Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의

다음 프로토콜은 methyl atrophic yeast opus를 이용한 단백질 발현 방법을 설명합니다. 전기 천공 가능 효모 세포의 준비 과정과 목적 유전자가 포함된 벡터를 PPA로 형질전환하는 과정이 제시되며, 이후 목적 유전자가 효모 게놈에 적절히 통합되었는지 확인하기 위한 효모 DNA 정제 단계가 이어집니다. 마지막으로, 재조합 단백질의 발현을 수행합니다.

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 Steven Hallam 연구실 소속 Maria입니다. 저 또한 Helm 연구실 소속인 Marcus입니다. 오늘은 TRO 효모 PQ.Past stories에서 재조합 단백질을 발현시키는 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 환경 DNA가 추출 및 보관된 미배양 미생물 및 메타게놈 라이브러리의 단백질을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 메틸 영양 효모인 Pichia pastoris에서 재조합 단백질을 발현시키려면, 목적 유전자를 Pichia pastoris 벡터에 프레임에 맞게 클로닝해야 합니다.

본 실험에서는 PPIC Z alpha A 벡터를 사용합니다. 이 벡터는 목적 유전자의 엄격하게 조절된 메탄올 유도 발현을 위한 AO X one 프로모터, 재조합 단백질 분비를 위한 alpha factor 분비 신호, e coli 및 pic 모두에서 선택이 가능한 zaas 및 저항성 유전자, 그리고 재조합 단백질의 검출 및 정제를 위한 c-terminal 펩타이드(acemic epitope 및 poly histamine tag 포함)를 포함하고 있습니다. 형질전환 전에 제한효소 절단을 통해 목적 유전자가 포함된 벡터를 선형화하십시오. 본 실험에서는 PME one 효소를 사용하였으나, 삽입물(insert)에 해당 제한효소 부위가 포함되어 있지 않다면 다른 제한효소 부위도 사용 가능합니다.

충분한 양의 선형화된 벡터 DNA를 얻으려면, 별도의 튜브에 50 µL 규모의 제한 효소 절단 반응을 3~4회 설정하십시오. 절단 후 모든 용액을 합쳐 구성물을 농축합니다. AmCon 원심분리 필터 유닛과 MicroCon 원심분리 필터 유닛을 사용하여, PPA dous로의 형질전환을 위해 5~10 µL의 멸균수에 녹인 5~20 µg의 선형화된 DNA가 필요합니다. 전기천공 유능 PPA dous를 준비하려면, 예정된 형질전환 4일 전에 SN이 없는 A-Y-P-D-S 플레이트에 세포를 스트리킹하고, 형질전환 2일 전까지 30 °C에서 1~2일 동안 또는 단일 콜로니가 형성될 때까지 배양하십시오.

50 mL Falcon 튜브에 YPD 배지를 넣고 PPA 또는 균주 5 mL를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 하루 전, Falcon 튜브를 플라스크에 넣어 진탕배양기에 고정합니다. 하룻밤 동안 배양한 배양액 0.25 mL를 사용하여 2 L 플라스크의 신선한 YPD 배지 500 mL에 접종합니다.

30 °C의 진탕 배양기에서 OD 600이 1.3에서 1.5가 될 때까지 다시 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 당일에 얼음, 차가운 멸균수 및 1 M sorbitol을 준비해 둡니다. 4 °C에서 1500 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

원심분리 후, 펠릿을 500 milliliters의 차가운 멸균수로 현탁합니다. 원심분리 튜브의 용량에 따라, 부피를 두 개의 별도 튜브로 나누거나 여러 번 나누어 수행해야 할 수도 있습니다. 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 250 milliliters의 차가운 멸균수로 재현탁합니다.

원심분리 튜브의 용량에 따라 각각의 세포 펠릿을 하나의 튜브에 합칠 수 있습니다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 현탁된 세포를 20 mL의 얼음처럼 차가운 1 M sorbitol에 넣어 50 mL falcon 튜브로 옮긴 후 원심분리합니다.

최종 원심분리 후, 펠렛을 1 M의 얼음처럼 차가운 sorbitol 1 mL에 재부유하여 최종 부피를 약 1.5 mL로 맞춥니다. 마이크로 원심분리 튜브에 재부유된 세포를 넣고, 형질전환에 사용할 때까지 얼음 위 또는 4 °C에서 보관합니다. 농축된 선형화 구조체를 PPA 저장 세포로 형질전환하기 전에 다음 시약과 기구를 준비하십시오.

마이크로 원심분리 튜브에 1 M sorbitol 1 mL를 채우고 얼음에 둡니다. 0.2 cm 전기천공 큐벳을 얼음에 둡니다.

멸균된 15 milliliter 유리 튜브에 라벨을 붙이고, 피펫 옆에 멸균된 유리 막대를 준비합니다. 이전에 준비한 전기 천공 가능 세포 80 microliters를 얼음처럼 차가운 0.2 centimeter 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다.

플라스미드 DNA 용액을 세포에 첨가하고 피펫 팁을 좌우로 움직여 혼합합니다. 전기천공법 큐벳에 넣습니다. 세포가 들어있는 큐벳을 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 티슈로 큐벳의 외부를 닦아내고 사용 중인 특정 전기천공 장치 제조사에서 권장하는 출아 효모(budding yeast) 파라미터에 따라 세포에 펄스를 가합니다. 본 시연에서는 BioRad gene Pulser를 사용하였으며, 조건은 다음과 같습니다. 충전 전압 1500 volts, 정전용량 25 micro ferres, 펄스 가함 직후의 저항 200 ohms입니다.

얼음처럼 차가운 1 M sorbitol 1 mL를 튜브에 넣습니다. 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 튜브의 내용물을 멸균된 15 mL 튜브로 옮깁니다. 해당 튜브를 흔들지 않은 상태로 30 °C에서 1.5시간 동안 배양합니다.

1.5시간 후, 전기천공된 세포를 플레이팅할 수 있습니다. 100 µg/mL의 Zain이 포함된 라벨이 부착된 4개의 YPTS 플레이트에 각각 5~10개의 멸균된 유리 구슬을 넣습니다. 전기천공액 250 µL를 도말합니다.

각 플레이트에서 혼합하고 플레이트를 수평으로 흔들어 세포를 균일하게 퍼뜨립니다. 플레이트를 15분 동안 건조시킨 후, 플레이트를 뒤집어 agar에서 비즈를 제거합니다. 빛에 민감한 Zain의 분해를 막기 위해 플레이트를 검은색 플라스틱으로 감싸고, 콜로니가 형성될 때까지 30 °C에서 2~3일 동안 플레이트를 뒤집은 상태로 배양합니다.

12개의 콜로니를 선택합니다. 100 µg/mL의 zein이 포함된 신선한 YPDS 플레이트에 클론을 스트리킹하여 정제합니다. 단백질 발현을 위한 PPA 세포를 준비하기 위해, 정제된 pichia 콜로니에서 단일 콜로니를 선택하여 멸균된 250 mL 플라스크에 담긴 25 mL의 VMGY 배지에 접종하고, 배양액의 OD 600이 2에서 6에 도달할 때까지 진탕 배양기에서 30 °C로 배양합니다.

세포가 적절한 OD 600에 도달하면, 보관을 위해 세포의 글리세롤 스톡을 준비합니다. 세포 배양액 800 µL를 2 mL 저온 보관용 튜브(cryogenic vial)로 옮기고 멸균된 글리세롤 200 µL를 첨가합니다. 글리세롤 스톡을 -80 °C에서 보관하십시오.

또한, 세포 배양액 1.5 milliliters를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 1300 GS로 1분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 펠릿을 4 °C에서 보관합니다.

이 세포들은 yeast DNA 정제를 통해, 삽입물 특이적 프라이머를 이용한 PCR 후 agarose gel 상에서 pichia 가닥을 분석하여 표적 유전자가 pichia 게놈에 성공적으로 통합되었는지 확인하는 데 사용됩니다. 나머지 25 milliliter 배양액을 50 milliliter Falcon tube로 옮기고, 상온에서 3000 Gs로 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 따라내고 튜브를 티슈 위에 거꾸로 세워 잔류 배지를 제거합니다. 세포 펠릿을 세척하기 위해 20 milliliters의 BMMY medium에 넣고 보텍싱하거나 피펫팅하여 재현탁한 후 원심분리합니다.

상층액을 따라낸 후, 볼텍싱(vortexing)이나 피펫팅(pipetting)을 통해 세포 펠렛을 BMMY 발현 유도 배지에서 OD 600이 1.0이 되도록 다시 현탁합니다. 배양액을 1리터 배플 플라스크(baffled flask)로 옮기고, 플라스크를 200밀리리터 비커로 덮어줍니다.

배양액에 더 많은 산소를 공급할 수 있으므로 배플 플라스크(baffled flask) 사용을 강력히 권장합니다. 메탄올 유도 과정 중 효율적인 단백질 발현을 위한 배지가 준비되면, 플라스크를 인큐베이터에 넣어 30 °C에서 성장을 지속시키십시오. 인큐베이터의 온도가 변동될 경우, 온도가 30 °C를 초과하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

온도를 28 °C로 설정하십시오. 발현 시작 후 특정 시점에서 유도를 유지하기 위해 24시간마다 멸균된 순수 메탄올을 최종 농도 0.5%methanol이 되도록 첨가하십시오. 배양액 1 mL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮겨 1300 ×g에서 2.5분 동안 원심분리하십시오. 실온에서 상층액을 별도의 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.

상청액과 세포 펠릿을 추가 분석 시까지 -80°C에서 보관하십시오. 유도 후 단백질 발현을 위한 최적의 시간대를 설정하기 위해 서로 다른 시점의 샘플들을 분석할 것입니다. 이제 PIA Pastis를 호스트 시스템으로 사용하여 재조합 단백질을 성공적으로 발현시킨 몇 가지 대표적인 결과를 보여드리겠습니다.

이 웨스턴 블롯 이미지는 발현 24시간 후의 4가지 발현 단백질을 보여줍니다. 면역 블로팅에 사용된 항체는 acemic HRP 항체였습니다. 두 번째 레인은 음성 대조군으로, 모벡터(parent vector)로 형질전환되어 재조합 단백질을 발현하지 않는 세포의 상청액을 로딩하였습니다.

지금까지 진핵세포 숙주인 PQ.Plus를 사용하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법을 살펴보았습니다. 이 과정을 수행할 때는 관심 유전자가 정확히 클로닝되었고 프레임이 맞는지 확인하기 위해 컨스트럭트의 서열 분석을 완료하고, 시작 전 모든 플레이트와 시약을 준비하는 것이 중요합니다. 또한 메탄올 유도를 통한 단백질 발현 전에 충분한 수의 형질전환체를 얻을 수 있도록 적절한 양의 선형화된 플라스미드를 준비하는 것이 중요합니다. 단백질 발현을 저해할 수 있는 잔류 글리세롤을 완전히 제거하기 위해 세포 펠렛을 충분히 세척하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.