내유 상피 이식 절차

본 영상은 3주령 생쥐에서 유선 상피를 수확하고, 유선 지방 패드를 제거하며, 외인성 상피를 이식하여 유선 발달을 연구하는 절차를 보여줍니다. 이 시기 유선 상피 나무의 성장은 유두 근처로 제한되며, 지방 패드에는 유선 상피가 거의 없습니다. 생쥐가 성장함에 따라 상피 나무는 지방 패드를 통해 성장합니다.

생후 7주가 되면 상피 관상 구조(epithelial ductal tree)가 지방 패드 전체로 확장됩니다. 생후 3주에 상피가 포함된 지방 패드의 일부를 제거하면, 내인성 상피는 메모리 지방 패드(memory fat pad)에 다시 분포하지 못하며, 이 지방 패드는 제거된(cleared) 상태로 기술되고 성숙 시까지 제거된 상태를 유지하게 됩니다. 그러나 이식된 공여자 메모리 상피 또는 상피 세포는 제거된 호스트 전체에 메모리 관상 구조를 확장시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

지방 패드. 이후 조직학적 분석을 통해 형질전환 동물이나 실험 동물로부터 이식된 조직의 기억 발달 진행 과정을 모니터링할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 대학교 수의 및 동물 과학과의 Joseph Jerry입니다.

안녕하세요, 제 이름은 Karen Dunphy입니다. 저는 Jerry Lab에서 근무하고 있습니다. 오늘은 유선 상피 이식술을 진행해 보겠습니다.

본 절차를 통해 유선 종양 발생의 분자 및 세포학적 기반과 유방암 모델을 연구합니다. 이제 시작하겠습니다. 이식 절차의 첫 번째 단계는 공여 쥐로부터 유선 상피 조직을 채취하는 것입니다.

최근 안락사시킨 암컷 마우스의 복부 강 내 SRU 막을 찌르지 않도록 주의하며 70% ethanol로 세척하는 것으로 시작합니다. 치골에서 흉골까지 이어지도록 피부의 중앙 시상면을 절개합니다. 그 다음 치골의 초기 절개 부위에서 각 뒷다리 방향으로 사선 절개를 합니다.

곡선 핀셋을 사용하여 SRU 막을 잡습니다. 그런 다음 직선형 톱니 핀셋을 사용하여 피부의 절단된 가장자리를 잡고, 체벽을 S cs 막으로부터 조심스럽게 벗겨냅니다.

체벽 하단에 부착된 네 번째 서혜부 기억샘(inguinal memory gland)을 노출시키려면, 기억샘 내의 림프절이 기억샘 내 세 개의 주요 혈관이 교차하는 지점에 위치하며 지방 패드 내에서 조밀한 결절 형태로 느껴지는 점을 이용합니다. 안과용 가위(eye scissors) 끝으로 림프절 주변의 지방 조직을 살짝 집어냅니다. 그런 다음 검지 손가락으로 피부의 표피 측을 누르며 압력을 가해 림프절을 지방 패드 밖으로 밀어 올린 후 떼어냅니다.

곡선 핀셋을 사용하여 림프절을 제거합니다. 이제 피부의 가장자리를 잡은 상태에서, 곡선 핀셋의 곡선 부위로 유선 지방 패드를 잡고 체벽에서 지방 패드를 서서히 벗겨냅니다. 지방 패드의 방향을 따라 쥐의 등쪽 표면으로 이동하며 유선 전체를 한 덩어리로 제거합니다.

멸균된 플라스틱 절단 블록 위에 기억샘을 올리고, 샘의 표면이 촉촉하게 유지되도록 약 200 microliters의 소량 배지를 가합니다. 그런 다음 새 면도날을 사용하여 샘을 1 millimeter 크기로 잘게 다집니다. 다진 샘을 네 부분으로 나눕니다.

그 다음 핀셋을 사용하여 4개의 동결 보존액이 담긴 크라이오 바이알에 나누어 담습니다. 외측 구획에 250 milliliters의 isopropyl alcohol이 채워진 Nalgene 세포 동결 용기에 크라이오 바이알을 넣습니다. 그 후 세포 동결 용기를 minus 70 degrees Celsius에서 24시간 동안 보관합니다.

24시간 후, 냉동 보관된 기억 파편 바이알을 이식에 필요할 때까지 액체 질소에 옮겨 보관합니다. 각 cryo 바이알에는 4~8마리의 수용 마우스 지방 패드 제거 부위에 이식할 수 있는 충분한 양의 기억 샘 파편이 들어 있습니다. 3주령 수용 마우스의 발가락 꼬집기 테스트로 마취 깊이를 확인한 후, 마우스의 복부가 팽팽해지도록 사지를 뻗은 상태로 배면이 위로 향하게 하여 수술대 위에 단단히 고정합니다.

수술 전 진통제인 bupivacaine 또는 buprenorphine을 피하 투여해야 합니다. 핀셋을 사용하여 알코올과 요오드 기반 세정제로 수술 부위를 소독하십시오. 골반 위 몇 밀리미터 지점의 피부를 잡고 복부에서 들어 올립니다.

피부를 조심스럽게 집어 올리되, 초기 절개 부위가 요도에 너무 가깝지 않도록 주의하십시오. 요도에 너무 가까우면 상처 폐쇄 클립의 위치가 마우스의 배뇨 능력에 영향을 줄 수 있습니다. 다음으로, SRU 막을 뚫지 않도록 주의하며 치골에서 흉골까지 이어지는 피부의 정중면 절개를 수행하십시오.

이제 처음 절개한 부위부터 정중선에서 골반을 가로질러 각 뒷다리 방향으로 피부를 사선으로 절개합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 복벽의 S ceros 막을 조심스럽게 잡습니다. 그런 다음 조직 핀셋으로 절개된 피부 가장자리를 잡고 복벽을 ceros 막으로부터 당겨 분리합니다.

네 번째 서혜부 기억샘을 노출시키려면, 네 번째 기억샘을 식별하십시오. 다섯 번째 기억샘을 식별하고, 유두 결절과 해당 결절로 이어지는 두 개의 동맥을 소작하십시오. 네 번째와 다섯 번째 샘을 분리한 다음, 다섯 번째 샘의 가장자리를 소작하십시오.

다음으로, 가위를 사용하여 림프절 바로 복측의 지방 패드를 가로질러 절단하여 네 번째 유선 지방 패드를 분리합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 지방 패드의 복측 부분을 단단히 잡고 체벽에서 떼어냅니다. 절제된 조직은 라벨이 붙은 두 개의 슬라이드 사이에 끼워 한 덩어리로 압착한 후, Carnoy 고정액에 고정하는 것이 권장됩니다.

이후 조직을 염색하고 마운팅하여 절제연이 충분히 확보되었는지 평가할 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 지방 패드의 제거 부위 주변에 남아 있는 기억샘의 모든 흔적을 제거합니다. 이제 동물은 조직 또는 세포 이식 준비가 완료되었습니다.

신선하거나 급속 동결된 공여체 상피 조직을 제거된 지방 패드에 이식할 수 있습니다. 또는 불멸화된 기억 상피 세포주, 기억 종양 세포주 또는 일차 세포를 이식할 수 있습니다. 세포 준비에 대한 자세한 내용은 상피 조각 이식에 관한 동반 서면 프로토콜을 참조하십시오.

본 영상은 냉동 보관된 상피 조직 바이알을 해동하고, 조직 파편들을 신선한 배지가 담긴 페트리 접시로 옮기는 것으로 시작합니다. DMSO를 희석하기 위해 가위를 사용하여 수혜 마우스의 지방 패드가 제거된 상피 부위에 포켓을 만듭니다. 그런 다음 니들 포셉을 사용하여 1 mm 크기의 공여 상피 조각을 해당 포켓 안에 배치합니다.

필요한 경우, 조직 포셉으로 포켓을 닫은 상태로 유지하고 바늘 포셉을 제거하여 조직이 제자리에 있도록 합니다. 피부의 마주 보는 가장자리를 잡습니다. 포셉을 사용하여 이들을 함께 고정합니다.

복강의 투명막(ceros membranes)에서 떼어낸 후 상처 클립으로 폐쇄합니다. 정중시상절개 부위는 두 개의 클립으로, 각 사선 절개 부위는 하나의 클립으로 폐쇄합니다. 필요한 경우 요도가 폐쇄되지 않도록 주의하십시오.

봉합사를 사용하여 정중선 절개와 사선 절개가 만나는 지점의 피부 틈을 봉합합니다. 마우스를 케이지에 넣고, 마우스가 회복될 때까지 가열 램프 아래에 둡니다. 상처 부위의 클립은 2주 후에 제거해야 합니다.

다음 슬라이드들은 급이 패드를 제거하고 상피를 이식한 후 숙주의 기억샘에서 관찰할 수 있는 대표적인 이미지들을 보여줍니다. 이 이미지는 3주령 마우스에서 제거된 내인성 기억 상피를 보여줍니다. 샘 제거 과정에서 절단면의 투명한 경계면에 유의하십시오. 제거된 경계면을 평가하기 위해 각 절차 후에 이와 같은 전체 마운트 표본을 준비해야 합니다.

이 이미지는 투명화 과정 7주 후의 마우스 지방 패드 투명화 상태를 보여줍니다. 전체 지방 패드에 memory, 상피, 헤마틴 및 asin이 없음에 유의하십시오. 투명화 과정 7주 후 투명화된 지방 패드의 염색 결과 또한 샘에 memory 상피가 없음을 보여줍니다.

10주령 생쥐의 공여자 메모리 상피가 이식된 투명화된 지방 패드의 대표적인 전체 마운트 사진이 제시되어 있습니다. 이식된 상피가 정상적인 상피 도관 트리, 헤마틴 및 포상을 형성했음에 유의하십시오. 투명화된 지방 패드와 메모리의 염색 결과입니다.

동일한 연령의 상피 이식을 통해 외래 상피로부터 상피관이 정상적으로 생성됨을 확인할 수 있습니다. 여기서 투명화된 지방 패드를 헤마톡실린과 에오신으로 염색하면 메모리 종양으로 발전한 상피 이식편이 나타납니다. 지금까지 유선 상피를 채취하고 유선 상피 이식을 수행하는 방법을 살펴보았습니다.

본 절차를 수행할 때, 노드와 젖꼭지를 소작하기 위해 네 번째와 다섯 번째 유선 사이의 연결을 절단하고, 내인성 상피의 모든 흔적을 제거하는 것이 중요합니다. 이는 내인성 상피가 제거된 지방 패드 내로 성장할 가능성이 없도록 하기 위함입니다. 또한, 절제면이 충분히 확보되었는지 확인하기 위해 제거된 유선 조직 전체를 보관하는 것이 권장됩니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.