Name: Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 학습하세요 Pichia pastoris에서 재조합 단백질 표현 방법을. 전기능성 세포 준비, 벡터 형질전환, 웨스턴 블롯 분석을 통해 고품질 단백질을 생산하는 전체 프로토콜을 확인하세요.

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우리는이 작업을 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금, 보건 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT는 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 화목에 의해 지원되었다.

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

호스트 시스템으로 methylotrophic 효모 Pichia pastoris의를 사용하여 단백질 발현이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 단백질이 사용된 복제 벡터에 따라 매체에 분비 수 있습니다. 재조합 단백질의 분비는 이후의 정화가 쉬워집니다. 그러나, 표시 조건이 증가 단백질 수준에서 발생할 수 있습니다 서로 다른 단백질과 조건과 표현 시대의 변화의 표현에 최적해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 벡터는 C - myc의 에피토프이 에피토프을 구입할 수에 대한 항체의 기능을 지니고 있습니다. 이것은 항체가 아직 사용할 수 없습니다하는 단백질의 분석을 수 있습니다. 부모 벡터의 그의 태그 기능은 금속 chelating 수지에있는 단백질 정화를 촉진하고 사용할 수있는 벡터의 그의 태그 섹션에 대한 항체도있다. 이 프로토콜에 설명한 바와 같이, Pichia pastoris에서 단백질의 표현은 잘 계획하고 준비해야 다단계 프...

methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 pichia pastoris의</em

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

미생물 진핵 숙주 Pichia pastoris에서 단백질의 표현은 빠르고 사용하기 쉬운 표현 시스템에서 재조합 단백질의 높은 금액을 생성할 수있는 가능성을 제공합니다. 단세포 미생물로서 P. pastoris는 조작하기 쉬운 높은 세포 밀도에서 저렴한 미디어에 빠르게 자랍니다. 진핵세포 생물, P. 웰빙 pastoris 높은 진핵 세포 얻은 재조합 단백질에 의해 수행 사후 translational 수정의 많은 단백질 접힘, proteolytic 처리, 이황화 결합 형성과 글리코 실화 [1]를 받아야 수행할 수 있습니다. methylotrophic 효모 P.으로 pastoris는 유일한 탄소 소스로 메탄올을 metabolizing이 가능합니다. 알코올 산화 효소, AOX1에 대한 강력한 발기인은 밀접하게 규제와 메탄올에 의해 유도하고 그것은 관심의 유전자의 표현에 사용된다. 따라서, 외국 단백질의 표현은 성장 매체 메탄올을 추가하여 유도된 수있다 [2, 3]. 또 다른 중요한 장점은 P. pastoris의의 분비 경로로 외국 단백질을 대상으로 신호 시퀀스를 사용하여 성장 매체로 재조합 단백질의 분비이다. 효모 자체로 미디어에 분비 내생 단백질과 언론 노 추가 단백질만을 낮은 수준, heterologous 단백질은 매체에있는 총 단백질의 대부분을 빌드하고 단백질 정화 단계에 따라 용이하게 [3, 4]. 재조합 단백질, E. 모두 선택할 Zeocin 저항 유전자의 분비에 대한 α - 계수 분비 신호, 여기에 사용되는 벡터는 (pPICZαA) 관심있는 유전자의 꽉 규제, 메탄올 유도된 표현 AOX1 발기인을 포함 대장균과 Pichia 및 C - myc 에피토프 및 재조합 단백질의 감지 및 정화를위한 polyhistidine (6xHis) 태그를 포함하는 C - 말단 펩타이드. 우리는 또한 부모 벡터의 C - myc의 에피토프을 인식하는 특정 안티 - myc - HRP 항체를 사용하여 재조합 단백질의 서양 얼룩 분석을 보여줍니다.

프로토콜은 methylotrophic 누룩을 사용하여 단백질 발현을 설명합니다<em&gt; Pichia pastoris의</em&gt;. electrocompetent 효모 세포의 준비, 관심의 유전자에있는 벡터의 변화<em&gt; P. pastoris</em&gt;과 효모 DNA 정화도 수행됩니다. 서양 얼룩 분석 및 단백질 정화는이 단백질 표현 프로토콜의 마지막 단계를 빌드합니다.

Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의</em

미생물 진핵 숙주인 Pichia pastoris에서의 단백질 발현은 빠르고 ... 한 방식으로 다량의 재조합 단백질을 생성할 수 있는 가능성을 제공합니다.

다음 프로토콜은 methyl atrophic yeast opus를 이용한 단백질 발현 방법을 설명합니다. 전기 천공 가능 효모 세포의 준비 과정과 목적 유전자가 포함된 벡터를 PPA로 형질전환하는 과정이 제시되며, 이후 목적 유전자가 효모 게놈에 적절히 통합되었는지 확인하기 위한 효모 DNA 정제 단계가 이어집니다. 마지막으로, 재조합 단백질의 발현을 수행합니다.안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 Steven Hallam 연구실 소속 Maria입니다. 저 또한 Helm 연구실 소속인 Marcus입니다. 오늘은 TRO 효모 PQ.Past stories에서 재조합 단백질을 발현시키는 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 환경 DNA가 추출 및 보관된 미배양 미생물 및 메타게놈 라이브러리의 단백질을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 메틸 영양 효모인 Pichia pastoris에서 재조합 단백질을 발현시키려면, 목적 유전자를 Pichia pastoris 벡터에 프레임에 맞게 클로닝해야 합니다.본 실험에서는 PPIC Z alpha A 벡터를 사용합니다. 이 벡터는 목적 유전자의 엄격하게 조절된 메탄올 유도 발현을 위한 AO X one 프로모터, 재조합 단백질 분비를 위한 alpha factor 분비 신호, e coli 및 pic 모두에서 선택이 가능한 zaas 및 저항성 유전자, 그리고 재조합 단백질의 검출 및 정제를 위한 c-terminal 펩타이드(acemic epitope 및 poly histamine tag 포함)를 포함하고 있습니다. 형질전환 전에 제한효소 절단을 통해 목적 유전자가 포함된 벡터를 선형화하십시오. 본 실험에서는 PME one 효소를 사용하였으나, 삽입물(insert)에 해당 제한효소 부위가 포함되어 있지 않다면 다른 제한효소 부위도 사용 가능합니다.충분한 양의 선형화된 벡터 DNA를 얻으려면, 별도의 튜브에 50 µL 규모의 제한 효소 절단 반응을 3~4회 설정하십시오. 절단 후 모든 용액을 합쳐 구성물을 농축합니다. AmCon 원심분리 필터 유닛과 MicroCon 원심분리 필터 유닛을 사용하여, PPA dous로의 형질전환을 위해 5~10 µL의 멸균수에 녹인 5~20 µg의 선형화된 DNA가 필요합니다. 전기천공 유능 PPA dous를 준비하려면, 예정된 형질전환 4일 전에 SN이 없는 A-Y-P-D-S 플레이트에 세포를 스트리킹하고

expression-recombinant-proteins-methylotrophic-yeast-pichia

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백질 전달은 세포에 생물학적으로 활성화된 단백질의 직접 배달을 수 있습니다. 이러한 DNA의 transfection 또는 바이러스성 도입으로 종래의 방법과는 달리이 비침습 패러다임은 세포 독성 및 영구 유전자 조작에 의해 종양 발생 변화의 위험을 우회 titratable 방식으로 고효율 세포 조작이 가능합니다.

공학 세포 투과 단백질

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

이 방법을 처음으로 Pichia pastoris (Komagataella phaffii), 탄소 규제 소스 발기인 P 고용에 효율적인 유도할 수 있는 메탄올 무료 재조합 단백질 생산에 대 한 신뢰할 수 있는 실험 절차를 설명 합니다. DC및 PDF  재배 하면서 작은 규모의 실험에서 매개 변수를 모니터링할 수 있습니다 온라인, 그리고 지속적인 글리세롤 피드 적용 됩니다.

Pichia Pastoris 탈 억제 기술을 채용 하 여 메탄올 독립 식

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

이 프로토콜은 관심 항원에 결합하는 단백질 변이체를 풍부하게 하기 위해 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인을 수행하기 위한 필수 단계를 설명합니다.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

학습하세요 Pichia pastoris에서 재조합 단백질 표현 방법을. 전기능성 세포 준비, 벡터 형질전환, 웨스턴 블롯 분석을 통해 고품질 단백질을 생산하는 전체 프로토콜을 확인하세요.

Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의

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