Name: 에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-02T17:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 배우세요 전자후각도(EOG) 기록 기법을 사용하여 마우스 후각 상피에서 후각 감각 뉴런의 전기적 반응을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 신경과학 연구자들이 실시간으로 후각 기능을 평가하는 데 활용할 수 있습니다.

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우리는 박사 Yijun 노래, 그리고 생물의학과, 조언과 도움을 존스 홉킨스 대학의 Hattar Kuruvilla 조의 트라이 - 연구실 구성원 감사합니다. NIH 교부금 DC007395 DC009946 및 지원.

1 부. EOG 녹음 설정 레코딩 장치는 기록 전극, 기준 전극, 공기 공급 튜브, 표본의 무대, 그리고 해부 현미경, 모든 패러데이 케이지 내에서 공기 테이블에 정박로 구성되어 있습니다. Micromanipulators는 전극의 배치 및 공기 공급 튜브에 사용됩니다. 지속적인 공기 흐름은 공기 배달 튜브를 통하여 및 표본을 통해 전달하기 전에 습도를 추가하는 증류수로 부풀어 오른 모양이다. 6-8밀리미터의 깊이 Sylgard 가득 60mm 문화 요리는 표본에 대한 마운트 표면으로 사용됩니다. 잘하고 채널은 전기적 수정 링어의 솔루션을 통해 표본에 대한 참조 전극을 연결하는 수단을 제공하기 위해 장착 접시에 Sylgard 밖으로 빈입니다. 기록 전극과 참조 전극은 앰프에 연결됩니다. 앰프의 신호는 컴퓨터에 다음 디지타이저로 전송하고 있습니다. 이러한 Axograph 또는 pClamp 같은 소프트웨어는 신호를 기록하고, 응답의 후속 분석을, 자극 프로토콜을 제어하는​​ 데 사용할 수 있습니다. 앰프 뒤에 연결된 오실로 스코프 기록 전극을 배치하면서 전기 잠재력을 실시간 모니터링과 EOG 녹음하는 동안 편리하게하실 수 있습니다. odorant의 자극의 전달은 신호 수집에 사용되는 같은 컴퓨터에 연결된 Picospritzer에 의해 제어됩니다. Picospritzer에있는 공기 압력은 10 PSI로 설정됩니다. 하나의 공기 탱크와 레귤레이터는 공기 테이블과 Picospritzer 모두에 공기를 공급하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 공기 탱크와 레귤레이터는이 낮은 압력과 공기의 큰 금액을 필요로 humidified 공기 흐름을 위해 공기를 제공하는 데 사용됩니다. 직전 odorant의 자극을 제공하기 위해 Picospritzer 출력은 odorant 병에 연결됩니다. odorant 병은 다음 공기 공급 튜브에 연결되어 있습니다. 2 부 : 준비 전극 기록 전극은 모세가 수정 링어의 솔루션 (135 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM CaCl 2, 1.5 MM MgCl 2, 10 MM HEPES, 필터는 살균 산도 7.4)로 가득 가져온 유리에 chlorided 실버 와이어입니다. 참조 전극은 chlorided 은색 와이어입니다. <ol><li> 전극 홀더에 은색 와이어를 설치합니다. 기록 전극의 경우, 와이어 1~2센티미터은 전극 홀더의 끝 부분에서 내다해야합니다. 더 선은 참조 전극에 대해 남아있을 수 있습니다. </li><li> 실버 와이어에 AgCl 겉옷을 추가하려면, 0.1 M NaCl에서 와이어를 위치와 1.5-9 V DC 전원 소스의 긍정적인 단자에 전극 홀더를 연결합니다. 전원의 단자는 전기 0.1 M NaCl 용액에 연결되어 있어야합니다. 10 분 동안 진행 chloriding 반응을 허용합니다. 녹음 및 참조 전극 사이에 정전기를 맞춰야하기 위해 짧게 녹음 장치에 설치하기 전에 함께 전극을 만지지. </li><li> 유리 micropipette의 풀러를 사용하여 모세관 당겨. 모세관의 끝에 개통은 직경 50-10 미크론 주위해야합니다. </li><li> 그것은 은색 와이어보다 ~ 2cm 이상 때​​문에 모세관의 뭉툭한 끝을 점수와 끊다에 다이아몬드 연필을 사용합니다. 화재 - 폴란드어 부탄 토치로 잘라 끝을. </li><li> 수정 링어의 용액에 0.5 % 아가로 오스를 용융. 전송 피펫을 사용하여 전극의 끝부분에 용융 아가로 오스 솔루션의 작은 금액을 당기세요. </li><li> 수정 링어의 솔루션 (이 목적을 위해 유용 온수와 긴 얇은 끝을을 가지고 뽑아왔다 주사기)를하는 방법 1 / 2에 대한 뽑아 모세를 입력합니다. 부드럽게하는 기포를 이동시키다하는 모세관이 끄적. 그들이 사용할 준비가 될 때까지 아래에 수정된 링어의 솔루션의 소량으로 저장 병에 가득 전극을 저장합니다. 조직 샘플 준비 및 녹음을위한 준비가되면, 기록 전극 와이어를 통해 채워진 모세관을 설치합니다. </li></ol> 3 부 : 준비 odorant 솔루션 odorants의 아밀 아세테이트와 heptaldehyde 큰 반응을 보여주고과 EOG 각성제 등 때문에 좋은 선택입니다. <ol><li> microcentrifuge 튜브에서 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 odorant의 dilutions 일련의 준비를합니다. 복용 - 반응 곡선의 시작점으로, 5 M 5-10 배 dilutions을 준비 × 10 -6 M. 매일 신선한 dilutions하십시오. </li><li> 또한 실리콘 stoppers과 이온스 병의 4.9 MLS의 물과 DMSO 100 μL 희석 주식을 혼합하여 물에 50 배 odorants를 희석. 솔루션은 적어도 30 분 동안 병에 평형하자. 각 병에 odorants의 증기 농도가 알 수없는 것을 참고, 그러나 액상에서 odorants의 농도의 함수로 달라질 수 있습니다. </li><li> p로 실리콘 마개를 통해이 18 게이지 바늘을 삽입rovide 입력 및 출력 포트. 병 사용하지 않을 때는 포트 연결해야합니다. </li></ol> 파트 4 : EOG와 분석 데이터를 기록 <ol><li> 잘린 다음 CO 2 안락사 또는 마취 과다 복용하여 마우스를 희생. 두개골을 overlying 피부를 제거하고 sagittally 정중선을 따라 머리를 두 갈래로 갈라지다. </li><li> 장착 접시에 머리 절반, 중간 측면을 탑재합니다. 조심스럽게 turbinates을 폭로하기 위해 심장을 제거합니다. </li><li> 녹화 무대에 탑재 조직과 접시를 놓습니다. turbinates의 기록 위치가 현미경 중심 있도록 무대를 맞춥니다. </li><li> turbinate 표면에 humidified 공기를 제공하기 위해 공기 탱크를 켭니다. 위치 공기 공급 튜브 있도록 그것이 약 10mm 떨어진 녹음 위치에서이다. 유속은 ~ 600 ML / 분입니다. </li><li> 로우 패스 1 kHz에서에서 필터와 100X에서 이득과 DC 모드 (AC 증폭은 EOG 신호의 유물을 유발합니다)에 앰프를 설정합니다. </li><li> micromanipulators에 마운트 녹화 및 참조 전극. </li><li> 장착 접시에 잘으로 참조 전극을 절감하고 그것이 전기 조직에 연결되어 그러한 수정 링어의 솔루션을 커버. </li><li> turbinate IIB 또는 III의 표면에 기록 전극을 신중하게 낮추십시오. 전극 겨우 후각 상피의 표면을 만지지해야합니다! 전극이 상피 접촉되면 (즉 전기 회로를 완료) 직선 기준은 오실로 스코프에 표시됩니다. </li><li> 공기 공급 튜브의 측면 포트에 odorant 병을 연결합니다. </li><li> 컴퓨터에서 자극 프로토콜을 시작합니다. 데이터 수집에 대한 샘플링 속도는 2 kHz에서 이상되어야합니다. 이 소프트웨어는 냄새 펄스를 트리거하고 녹음을 시작합니다. </li><li> 전형적인 자극 프로토콜 100 밀리초 펄스가 1 초 간격으로 구분하여 결합하여 100 밀리초 기간 단일 펄스, 또는 10 초 지속 펄스 수 있습니다. </li><li> 조직이 최소한 적응하므로 프로토콜 사이의 시간을 허용합니다. 한 분 아밀 아세테이트와 최대 10 -3 M에 heptaldehyde의 액체 농도에 충분이며 높은 농도에서 5 분 수 있습니다. 높은 악취 농도 (예 : 복용 - 반응 곡선의 끝에 등) 제공 후 잔여 냄새는 튜브에 남아있을 수 있습니다. 95 % 에탄올과 공기 튜브를 세척 및 추가 조직 샘플을 계속하기 전에 건조. </li><li> Axograph 소프트웨어는 EOG 신호의 주요 매개 변수를 측정하기위한 도구를 제공합니다. 이러한 매개 변수는 응답 진폭, 대기 시간, 최대 시간과 종료 시간 상수를 포함합니다. 그것은 디지털 자세한 분석을하기 전에 25 Hz에서에서 흔적을 필터링하는 것이 바람직하다 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 분석 EOG에 대한 매개 변수입니다. EOG의 일부 매개 변수는 응답 진폭, 대기 (자극이 시행하고 반응이 시작되었을 때 사이의 시간), 상승 시간 (시작 사이의 시간을 포함하여 생쥐 사이에 반응의 비교에 대해 특히 유용합니다 응답 및 피크), 최대 시간 (자극의 시작에서 응답의 피크에 시간), 그리고 종료 일정 시간 (τ, 하나의 지수 방정식에 대한 응답의 붕괴 단계를 피팅에 의해 결정 ). 이러한 지연 시간, 상승 시간 및 종료의 지속 시간 운동 매개 변수의 비교 들어, 이전에 분석하기 위해 응답의 최대 진폭을 정상화하는 것이 좋습니다. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 대표 다른 자극 프로토콜에 따라 신호를 EOG. 자극에 대한 응답으로 마우스 EOGs의 (A) 예가 아밀 아세테이트의 농도 증가와 함께. 패널의 상단에있는 검은색 라인은 odorant의 자극의 타이밍과 기간을 나타냅니다. 전설의 농도는 액체 용액의 농도입니다. (B) 선량 - 반응 관계 다섯 생쥐에서 평균. 오차 막대는 95 % 신뢰 간격입니다. 최대 진폭의 감소는 종종 매우 높은 악취 농도에서 관찰됩니다. (C) 이점 - 펄스 자극에 대한 응답으로 EOG의 예제. odorant의 하나의 짧은 펄스가 몇 초 동안 지속적인 적응을 elicits. (D) 10 초에 대한 응답으로 EOG의 예제는 odorant의 자극을 인정합니다. EOG는 지속 odorant 프레 젠 테이션 도중 desensitization을 보여줍니다.

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</ol>

생쥐는 존스 홉킨스 대학의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 방법으로 처리하고 euthanized되었다.

이 프로토콜에서 설명하는 설정으로, 후각 상피의 표면에 odorant의 자극은 정확한 odorant 농도 및 역학 알 수없는 경우에도, 야생 유형 및 돌연변이 생쥐 간의 비교있게 조직 준비 사이의 일관성을 것입니다. 여러 가지 요인, 특히 녹음 위치와 humidified 공기의 흐름 속도는 EOG 변화의 원인이됩니다. 케어는 변화를 최소화하기 위해 동일한 turbinate에 유사한 위치에서 레코드로 이동한다. 이것은 쉽게 일관 머리 같은 측면에서 녹음 및 현미경, 냄새 전달 관 및 조직 샘플 사이의 변경되지 않은 공기 테이블에 micromanipulators의 발자국을함으로써 얻을 수 있습니다. 조직의 과도한 건조를 방지하기 위해 절개 후뿐만 아니라, 조직 샘플은 즉시 humidified 공기 흐름에 배치해야합니다. 생쥐에 EOG 녹음도 7, 14, 15, 또는 머리는 그대로두고 turbinates 16, 17 위에 뚫고 작은 구멍에 전극을 삽입하여이 turbinates 준비 마우스 액체 살포 장치와 함께 진행하실 수 있습니다. EOG 녹음의 각 변화는 자신의 강점을 갖고 있습니다 :이 프로토콜에 설명된 조직 준비에 공기 위상 녹음 설정의 최소 금액을 요구하고 수행하는 가장 쉬운되며 액체 살포 장치를 사용하여 녹음 약리 시약의 사용을 촉진,하지만 많은 odorants의 소수성 특성은 악취 배달 복잡, 마지막으로, 머리가 그대로 남아있는 기록은 &#39;인공 도청&#39;실험에 사용할 수 전극 배치는 turbinates가 완전히 노출하는 경우보다 힘들지만.

<table><tbody><tr><td>공기 공급관</td><td>장비</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>T-피팅이 연결된 1mL 주사기 배럴을 대체제로 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>장비</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>장비</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 및 데이터 수집 소프트웨어</td><td>장비</td><td>Apple Macintosh 기반의 Axograph 4.9.2</td><td></td><td>Mac OS X 및 Windows용 Axograph의 업데이트 버전은 http://axographx.com/에서 이용 가능합니다.</td></tr><tr><td>부탄 토치</td><td>장비</td><td></td><td></td><td>A cr&amp;#232;me br&amp;#251;제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.&amp;#232;토치가 잘 작동합니다.</td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>장비</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>장비</td><td>사이언스코프(Scienscope)</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>장비</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>자기 고정 장치 (12 mm)</td><td>장비</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>장비</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>장비</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>장비</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>장비</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>장비</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시료 스테이지</td><td>장비</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>마운팅 디쉬를 높이기 위해 어떤 작은 고체 물체라도 사용할 수 있습니다. 모델링 클레이를 이용하여 디쉬를 고정하십시오.</td></tr><tr><td>18게이지 바늘</td><td>재료</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>2 온스 유리 병</td><td>재료</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>재료</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 마개 16D 사이즈</td><td>재료</td><td>화학 기구</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>은선</td><td>재료</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>재료</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>World Precision Instruments 제공</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>아밀 아세테이트</td><td>시약</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>염화 칼슘(CaCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>헵탈데히드</td><td>시약</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 6수화물 (MgCl2·6H2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6시간&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>시약</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>유량계</td><td>장비</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

에어 - 상 electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

동물은 음식 소스를 찾을 수 천적을 피하고, 짝짓기 및 기타 사회적 상호 작용에 대한 conspecifics을 식별하는 많은 중요한 행동에 대한 후각에 따라 달라집니다. electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 분석 후각 기능, 정보를 수행하기 쉽고, 안정 방법입니다. 개구리 1 오토슨하여 EOG의 1956 설명 이후, EOG 녹음은 도롱뇽, 토끼, 쥐, 마우스, 그리고 인간 (스캇과 스콧 - 존슨, 2002, 심판 2. 검토) 등 많은 척추 동물에 적용되었습니다. 생쥐에 유전자 조작의 최근 발전 노크 아웃의 후각 기능의 생리적 특성에 대한 EOG 녹음에 관심을 rekindled 및 마우스 기능을 노크합니다. EOG 녹음이 성공적으로 후각 신호 전달 구성 요소 3-8의 중심 역할을 설명하고, 최근에는 9-12 OSN 응답 특정 규제 메커니즘의 기여를 특성화하기 위해 적용되었습니다. Odorant 감지가 속눈썹에 흐름과 멤브레인 13 depolarizes 전류를 발생, 신호 전달의 캐스케이드는 이온 채널 개방에 이르게 OSNs의 속눈썹에있는 후각 상피의 표면에서 발생합니다. EOG 녹음이 분야 2 개인 반응 OSNs로 인한 잠재적인 변화의 변론으로 인한, odorant의 자극에 따라 후각 상피의 표면에 extracellularly 기록 부정적인 가능성이다. EOG의 진폭과 반응 속도론의 비교함으로써 유전자 변형 및 기타 실험 조작은 냄새에 OSN 응답을 기본 분자 신호에 영향을 미치는 방법에 대한 유용한 정보를 제공합니다. 여기 마우스 후각 turbinates의 준비에 공기 위상 EOG 녹음을 설명합니다. 간단히 마우스를 희생 후 후각 turbinates은 정중선을 따라 머리를 bisecting 그리고 심장을 제거하여 노출됩니다. turbinate 준비는 다음 녹음 설정에 배치하고, 기록 전극은 중간 turbinates 중 하나에있는 후각 상피의 표면에 배치됩니다. 참조 전극은 전기 버퍼 솔루션을 통해 조직에 연결되어 있습니다. humidified 공기의 지속적인 흐름은 그것이 촉촉한 유지하는 상피의 표면을 통해 날려입니다. odorant 솔루션의 수증기는 상피를 자극하는 humidified 공기의 흐름에 부풀 수 있습니다. 응답 기록하고 자세한 분석을 위해 디지털됩니다.

electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 후각 기능을 평가의 유익 - 실시 - 쉽고 안정적​​인 방법입니다. 이 프로토콜은 녹음 설정, 마우스 조직 준비, 데이터 수집, 그리고 기본적인 데이터 분석을 설명합니다.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

동물은 먹이원 찾기, 포식자 회피, 그리고 짝짓기를 위한 동종 개체 식별과 같은 많은 중요한 행동을 위해 후각에 의존하며...

후각 상피 표본을 디쉬에 고정하고 가습된 공기 흐름 속에 배치합니다. 해부 현미경 하에서, 완충 용액을 통해 참조 전극을 조직에 전기적으로 연결합니다. 기록 전극을 후각 상피 표면에 배치합니다.후각 상피는 가습된 공기 흐름 속에 투입되어 후각 상피로 전달되는, 컴퓨터로 제어되는 취기 펄스(odorant puffs)에 의해 자극됩니다. EOG 신호는 증폭기와 디지털 변환기를 거쳐 기록용 컴퓨터로 전송됩니다. 안녕하세요, 저는 존스 홉킨스 대학교 생물학과 Hygiene XO 연구실의 Catherine Ciar입니다.오늘은 마우스의 전기 후각도(electro-olfactogram)를 기록하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 후각 감각 뉴런의 냄새 반응을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.기록 장치는 기록 전극, 기준 전극, 공기 공급관, 시료 스테이지, 그리고 해부 현미경으로 구성되며, 이 모든 장치는 패러데이 케이지 내의 에어 테이블에 고정되어 있습니다. 공기 공급관 내에 전극을 배치하기 위해 마이크로 조작기를 사용합니다. 연속적인 공기 흐름을 증류수에 버블링하여 습도를 더한 후, 공기 공급관을 통해 시료 위로 통과시킵니다.6~8mm 두께의 파라핀으로 채워진 60mm 배양 접시를 시편의 고정 표면으로 사용합니다. 고정 접시의 파라핀 부분에 웰(well)과 채널을 파냅니다. 이는 수정된 링거액(ringer solution)을 통해 기준 전극을 시편에 전기적으로 연결하기 위한 수단을 제공하기 위함입니다.기록 전극과 기준 전극은 증폭기에 연결됩니다. 증폭기에서 나온 신호는 디지타이저를 거쳐 컴퓨터로 전송됩니다. 자극 프로토콜 제어, 신호 기록 및 반응 분석을 위해 XI graph 소프트웨어가 사용됩니다.기록 전극을 배치하는 동안과 EOG 기록 중에 전기 전위를 실시간으로 모니터링하기 위해 증폭기 뒤에 오실로스코프를 연결합니다. 향 자극의 제공은 피코 스프리처(pico spritzer)로 제어하며, 이는 향 자극을 제공하기 직전에 신호 획득에 사용되는 것과 동일한 컴퓨터에 연결됩니다.pico spritzer 출력단은 액체 후각 자극제가 들어 있는 후각 자극제 병에 연결됩니다. 그다음 이 병은 공기 공급 튜브에 연결됩니다. 이제 기록 실험을 위한 전극 준비 방법을 살펴보겠습니다.기록 전극은 변형된 링거액(ringer solution)이 채워진 당긴 유리 모세관 안의 염화은 도선입니다. 기준 전극은 염화은 도선입니다. 전극 홀더에 은선을 설치하여 두 전극의 준비를 시작하십시오.기록 전극의 경우, 전극 홀더 끝단에서 전선이 1~2cm 정도 돌출되어야 합니다. 기준 전극에는 전선을 더 길게 남겨두어도 좋습니다. 염화은 코팅을 입히려면 전선을 0.1 M 염화나트륨 용액에 넣고 전극 홀더를 1.5~9V DC 전원의 양극 단자에 연결하십시오.전원의 음극은 0.1 molar 염화나트륨 용액에 전기적으로 연결되어야 합니다. 기록 전극과 기준 전극 사이의 정전하를 균등하게 하기 위해 염화 반응이 10분 동안 진행되도록 둡니다. 전극을 기록 장치에 설치하기 전에 전극끼리 짧게 접촉시킵니다.다음으로, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 뽑아냅니다. 모세관 팁의 개구부 직경은 약 5~10 µm가 되어야 합니다. 다이아몬드 펜슬을 사용하여 모세관의 뭉툭한 끝부분에 금을 그어 부러뜨려, 은선의 길이보다 약 2 cm 더 길게 만듭니다.부탄 토치를 사용하여 절단된 끝부분을 화염 연마(fire polish)한 다음, 수정된 링거 용액(modified ringer solution)에 0.5% agros를 녹입니다. 가열 후 길고 가늘게 뽑아낸 시린지를 사용하여, 전극 끝부분에 소량의 용융된 agro 용액을 옮겨 담기 위해 트랜스퍼 피펫을 사용합니다. 뽑아낸 모세관의 약 절반 정도를 채웁니다.변형된 링거액을 사용하여 모세관을 가볍게 튕겨 기포를 제거합니다. 충전된 전극은 사용 직전까지 바닥에 변형된 링거액이 소량 들어 있는 보관 용기에 넣어 보관하십시오. 조직 샘플이 준비되어 기록이 가능한 상태가 되면, 전극이 준비된 상태에서 충전된 모세관을 기록 전극 와이어 위에 설치합니다.기록 준비를 위한 조직 준비 기록 실험을 살펴보겠습니다. 희생된 마우스의 두개골 위 피부를 제거하고 머리를 정중선을 따라 양측으로 이등분한 후, 머리의 절반을 내측이 위로 향하게 하여 마운팅 디쉬에 고정합니다. 비갑개가 노출되도록 비중격을 조심스럽게 제거합니다.조직이 고정된 디쉬를 기록 스테이지 위에 놓습니다. 비갑개의 기록 위치가 현미경 중앙에 오도록 스테이지를 정렬합니다. 이제 에어 탱크를 켜서 비갑개 표면에 분당 약 600 milliliters의 가습 공기를 공급합니다.공기 주입 튜브를 기록 위치에서 약 10 millimeters 떨어진 곳에 배치합니다. AC 증폭은 EOG 신호에 아티팩트를 유발하므로 증폭기를 DC 모드로 설정하십시오. 저역 통과 필터 1 kilohertz 및 이득 100 x로 데이터를 획득합니다.이제 기록 전극과 기준 전극을 마이크로 조작기에 장착하십시오. 기준 전극을 장착 디쉬의 웰 안으로 내려 조직과 전기적으로 연결되도록 수정된 링거액으로 덮어줍니다. 기록 전극을 비갑개 2B 또는 3의 표면 위로 조심스럽게 내리십시오.전극이 후각 상피 표면에 살짝 닿아야 합니다. 전극이 상피와 접촉하면 오실로스코프에 직선의 기선(baseline)이 나타납니다. 이제 컴퓨터에 연결된 공기 공급 튜브의 측면 포트에 향료 병을 부착하십시오.자극 프로토콜을 시작합니다. 데이터 수집을 위한 샘플링 속도는 2 kHz 이상이어야 합니다. 소프트웨어가 냄새 펄스를 트리거하고 기록을 시작합니다.전형적인 자극 프로토콜은 100 millisecond 지속 시간의 단일 펄스 쌍, 1 second 간격으로 분리된 100 millisecond 펄스, 또는 10 second 지속 펄스로 구성될 수 있습니다. 적응 현상을 최소화하기 위해, 고농도의 취기(odor)를 전달한 후에는 프로토콜 사이에 1분에서 5분 정도의 간격을 둡니다. 튜브에 잔류 취기가 남아 있을 수 있으므로, 추가 조직 샘플로 진행하기 전에 공기 튜브를 95% ethanol로 세척하고 건조하십시오.Axo graft 소프트웨어는 EOG 신호의 주요 파라미터를 측정하기 위한 도구를 제공합니다. 이러한 파라미터에는 반응 진폭, 잠복기, 피크 도달 시간 및 종결 시정수가 포함됩니다. EOG의 여러 파라미터, 특히 반응 진폭, 잠복기 상승 시간, 피크 도달 시간 및 종결 시정수는 마우스 간의 정규화된 반응을 비교하는 데 매우 유용합니다.여기에는 액상 아밀 아세테이트의 농도를 높여 자극했을 때 마우스에서 나타난 OG가 제시되어 있습니다. 상단의 검은색 선은 취기 자극의 타이밍과 지속 시간을 나타냅니다. 여기서 다섯 마리 마우스의 평균값으로 도출된 용량-반응 관계를 확인할 수 있으며, 오차 막대는 95% 신뢰 구간입니다.매우 높은 후각 농도에서는 피크 진폭의 감소가 흔히 관찰됩니다. 쌍펄스 자극에 대한 EOG의 예시가 나타나 있으며, 단일 단파장 후각 자극은 수 초 동안 지속되는 적응을 유발합니다. 여기 제시된 것은 10초 동안 지속된 후각 자극에 대한 EOG입니다.EOG는 지속적인 후각 자극 제시 중에 탈감작 현상을 보여줍니다. 방금 생쥐로부터 전극도그램(electrode factor gram)을 기록하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 전극을 상피 표면에만 배치하고 표면 아래로 관통하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.변동성을 최소화하기 위해 항상 머리의 동일한 측면에서 기록하고 실험 설정을 변경하지 마십시오. 조직을 습윤하게 유지하되 액체 방울이 맺히지 않도록 주의하십시오. 해부 직후 조직을 가습된 공기 아래에 두면 기록을 위한 최적의 상태를 유지할 수 있습니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

곤충 후각 시스템은 electroantennograms (EAG)와 안테나에 위치한 모든 odorant 수용체 뉴런 (ORNs)에서 개별 안에 보관되어과는 반응을 표현하는 아르 단일 sensillum 레코딩 (SSR)의 형태로 기록 odorant 유발 반응에 대한 독특한 기회를 제공 각각 sensilla.

모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

이 문서는 생쥐의 후각 망울의 표면에지도 냄새 evoked 활동에 고유 광 신호와 flavoproteins autofluorescence 신호 이미징의 프로토콜을 제공합니다.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

초파리는 복잡한 후각 시스템을 가지고 있으며, 수백 가지 냄새 물질을 구별할 수 있으며, 후각을 사용하여 행동 결정을 지시할 수 있습니다. 이 비디오는 파리의 후각 행동 반응을 연구하는 방법인 4방향 후각계 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 테스트 파리를 처리하는 방법과 분석을 수행하는 동안 중요한 단계가 무엇인지 보여줍니다.

Four-Way Olfactometer Assay: 초파리에서 냄새 유발 반응을 평가하는 방법

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

여기에서는 최대 100마리의 식초파리(Drosophila melanogaster)의 후각 반응을 분석하기 위한 행동 설정 및 데이터 분석 방법을 설명합니다. 이 시스템은 단일 또는 다중 후각 자극과 함께 사용할 수 있으며 신경 세포 하위 집합의 광유전학적 활성화 또는 침묵에 적응할 수 있습니다.

의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동<em&gt; 초파리</em&gt; 네 사분면의 후각에

후각 신경에서 세포 외 다단위 기록은 해양 물고기의 후각 감도를 평가하기위한 민감하고 견고하며 재현 가능한 방법입니다. 그것은 기본 감각 입력을 기록하고 외부 염도의 독립적이다.

텔레오스트의 후각 신경에서 세포 외 다중 단위 기록

이 프로토콜은 go/no-go 후각 행동 실험을 위한 후각계의 구성을 설명합니다. olfactometer의 성공적인 구성을 보장하기 위해 이미지와 함께 단계별 지침이 제공됩니다. 프로세스 중에 발생하는 문제를 해결하기 위한 정보도 포함되어 있습니다.

설치류 후각 행동 연구를 위한 후각계 구축

배우세요 전자후각도(EOG) 기록 기법을 사용하여 마우스 후각 상피에서 후각 감각 뉴런의 전기적 반응을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 신경과학 연구자들이 실시간으로 후각 기능을 평가하는 데 활용할 수 있습니다.

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