분리하는 gel free 8, 100 시스템의 성능을 보여줍니다. 이는 질량 분석법을 이용한 top-down 및 bottom-up 프로테오믹스는 물론, 단일하게 정제된 온전한 단백질 분자량 분획이 필요한 면역 친화성 실험에 매우 강력한 도구입니다.

gel free 8, 100 분획 시스템을 사용하여 시료를 재현성 있게 개별 분자량 분획으로 나누고 높은 액상 회수율을 달성하는 방법이 얼마나 간단한지 보여드릴 수 있어 즐거웠습니다. 이것으로 모든 내용을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.