내유 상피 이식 절차

이 영상은 3주령 생쥐에서 유선 상피를 수확하고, 유선 지방 패드를 제거하며, 외인성 상피를 이식하여 유선 발달을 연구하는 절차를 보여줍니다. 이때 유선 상피 나무의 성장은 젖꼭지 주변으로 제한되며, 지방 패드에는 유선 상피가 거의 없습니다. 생쥐가 성장함에 따라 상피 나무는 지방 패드를 통해 성장합니다.

생후 7주가 되면 상피 도관망이 지방 패드 전체로 확장됩니다. 생후 3주에 상피가 포함된 지방 패드의 일부분을 제거하면, 내인성 상피는 메모리 지방 패드에 다시 정착하지 못하며, 이 지방 패드는 '제거된(cleared)' 상태로 기술되고 성숙기까지 그 상태를 유지하게 됩니다. 그러나 이식된 공여자의 메모리 상피 또는 상피 세포는 제거된 수용체 전체에 메모리 도관망을 확장시킬 잠재력을 가지고 있습니다.

지방 패드. 이후 조직학을 이용하여 형질전환 동물 또는 실험 동물로부터 이식된 조직 내 메모리 발달의 진행 과정을 모니터링할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 대학교 수의 및 동물과학과의 조셉 제리입니다.

안녕하세요, 제 이름은 Karen Dunphy입니다. 저는 Jerry Lab에서 근무하고 있습니다. 오늘은 유선 상피 이식을 진행해 보겠습니다.

우리는 이 절차를 통해 유선 종양 발생의 분자 및 세포 기반과 유방암 모델을 연구합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 이식 절차의 첫 번째 단계는 공여 마우스로부터 유선 상피 조직을 채취하는 것입니다.

최근 안락사시킨 암컷 생쥐를 70% ethanol로 세척하되, 복강의 SRU 막을 찌르지 않도록 주의하며 시작합니다. 치골에서 흉골까지 이어지도록 피부를 따라 정중선 절개를 실시합니다. 그런 다음 치골의 초기 절개 부위에서 각 뒷다리 방향으로 사선 절개를 합니다.

곡선 핀셋을 사용하여 SRU 막을 잡습니다. 그런 다음 직선 톱니 핀셋을 사용하여 피부의 절단된 가장자리를 잡고 체벽을 S cs 막에서 조심스럽게 벗겨냅니다.

체벽 아래쪽에 부착된 네 번째 서혜부 메모리 샘(inguinal memory gland)을 노출시키려면, 메모리 샘 내의 림프절이 메모리 샘 내 세 개의 주요 혈관이 교차하는 지점에 위치하며 지방 패드 내에서 조밀한 결절로 느껴진다는 점을 이용합니다. 안과용 가위의 끝부분으로 림프절 주변의 지방 조직을 집어 떼어냅니다. 그런 다음 검지 손가락을 피부의 표피 쪽에 대고 압력을 가해 결절을 지방 패드 밖으로 들어 올린 후 집어내어 분리합니다.

곡선 핀셋을 사용하여 림프절을 제거합니다. 이제 피부의 가장자리를 잡은 상태에서, 곡선 핀셋의 곡선 부위로 지방 패드(memory fat pad)를 잡고 체벽에서 지방 패드를 서서히 벗겨냅니다. 지방 패드가 마우스의 등쪽 표면으로 향하는 방향을 따라 유선(memory gland) 전체를 한 덩어리로 제거합니다.

멸균된 플라스틱 절단 블록 위에 기억샘(memory gland)을 올리고, 샘 표면을 촉촉하게 유지하기 위해 약 200 µL의 소량의 배지를 가합니다. 그런 다음 새 면도날을 사용하여 기억샘을 1 mm 크기로 잘게 다집니다. 다진 기억샘을 네 부분으로 나눕니다.

그 후 핀셋을 사용하여 동결 보존액이 담긴 4개의 크라이오 바이알(cryo vial)에 나누어 분배합니다. 외부 구획에 isopropyl alcohol 250 milliliters가 들어 있는 Nalgene 세포 냉동기에 크라이오 바이알을 넣습니다. 그런 다음 세포 냉동기를 -70 °C에서 24시간 동안 보관합니다.

24시간 후, 냉동된 기억 파편 바이알을 이식에 필요할 때까지 액체 질소에 보관하십시오. 각 cryo 바이알에는 4~8마리의 수용 마우스 지방 패드 제거 부위에 이식할 수 있는 충분한 양의 기억 샘 파편이 들어 있습니다. 3주령 수용 마우스의 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 마취 깊이를 확인한 후, 복부가 팽팽해지도록 수술대 위에서 마우스의 사지를 뻗게 하여 복부 쪽이 위로 향하게끔 단단히 고정하십시오.

수술 전 진통제인 bupivacaine 또는 buprenorphine을 피하로 투여해야 합니다. 포셉을 사용하여 알코올과 요오드 기반 세정제로 수술 부위를 소독하십시오. 골반 위 몇 mm 지점의 피부를 잡고 복부에서 들어 올리십시오.

피부를 조심스럽게 집어 올리되, 초기 절개 부위가 요도에 너무 가깝지 않게 주의하십시오. 요도 근처에 상처 폐쇄 클립을 배치하면 생쥐의 배뇨 능력에 방해가 될 수 있습니다. 그다음, SRU 막을 뚫지 않도록 주의하면서 치골에서 흉골까지 이어지는 피부의 정중면 절개를 수행합니다.

이제 첫 절개 부위로부터 정중선에서 골반을 가로질러 각 뒷다리 방향으로 피부를 사선으로 절개합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 복벽의 S ceros 막을 조심스럽게 잡습니다. 그런 다음 조직 핀셋으로 절개된 피부 가장자리를 잡고, ceros 막에서 복벽을 들어 올립니다.

네 번째 서혜부 기억샘을 노출시키기 위해, 네 번째 기억샘을 확인합니다. 다섯 번째 기억샘을 확인하고, 유두 결절과 해당 결절로 이어지는 두 개의 동맥을 소작합니다. 네 번째와 다섯 번째 샘을 분리한 후, 다섯 번째 샘의 가장자리를 소작합니다.

다음으로, 가위를 사용하여 림프절 바로 복측의 지방 패드를 가로질러 절단하여 네 번째 기억샘의 지방 패드를 분리합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 지방 패드의 복측 부분을 단단히 잡고 체벽에서 떼어냅니다. 절제된 조직을 라벨이 부착된 두 개의 슬라이드 사이에 넣어 한 덩어리로 누른 뒤, 카노이즈(Carnoy's) 고정액에 고정하는 것이 좋습니다.

이후 조직을 염색하고 마운팅하여 투명화된 마진(cleared margins)을 평가할 수 있습니다. 포셉을 사용하여 지방 패드의 제거된 부위 주변 영역에서 기억샘(memory gland)의 모든 흔적을 제거합니다. 이제 동물은 조직 또는 세포 이식 준비가 완료되었습니다.

신선하거나 급속 냉동된 공여자 상피 조직을 제거된 지방 패드에 이식할 수 있습니다. 또는 불멸화된 기억 상피 세포주, 기억 종양 세포주 또는 일차 세포를 이식할 수 있습니다. 세포 준비에 대한 자세한 내용은 상피 조각 이식을 위해 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오.

이 영상은 상피세포가 담긴 cryo vial을 해동하고 파편들을 신선한 배지가 담긴 페트리 접시에 옮기는 것으로 시작합니다. 가위를 사용하여 수혜 마우스의 지방 패드 상피의 투명해진 부위에 포켓을 만들어 DMSO를 희석합니다. 그런 다음 니들 포셉을 사용하여 1 mm 크기의 공여 상피 조각을 해당 포켓에 배치합니다.

필요한 경우, 조직 포셉으로 포켓을 닫은 채 유지하고 니들 포셉을 제거하여 조직이 제자리에 머물게 합니다. 피부의 대립하는 가장자리를 잡습니다. 포셉을 사용하여 이들을 함께 고정합니다.

복측 체강의 장막에서 이를 들어 올린 후 상처 클립으로 폐쇄합니다. 정중시상 절개 부위는 클립 2개로, 각 사선 절개 부위는 클립 1개로 폐쇄합니다. 필요한 경우 요도가 폐쇄되지 않도록 주의하십시오.

중앙 시상 절개선과 사선 절개선이 교차하는 지점의 피부 틈을 봉합사로 폐쇄합니다. 마우스를 케이지에 넣고 마우스가 회복될 때까지 가열 램프 아래에 둡니다. 상처 클립은 2주 후에 제거해야 합니다.

다음 슬라이드들은 급이 패드 제거 및 상피 이식 후 숙주 기억샘에서 관찰될 수 있는 대표적인 이미지들을 보여주며, 이 이미지는 3주령 생쥐에서 제거된 내인성 기억 상피를 보여줍니다. 샘 제거 과정에서 절단면의 투명한 경계 부분을 확인하십시오. 절단된 경계를 평가하기 위해 각 절차 후에 이와 같은 홀 마운트 표본을 준비해야 합니다.

이 이미지는 투명화 절차 7주 후 투명해진 마우스 지방 패드를 보여줍니다. 지방 패드 전체에 기억 상피, 헤마틴 및 아신이 없다는 점에 유의하십시오. 투명화 절차 7주 후 투명해진 지방 패드의 염색 결과 또한 샘에 기억 상피가 없음을 보여줍니다.

10주령 생쥐의 공여체 기억 상피가 이식된 투명화 지방 패드의 대표적인 전체 마운트 이미지가 제시되어 있습니다. 이식된 상피가 정상적인 상피 도관 트리, 헤마틴 및 소엽을 형성했음에 유의하십시오. 투명화된 지방 패드와 기억 상피의 염색 결과입니다.

동일 연령에서의 상피 이식 결과, 외성 상피로부터 상피관이 정상적으로 생성됨을 확인할 수 있습니다. 여기에서는 투명화된 지방패드를 hematoxylin 및 eosin으로 염색하여, 기억 종양으로 발전한 상피 이식편을 보여줍니다. 지금까지 유선 상피를 채취하고 유선 상피 이식을 수행하는 방법을 설명드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, 결절과 유두를 소작하기 위해 네 번째와 다섯 번째 유선 사이의 연결 부위를 절단하고, 내인성 상피 조직의 모든 흔적을 제거하는 것이 중요합니다. 제거된 지방 패드 내로 내인성 상피가 성장할 가능성이 없도록 해야 합니다. 또한, 절제 마진이 충분히 확보되었는지 확인하기 위해 제거된 유선 부위 전체를 수집하는 것이 권장됩니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.