마우스 Oocytes의 검색

제 이름은 Amanda dli입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 Paul Verana 박사님 연구실 소속입니다. 오늘은 난자 채취 절차를 보여드리겠습니다.

이는 암컷으로부터 수란관을 분리하는 과정을 포함합니다. 수란관이 분리되면, 수란관을 통해 FHM 배지를 주입하며, 그러면 자궁에서 난모세포가 배출됩니다. 이 과정이 완료되면 배지 내의 난모세포를 분리하여 향후 실험에 사용합니다.

이 절차는 세포를 분리하는 것 외에도 특정 시점의 배아를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 비디오 형식으로 확인해야 하는 이유 중 하나는 수란관의 각 부위를 인식하기가 매우 어렵기 때문입니다. 본 비디오에서는 FHM 배지를 주입하게 될 깔때기(infundibulum) 부분을 짚어드리겠습니다.

사용할 해부 도구는 날카로운 핀셋 두 세트와 날카로운 가위 한 쌍입니다. 암컷으로부터 적출한 난관은 35 millimeter 조직 배양 접시에 담긴 FHM 배지에 넣습니다. 1 milliliter 주사기에 연결된 30 millimeter 둔단 바늘을 사용하여 알을 회수하며, uc는 날카로운 핀셋으로 고정합니다.

FHM은 세포를 수집하는 데 사용되는 유지 배지입니다. KSOM은 수정이 된 경우 인큐베이터 내에서 세포를 성장시키기 위해 사용하는 배지입니다. 수란관에서 난자와 배아를 회수한 후, 모세관으로 제작한 유리 전이 피펫에 튜브를 연결하여 유지 배지 속으로 입 피펫팅하여 옮깁니다.

배아와 난자를 보관하기 위해 유리 오목 접시를 사용합니다. 각 오목한 원 안에 배아와 난자를 배치하면 각각 분리된 위치에 놓이게 되어 찾기가 더 쉬워집니다. 이 접시를 용기에 넣으면 오일을 사용하지 않고도 CO2 인큐베이터에 넣을 수 있습니다.

사용하는 배지에 따라 FHM 배지 또는 KSOM 위에 물을 바닥에 채우고, 탭을 닫아 액체가 유지되도록 합니다. 털이 섞여 들어가지 않도록 70% ethanol을 사용합니다. 복부 영역에 작은 절개를 가한 후 복강 내로 절개합니다.

복부 영역을 노출시키기 위해 절개 부위를 확장하겠습니다. 자궁이 노출될 때까지 이 과정을 진행한 후, 장을 옆으로 치우면 아래쪽에 자궁이 보입니다. 자궁은 Y자 형태이며, 자궁의 일부를 조심스럽게 떼어냅니다.

절단했을 때 수란관은 스파게티와 같은 모양을 띱니다. 수란관의 일부를 채취하도록 하겠습니다. 지방에 둘러싸인 수란관과 난소의 일부를 채취하겠습니다.

다른 쪽도 동일하게 진행하겠습니다. 이제 다시 난소나 자궁을 들어 올립니다. 여기서 자궁을 들어 올리고 부착 지점 아래를 절개합니다. 이 시점에서 수관(vid ducts)을 확인할 수 있습니다.

OV 난소의 일부를 함께 떼어내겠습니다. 이것은 이후에 배지에 놓이게 됩니다. 자궁은 여전히 수축하고 있습니다.

자궁은 평활근으로 구성되어 있어, 신체에서 분리된 후에도 뉴런은 여전히 활성화 상태입니다. 여기 자궁이 나타나 있습니다. 난관은 스파게티처럼 보이고 난소가 그 위에 위치하지만, 실제로 난관이 난소에 부착되어 있는 것은 아닙니다.

현재까지는 난소의 일부만 보여드렸지만, 저는 30 gauge 둔단 바늘을 잡고 있는 오른손을 주로 사용합니다. 저는 이 바늘을 핀셋처럼 사용하여 수란관을 분리합니다. 분리가 완료되면 수란관에 둔단 바늘을 찌르고 액체를 주입하며, 이 액체는 자궁 밖으로 흘러나오게 됩니다.

왼손으로 날카로운 포셉을 잡습니다. 이것은 비골(fibula)을 분리하고 모든 것을 제자리에 고정하는 데 사용됩니다. 여기서 분리된 암둘라(am dula)는 트럼펫 모양입니다.

바늘 끝이 조직층을 통과하여 비골에 위치해 있습니다. 좋습니다. 모든 배아와 난자를 분리했는지 확인하기 위해, 자궁을 치약 튜브처럼 짜주는 방식을 선호합니다. 지방 패드에 집중하면 완벽하게 대칭인 지방 방울처럼 보이는 것을 찾을 수 있습니다.

지금 바로 저 길고 굵은 부분 왼쪽에 하나가 있습니다. 그것이 단일 알 하나입니다. 이제 마우스 피펫으로 알을 집어 올려, 알들만 분리할 수 있도록 추가 보관 배지에 넣겠습니다.

오늘은 암컷 생식관에서 세포를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 또한, 수관의 다양한 구조에 대해서도 설명해 드렸습니다. 특히, FHM 배지를 주입할 수 있는 유일한 구조인 깔때기 끝(infundibulum)에 대해 살펴보았습니다.

30게이지 바늘을 사용합니다. 이 기술을 통해 암컷 생식관에 존재하는 난모세포와 배아를 분리했습니다. 이를 유전자 발현 연구나 형질전환 연구에 사용할 수 있습니다.