분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

MSC로 약칭되는 중간엽 줄기세포를 6~8주령의 rag dolly 암컷 랫드로부터 분리하여, 약 80%의 합류도(confluency)에 도달할 때까지 10 cm 페트리 접시에서 배양합니다. MSC를 농축하기 위해, 세포를 비오틴 결합 1차 항체로 염색한 후 스트렙타비딘 결합 자성 비드를 처리합니다. 이후 자기 활성 세포 분리법(MACS)을 통해 표지된 세포를 음성 분획과 양성 분획의 두 그룹으로 분리합니다.

이어서, 표면 마커 발현을 확인하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 마지막으로, 단일 콜로니 유래 MSC를 얻기 위해 클로닝 실린더를 사용합니다. 안녕하세요, 저는 미시간 주립대학교 화학공학 및 재료과학과의 Christina Chang 연구실의 Lee입니다.

오늘은 chy 줄기세포의 분리 및 농축과 단일 콜로니 유래 세포를 얻는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 적색 줄기세포의 증식 및 분화 거동을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.

6~8주령의 암컷 Sprague-Dawley 랫드로부터 중간엽 줄기세포(MSC)를 분리합니다. 이 절차를 시작하려면, 안락사시킨 동물의 뒷다리에서 대퇴골과 경골을 절단합니다. 피부와 근육을 제거하고, 분리한 대퇴골과 경골을 70% isopropanol에 몇 초간 담근 후, 1X DPBS로 옮깁니다.

다음 단계들은 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 수행해야 합니다. 먼저, 대퇴골과 경골을 DMEM이 담긴 10 centimeter 디쉬로 옮깁니다. 그런 다음 핀셋으로 각 뼈를 잡고 가위로 양 끝단을 절개합니다.

22 gauge 바늘을 3 mL 주사기에 부착하고 DMEM로 채웁니다. 바늘을 뼈의 열린 한쪽 끝에 삽입하고 골수를 50 mL 튜브로 씻어 냅니다. 모든 골수를 얻을 때까지 각 뼈마다 이 과정을 2~3회 반복합니다.

세포를 재부유시킨 후, 70 µm 세포 스트레이너에 세포 현탁액을 통과시켜 골 파편과 혈액 응집물을 제거합니다. 4 °C에서 200 ×g로 5분간 원심 분리합니다. 흡입법으로 상층액을 제거한 후, 25 mL의 MSC medium seed에 세포를 재부유시킵니다.

두 개의 10 centimeter 배양 접시에 각각 10 milliliters의 세포 현탁액을 넣습니다. 배양 접시를 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 1~2주 동안 배양합니다. 이전에 분리한 쥐 MSCs가 약 80%의 합류도(confluency)에 도달하면, 배지를 흡입하고 각 접시에 4~5 milliliters의 trypsin EDTA를 첨가합니다.

디쉬를 인큐베이터로 옮겨 약 5분 동안 배양합니다. 세포가 떨어져 나오게 하려면, 트립신을 불활성화하기 위해 동일한 양의 배양액을 첨가합니다. 세포 현탁액을 15 milliliter 튜브에 수집하고 4 °C에서 200 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다.

이제 표면 마커인 CD 54와 CD 90을 이용하여 MSC를 농축하는 방법을 시연하겠습니다. BD Biosciences의 세포 분리 자석인 BD I magnet을 사용합니다. 먼저 세포 펠렛을 세포 염색 완충액에 20 million cells/mL 농도로 재현탁하는 것으로 시작하십시오.

다음으로, 세포 현탁액에 비오틴화된 CD 54 항체와 비오틴화된 CD 90 항체를 첨가하고 가볍게 혼합합니다. 얼음 위에서 15분 동안 배양한 후, 1 X BD IMAG 버퍼를 충분한 양으로 사용하여 라벨링된 세포를 세척합니다. 라벨링된 세포를 4°C에서 200 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. BD imag 스트렙타비딘 입자를 충분히 볼텍싱하여 준비한 후, 세포 10 million개당 40 µL의 입자를 첨가합니다.

입자를 라벨링된 세포와 충분히 혼합하고, 6~12 °C에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 배양하는 동안 양성 분획을 수집할 라운드 바텀 시험관에 라벨을 부착합니다. 배양이 완료되면, 라벨링 부피의 세포 농도를 20 million cells/mL로 맞춥니다.

Expedia I mag 버퍼 1회분으로 세척합니다. 라벨링된 세포를 양성 분획 수집 튜브로 옮깁니다. 양성 분획 튜브를 BDI 마그넷 위에 놓고 6분 동안 둡니다.

그런 다음 양성 분획 튜브를 BDI 자석 위에 둔 상태에서, 유리 파스퇴르 피펫으로 상층액을 제거합니다. 다음으로, BDI 자석에서 양성 분획 튜브를 분리하여 얼음 위에 놓습니다. 1 mL의 차가운 1X BDI mag buffer를 첨가하고 가볍게 섞어 세포를 재부유시킵니다.

튜브를 다시 BDI 자석 위에 놓고 2~4분 동안 둡니다. 새로운 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 앞서 설명한 대로 세척 과정을 반복합니다.

한 번 더 반복합니다. 마지막으로, 새로운 글라스 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 그런 다음 BDI 마그넷 랙에서 튜브를 꺼냅니다.

세포를 1 mL의 배양 배지에 현탁하고, 이 세포 현탁액을 25 mL의 배지가 들어 있는 50 mL 튜브로 옮깁니다. 세포 유지를 위해 1개의 75 cm² 플라스크를 사용하고, 유세포 분석을 위해 10 cm 디쉬를 사용합니다.

단일 콜로니 유래 MSC를 분리하는 절차를 시작하려면, 10 cm 디쉬당 약 50~100개의 세포를 플레이팅하고 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 1~2주 동안 배양합니다. 이 1~2주의 기간 동안 도립 현미경을 사용하여 잘 분리된 콜로니를 관찰합니다. 콜로니의 크기가 각각 100개 이상의 세포를 포함할 만큼 충분히 커지면, 디쉬 바닥에 유성 매직으로 콜로니를 표시합니다.

표식할 콜로니를 선택할 때, 주변에 다른 콜로니가 없는지 확인하십시오. 배지를 흡입해 제거하고, 핀셋을 사용하여 1X DPBS로 디쉬를 한 번 세척합니다. 멸균된 클로닝 실린더를 집어 표식된 콜로니 주변에 조심스럽게 배치하십시오.

표시된 모든 콜로니 위에 클로닝 실린더가 배치될 때까지 이 과정을 반복합니다. 각 클로닝 실린더에 100 µL의 tripsin EDTA를 넣고 디쉬를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 5분 후, 현미경으로 세포가 둥글게 변하는지 확인합니다.

세포가 떨어져 나왔으면, trypsin을 불활성화하기 위해 동일한 양의 배양액을 추가합니다. 200 µL 마이크로 피펫으로 세포 현탁액을 혼합한 후, 3 mL의 예열된 배양액이 담긴 60 mm 디쉬로 세포 현탁액을 옮깁니다. 디쉬에 라벨을 붙이고 인큐베이터에 다시 넣고 플라스틱 부착 세포를 분리합니다.

MSC는 플레이팅 다음 날 관찰되어야 합니다. 세포가 계속 증식함에 따라, 합류된 세포는 대다수가 방추형 또는 별 모양인 이 위상차 이미지의 세포와 같은 모습이어야 합니다. 세포가 약 80% 합류도에 도달했을 때 배양하는 것이 적절합니다.

트립신 처리 후 분리된 세포는 배지 내에서 둥근 모양으로 부유하는 상태여야 합니다. 자기 세포 분리법으로 MSC를 농축한 후, 표면 마커 발현을 확인하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 농축이 적절히 이루어졌다면, 세포는 MSC 마커인 CD 54 및 CD 90에 대해 양성 염색을 나타내고, HSC 마커인 CD 45에 대해서는 음성 반응을 보여야 합니다. 음성 대조군으로는 isotype control인 IgG two A 및 IgG one이 사용됩니다.

세포가 적절한 클론 밀도로 배치되면, 이 예시에서 보는 바와 같이 단일 세포로부터 콜로니가 형성되어야 합니다. 이후 클로닝 실린더를 사용하여 콜로니를 분리할 수 있으며, 해당 콜로니에서 유래한 세포들을 각각 독립적으로 배양할 수 있습니다. 이 두 가지 예시에서, 한 콜로니에서 유래한 세포들은 방추형인 반면, 다른 콜로니에서 유래한 세포들은 둥근 형태를 띠고 있습니다.

지금까지 무작위 및 일반 줄기세포를 분리 및 농축하는 방법과 단일 콜로니 유래 세포를 얻는 방법을 살펴보았습니다. 이 과정에서 분리 단계 동안 혈전과 골 파편을 제거하는 것이 중요함을 기억하십시오. 농축 시에는 최적량의 항체를 사용하고, 콜로니 분리 시에는 잘 분리된 콜로니를 잘 표시해 두십시오.

여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.