에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

후각 상피의 제제는 접시에 장착되고 가습 된 공기의 흐름에 놓입니다. 해부 현미경 하에서, 기준 전극은 완충 용액을 통해 조직에 전기적으로 연결됩니다. 기록 전극은 후각 상피의 표면에 배치됩니다.

후각 상피는 가습된 공기의 흐름으로 투여되는 컴퓨터 제어 냄새 첨가물에 의해 자극되며, 이 흡입 물질은 냄새 물질을 후각 상피로 운반합니다. EOG 신호는 증폭기와 디지타이저를 통해 녹음 컴퓨터로 전송됩니다. 안녕하세요, 저는 존스 홉킨스 대학교 생물학과 위생 연구소의 캐서린 시아르(Catherine Cear)입니다.

오늘은 마우스의 전기 olf 사실 그램을 기록하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 냄새에 대한 후각 감각 뉴런의 반응을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 시작하겠습니다.

기록 장치는 기록 전극, 기준 전극, 공기 전달 튜브, 표본 스테이지 및 해부 현미경으로 구성되며, 모두 패러데이 케이지 내의 공기 테이블에 고정됩니다. Microm 매니퓰레이터는 공기 전달 튜브에 전극을 배치하는 데 사용됩니다. 공기 전달 튜브를 통과하여 표본 위를 통과하기 전에 증류수를 통해 지속적인 기류를 형성하여 습도를 추가합니다.

6-8mm의 사드로 채워진 60mm 배양 접시가 표본의 장착 표면으로 사용됩니다. 우물과 채널은 장착 접시의 가드에서 비어 있습니다. 변형된 링거 용액을 통해 기준 전극을 시편에 전기적으로 연결하는 수단을 제공합니다.

기록 및 기준 전극은 증폭기에 연결됩니다. 증폭기의 신호는 디지타이저로 전송된 다음 컴퓨터로 전송됩니다. XI 그래프 소프트웨어는 자극 프로토콜을 제어하고 신호를 기록하며 응답을 분석하는 데 사용됩니다.

오실로스코프는 기록 전극을 배치하는 동안 전위를 실시간으로 모니터링하기 위해 증폭기 뒤에 연결됩니다. 그리고 EOG 녹음 중에. 냄새 자극의 전달은 피코 스프릿처(pico spritzer)에 의해 제어되며, 피코 스프릿처는 냄새 자극을 전달하기 직전에 신호 수집에 사용되는 것과 동일한 컴퓨터에 연결됩니다.

피코 슈프리처 출력은 액체 취취제가 들어 있는 부취제 병에 연결됩니다. 그런 다음 병을 공기 전달 튜브에 연결합니다. 이제 실험을 기록하기 위해 전극을 준비하는 방법을 살펴 보겠습니다.

기록 전극은 변형된 링거 용액으로 채워진 뽑힌 유리 모세관의 염화은 와이어입니다. 기준 전극은 염화물 은선입니다. 전극 홀더에 은선을 설치하여 두 전극의 준비를 시작합니다.

기록 전극의 경우 전극 홀더 끝에서 1-2cm의 와이어가 돌출되어야 합니다. 기준 전극에 더 많은 와이어를 남길 수 있습니다. 염화은 코팅을 추가하려면 와이어를 0.1 몰 염화나트륨에 배치하고 전극 홀더를 1.5-9볼트 DC 전원의 양극 단자에 연결합니다.

전원의 음극 단자는 0.1 몰 염화나트륨 용액에 전기적으로 연결되어야 합니다. 반응 중인 염화물이 10분 동안 진행되어 기록과 기준 전극 사이의 정전하를 균등화하도록 합니다. 기록 장치에 전극을 설치하기 전에 전극을 함께 짧게 만지십시오.

다음으로, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당깁니다. 모세관 끝의 개구부는 직경이 약 5-10미크론이어야 합니다. 다이아몬드 연필을 사용하여 모세혈관의 뭉툭한 끝을 긁고 부러뜨려 은선보다 약 2cm 더 길도록 합니다.

부탄 토치를 사용하여 절단 끝을 화재 광택을 내고 이제 수정 된 링거 용액에서 0.5 % 아그로스를 녹입니다. 전사 피펫을 사용하여 가열하고 길고 얇은 끝부분을 갖도록 당긴 주사기를 사용하여 소량의 용융 농 용액을 전극 끝으로 당깁니다. 당겨진 모세관을 절반 정도 채웁니다.

변형된 링거 용액을 사용하여 모세관을 부드럽게 두드려 기포를 제거합니다. 채워진 전극을 사용할 준비가 될 때까지 바닥에 소량의 변형된 링거 용액과 함께 보관 용기에 보관하십시오. 조직 샘플이 준비되고 기록할 준비가 되면 전극이 준비된 상태에서 기록 전극 와이어 위에 채워진 모세관을 설치합니다.

기록을 위한 조직 준비를 시작하기 위한 기록 실험을 살펴보겠습니다. 희생된 쥐의 두개골 위에 있는 피부를 제거하고 정중선을 따라 머리를 아군으로 이등분하고 머리의 절반을 장착 접시에 내측이 위로 향하게 합니다. 비갑개를 노출시키기 위해 중격을 조심스럽게 제거합니다.

티슈가 장착된 접시를 녹음 스테이지에 놓습니다. 비갑개의 녹음 위치가 현미경 아래 중앙에 오도록 스테이지를 정렬합니다. 이제 공기 탱크를 켜서 분당 약 600밀리리터의 가습된 공기를 비갑개 표면에 전달합니다.

기록 위치에서 약 10mm 떨어진 곳에 공기 전달 튜브를 배치합니다. 설정 ampAC 앰프로 DC 모드로 liifier amplification은 EOG 신호에 아티팩트를 유도합니다. 1kW의 저역 통과 필터와 100배의 게인으로 획득합니다.

이제 마이크로 매니퓰레이터에 기록 및 기준 전극을 장착합니다. 기준 전극을 장착 접시의 웰로 내리고 조직에 전기적으로 연결되도록 수정된 링거 용액으로 덮습니다. 기록 전극을 비갑개 2 B 또는 3 표면으로 조심스럽게 내립니다.

전극은 후각 상피 표면에 거의 닿지 않아야 합니다. 전극이 상피와 접촉하면 오실로스코프에 직선 기준선이 나타납니다. 이제 컴퓨터의 공기 전달 튜브에 있는 측면 포트에 냄새 나는 병을 부착합니다.

자극 프로토콜을 시작합니다. 데이터 수집을 위한 샘플링 속도는 2킬로헤르츠 이상이어야 합니다. 소프트웨어가 냄새 펄스를 트리거하고 녹음을 시작합니다.

일반적인 자극 프로토콜은 100밀리초 지속시간, 단일 펄스 쌍, 1초 간격으로 분리된 100밀리초 펄스 또는 10초 지속 펄스일 수 있습니다. 적응을 최소화하려면 높은 냄새 농도를 전달한 후 프로토콜 사이에 1분에서 5분 정도 두십시오. 튜브에 잔류 냄새가 남아있을 수 있으며 95 % 에탄올로 에어 튜브를 세척하고 건조시킨 후 추가 조직 샘플을 계속하십시오.

Axo graft 소프트웨어는 EOG 신호의 주요 매개변수를 측정하기 위한 도구를 제공합니다. 이러한 매개 변수에는 응답 진폭, 대기 시간, 피크까지의 시간 및 종료의 시간 상수가 포함됩니다. EOG의 여러 매개변수는 응답 진폭, 대기 시간 상승 시간, 피크까지의 시간 및 종료 시간 상수를 포함하여 마우스 간의 정규화된 응답을 비교하는 데 특히 유용합니다.

여기에 표시된 것은 액체 아밀 아세테이트의 농도가 증가함에 따라 자극에 반응하는 마우스의 OG입니다. 상단의 검은색 선은 냄새 자극의 시기와 지속 시간을 나타냅니다. 여기서 우리는 5개의 마우스 오차 막대에서 평균화된 용량 반응 관계가 95% 신뢰 구간임을 알 수 있습니다.

피크 진폭의 감소는 종종 매우 높은 악취 농도에서 관찰됩니다. 쌍을 이룬 펄스 자극에 대한 반응으로 EOG의 한 예가 나타나 있는데, 이는 몇 초 동안 지속되는 적응을 유도하는 냄새 물질의 단일 짧은 펄스입니다. 여기에 표시된 것은 10초 동안 지속적인 냄새 자극에 대한 반응으로 나타나는 EOG입니다.

EOG는 지속적인 냄새 물질이 나타나는 동안 둔감화를 보여줍니다. 방금 마우스의 전극 계수 그램을 기록하는 방법을 보여 드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 전극을 상피 표면 바로 위에 놓고 표면 아래의 전극을 관통하지 않도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

항상 머리의 같은 쪽에서 기록하고 변동을 최소화하기 위해 설정 수정을 피하고 조직을 습하게 유지하되 액체 방울을 모으지 않고 해부 직후 조직을 가습된 공기 아래에 두면 조직을 기록하기에 최상의 상태로 유지할 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.