Name: 마우스 Oocytes의 검색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 Peromyscus 암컷에서 난자와 초기 배아를 분리하는 생식생물학 기법을. FHM 배지 주입과 해부학적 구조 식별을 통해 유전자 발현 및 형질전환 연구에 활용할 수 있습니다.

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나는 그의 도움 인내와 지식에 대한 Peromyscus 유전자 증권 센터에서 마이크 듀이 감사하고 싶습니다.

배아 / Oocyte 검색 <ol><li> 이전 배아 / oocytes의 검색에 적어도 두 시간은, KSOM가 37 º C CO 2 배양기와 FHM에 배치됩니다는 -20 °에서 해동의해야합니다. 세 오목한 얕은 우물을 포함하는 유리 그릇은 인큐베이터에 KSOM의 집 방울하는 데 사용됩니다. 탈수 방지하기 위해, KSOM와 접시는 바닥에 물이있는 lidded 컨테이너에 배치됩니다. 이 장치는 광유를 사용하지 않고 증발을 방지합니다. </li><li> 앤 여성에서 oviducts는 FHM 미디어에 배치됩니다. 오리 엔테이션 및 손상 infindibulum을 보장하기 위해, 난소의 작은 섹션은 자궁의 수란관 작은 섹션과 함께 절단됩니다. 뭉툭한 30 게이지 바늘이 infindibulum에 무딘 바늘을 삽입하여 수란관에서 배아 / oocytes을 추방하는 데 사용됩니다. 수란관 튜브 통과하기 위해 바늘에 비해 너무 작습니다 때문에 infindibulum는 배아를 검색하는 데 사용해야합니다. infindibulum이 파괴되는 경우, 수란관이 중 오픈 슬라이스 또는 배아 압박이 있어야합니다. </li><li> 배아 / oocytes는 페트리 접시의 바닥으로 가라앉아있는 기름 방울에 현미경을 집중하여 FHM 미디어에서 찾을 수 있습니다. 이것은 높은 배율보다 큰 가시 영역을 제공하는 등 배아 / oocyte 격리는 20x에서 달성될 수있다. 배아 / oocytes는 주위 명확한 반지를 가지고있는 원형 지방 방울 같아. 모세관 뽑아 유리를 사용하여 입으로 pipetting은, 부화 및 추가 조작에 대한 KSOM에 배아 / oocytes를 이동하는 데 사용됩니다. </li></ol> Oocyte 정보 검색을위한 절차 준비 <ol><li> FHM를 해동하고 kSOM을 준비합니다. </li><li> 몇 시간 전에, 아래의 물과 팁 상자, CO 2 배양기에서 장소에 달걀 검색 컨테이너와 장소에서 적절한 kSOM. </li><li> 연구실에 새장을 지참하고 수확 여성을 죽일. </li><li> 당신이 수란관의 일부를 잘라하지 않도록하기 위해 난소의 일부와 자궁의 일부를 잘라주의되는 수란관을 잘라 버릴거야. </li><li> 작은 배양 접시에있는 FHM 미디어에 놓습니다. </li><li> 플러싱에 사용되는 몇 가지 더 FHM 미디어 페트리 요리를 붓고. </li></ol> 홍조 <ol><li> 나선형 엔드와 1ml 바늘에 연결된 플러싱 바늘 (30 게이지 퉁명스러운)를 사용합니다. </li><li> 난소의 부분 첨부된 왼쪽 근처에서 발견 infundibulum에 삽입 시간과 바늘을 사용하여 하나의 수란관을 가져가라. infundibulum이 파괴되고 사용할 수 없다면, 그럼 두 포셉을 가지고 수란관의 한쪽 끝을 잡고. 다른 forcep으로 부드럽게 모든 배아의를 꺼내, 치약 튜브처럼, 짠다. 참고 : 조직의 많은 그것 같이되므로이, 페트리 접시에 엉망이 다량을 생성하므로 나중에 다른 페트리 접시를 사용할 수 있습니다. </li><li> , 배아를 참조 지방 조각에 현미경을 집중하고 주변 클리어 서클과 원형 &quot;지방 조각 &#39;을 찾기 위해. 참고 : 배아는 지방과 같은 모양을 가지고 있으므로 그것이 찾기 힘들 수 있습니다. 태아가 아래로 침몰, 그래서 거기에 봐요. </li><li> 받는 여성의 질 얼룩을 마십시오. 이 단계에서, 그들은 pseudopregnant해야합니다. </li></ol>

이 문서에서는, 우리는 배란 유도 (superovulated) Peromyscus에서 oocytes의 검색을 보여줍니다. superovulation의 사용은 (천연 estrous 사이클 반대) 때문에 훨씬 더 결과 숫자로 일반적입니다. 그러나,주의는 배란과 culturing를 유도하는 데 사용되는 호르몬이 모두 영향을 수 있으므로, 이러한 oocytes / 배아를 이용 결과를 해석에 촬영해야합니다. estrous이 확정되면, 암컷은 euthenized와 oviducts는 난소의 일부와 함께 회복되었습니다. 난소의 작은 지역은 infindibulum의 위치를​​ 표지로 사용됩니다. infindibulum은 종종 시간은 조직의 얇은 계층을 통해 돌출, 난소 옆에 앉아있다. 이 조직의 다른 측면에서 수란관의 나머지 코일되고 결국 질로 연결됩니다. oocytes를 추출 infindibulum를 통해 유체를 밀어하는 것이 좋습니다. 이 방향으로 인해 질 - 수란관 인터페이스에있는 편도 밸브가 필요합니다. 그들은 밸브를 통해 거꾸로 예상하는 경우 oocytes...

<table><tbody><tr><td>플러싱 니들</td><td>도구</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G blunt</td></tr><tr><td>포셉 (2)</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>동물</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>FHM HEPES 완충 배지</td><td>시약</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>KSOM 배아 배양 배지 (5x 10 mL)</td><td>시약</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>마우스 피펫</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>유리 모세관을 가늘게 늘려 고무 튜브에 연결함</td></tr><tr><td>난자 홀딩 디쉬</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>오목한 홈이 있는 유리 용기</td></tr></tbody></table>

마우스 oocytes의 검색

Retrieval of Mouse Oocytes

지금까지 단 몇 연구 Peromyscus embryogenesis 또는 생식 생물학의 성공적인 조작을보고있다. 함께 Peromyscus 유전 증권 센터 (http://stkctr.biol.sc.edu)로, 우리는이 시스템을 개발하는 데 필요한 돌출 차이를 특성화하고 있습니다. 기본 목표는 oocyte / 초기 배아 검색을 최적화되었습니다.

이 프로토콜은 생쥐의 수란관에서 추출 oocytes 또는 초기 단계 수정된 배아에 대한 기법을 보여줍니다. infindibulum를 식별하고 그것에 뭉툭한 끝을 바늘을 삽입하는 기능은 제대로 절차를 수행하는 것이 필수적입니다.

마우스 Oocytes의 검색

현재까지 Peromyscus의 배아 발생 또는 생식 생물학의 성공적인 조작을 보고한 연구는 극소수에 불과합니다. Peromyscus ...와 더불어

제 이름은 Amanda dli입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 Paul Verana 박사님 연구실 소속입니다. 오늘은 난자 채취 절차를 보여드리겠습니다.이는 암컷으로부터 수란관을 분리하는 과정을 포함합니다. 수란관이 분리되면, 수란관을 통해 FHM 배지를 주입하며, 그러면 자궁에서 난모세포가 배출됩니다. 이 과정이 완료되면 배지 내의 난모세포를 분리하여 향후 실험에 사용합니다.이 절차는 세포를 분리하는 것 외에도 특정 시점의 배아를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 비디오 형식으로 확인해야 하는 이유 중 하나는 수란관의 각 부위를 인식하기가 매우 어렵기 때문입니다. 본 비디오에서는 FHM 배지를 주입하게 될 깔때기(infundibulum) 부분을 짚어드리겠습니다.사용할 해부 도구는 날카로운 핀셋 두 세트와 날카로운 가위 한 쌍입니다. 암컷으로부터 적출한 난관은 35 millimeter 조직 배양 접시에 담긴 FHM 배지에 넣습니다. 1 milliliter 주사기에 연결된 30 millimeter 둔단 바늘을 사용하여 알을 회수하며, uc는 날카로운 핀셋으로 고정합니다.FHM은 세포를 수집하는 데 사용되는 유지 배지입니다. KSOM은 수정이 된 경우 인큐베이터 내에서 세포를 성장시키기 위해 사용하는 배지입니다. 수란관에서 난자와 배아를 회수한 후, 모세관으로 제작한 유리 전이 피펫에 튜브를 연결하여 유지 배지 속으로 입 피펫팅하여 옮깁니다.배아와 난자를 보관하기 위해 유리 오목 접시를 사용합니다. 각 오목한 원 안에 배아와 난자를 배치하면 각각 분리된 위치에 놓이게 되어 찾기가 더 쉬워집니다. 이 접시를 용기에 넣으면 오일을 사용하지 않고도 CO2 인큐베이터에 넣을 수 있습니다.사용하는 배지에 따라 FHM 배지 또는 KSOM 위에 물을 바닥에 채우고, 탭을 닫아 액체가 유지되도록 합니다. 털이 섞여 들어가지 않도록 70% ethanol을 사용합니다. 복부 영역에 작은 절개를 가한 후 복강 내로 절개합니다.복부 영역을 노출시키기 위해 절개 부위를 확장하겠습니다. 자궁이 노출될 때까지 이 과정을 진행한 후, 장을 옆으로 치우면 아래쪽에 자궁이 보입니다. 자궁은 Y자 형태이며, 자궁의 일부를 조심스럽게 떼어냅니다.절단했을 때 수란관은 스파게티와 같은 모양을 띱니다. 수란관의 일부를 채취하도록 하겠습니다. 지방에 둘러싸인 수란관과 난소의 일부를 채취하겠습니다.다른 쪽도 동일하게 진행하겠습니다. 이제 다시 난소나 자궁을 들어 올립니다. 여기서 자궁을 들어 올리고 부착 지점 아래를 절개합니다. 이 시점에서 수관(vid ducts)을 확인할 수 있습니다.OV 난소의 일부를 함께 떼어내겠습니다. 이것은 이후에 배지에 놓이게 됩니다. 자궁은 여전히 수축하고 있습니다.자궁은 평활근으로 구성되어 있어, 신체에서 분리된 후에도 뉴런은 여전히 활성화 상태입니다. 여기 자궁이 나타나 있습니다. 난관은 스파게티처럼 보이고 난소가 그 위에 위치하지만, 실제로 난관이 난소에 부착되어 있는 것은 아닙니다.현재까지는 난소의 일부만 보여드렸지만, 저는 30 gauge 둔단 바늘을 잡고 있는 오른손을 주로 사용합니다. 저는 이 바늘을 핀셋처럼 사용하여 수란관을 분리합니다. 분리가 완료되면 수란관에 둔단 바늘을 찌르고 액체를 주입하며, 이 액체는 자궁 밖으로 흘러나오게 됩니다.왼손으로 날카로운 포셉을 잡습니다. 이것은 비골(fibula)을 분리하고 모든 것을 제자리에 고정하는 데 사용됩니다. 여기서 분리된 암둘라(am dula)는 트럼펫 모양입니다.바늘 끝이 조직층을 통과하여 비골에 위치해 있습니다. 좋습니다. 모든 배아와 난자를 분리했는지 확인하기 위해, 자궁을 치약 튜브처럼 짜주는 방식을 선호합니다. 지방 패드에 집중하면 완벽하게 대칭인 지방 방울처럼 보이는 것을 찾을 수 있습니다.지금 바로 저 길고 굵은 부분 왼쪽에 하나가 있습니다. 그것이 단일 알 하나입니다. 이제 마우스 피펫으로 알을 집어 올려, 알들만 분리할 수 있도록 추가 보관 배지에 넣겠습니다.오늘은 암컷 생식관에서 세포를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 또한, 수관의 다양한 구조에 대해서도 설명해 드렸습니다. 특히, FHM 배지를 주입할 수 있는 유일한 구조인 깔때기 끝(infundibulum)에 대해 살펴보았습니다.30게이지 바늘을 사용합니다. 이 기술을 통해 암컷 생식관에 존재하는 난모세포와 배아를 분리했습니다. 이를 유전자 발현 연구나 형질전환 연구에 사용할 수 있습니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

이 비디오는 갓 채취한 쥐 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 전방 난모세포는 추가 특성화 및 발달 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 전방 난모세포 분리: 갓 수확한 마우스 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

근적외선 펨토초 레이저를 사용하여 중기 I 동안 마우스 난 모세포에서 세포질 미세 소관 조직 중심의 고갈을 가능하게하는 최적화 된 프로토콜이 제시됩니다.

마우스 난모세포에서 세포질 미세소관 조직 센터의 다광자 레이저 제거

염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

이 프로토콜은 마우스 난자의 시험관 내 성숙, 시험관 수정, 그리고 배아를 배반포 단계까지 배아 배양하는 절차를 설명합니다.

생쥐 난자 내 시험관 성숙, 수정 및 착상 전 배아의 배양

이 영화와 프로토콜은 핵 이전을 학습 수 있도록 도와 드리기위한 것입니다.

마우스 Oocytes에 핵 전송

배우세요 Peromyscus 암컷에서 난자와 초기 배아를 분리하는 생식생물학 기법을. FHM 배지 주입과 해부학적 구조 식별을 통해 유전자 발현 및 형질전환 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스 Oocytes의 검색

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