의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

이 실험 절차의 전반적인 목적은 배양 상태에서 조작된 난소(OO) 부위로부터 유래된 발달 중인 배아를 얻는 것입니다. 이는 먼저 한 마리의 암컷으로부터 공여자 난소 부위를 분리하고, 이를 배양 상태에서 원하는 대로 조작함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 프로게스테론을 사용하여 이들 세포의 성숙을 촉진하고, 잠재적 수용 암컷에게 성선자극호르몬(gonadotropin)을 주입하여 산란을 유도하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 생존 염색약으로 공여 세포를 염색하고 호스트가 될 암컷을 준비하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 공여 세포를 호스트의 체강으로 외과적으로 이식하고, 몇 시간 후에 이식된 난자를 회수하여 수정시키는 것입니다. 결과적으로 실험적으로 조작된 공여 세포로부터 정상적으로 분열하는 배아가 생성됩니다.

세포는 일반 배아와 동일하게 얻어서 분석할 수 있습니다. 안녕하세요, 아이오와 대학교의 Doug Houston입니다. 오늘은 Cold Spring Harbor Xap 과정에서 호스트 전이 절차를 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 모체 유전자 산물의 역할을 연구하고 초기 제브라피쉬 발달 과정에서의 역할을 규명하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 수술을 시작하기 전에 수술 부위가 소독되었는지, 그리고 신선한 배지와 멸균된 도구가 준비되었는지 확인하십시오.

원하는 방향으로 봉합 바늘을 바늘 홀더로 잡습니다. 마취된 암컷 개구리를 젖은 수술용 거즈 위에 배가 위로 오도록 눕힙니다. 작은 아이리스 가위를 사용하여 복부 하단의 중앙선 측면 피부에 1cm 절개를 가합니다.

복근을 절개하지 마십시오. 포셉을 사용하여 근육층과 주변의 흰색 근막을 들어 올립니다. 아이리스 가위를 사용하여 근육을 통해 아래로 한 번에 빠르게 절개합니다.

절개 부위를 1cm까지 확장하여 난소를 노출시킵니다. 포셉을 사용하여 난소를 잡고 엽(lobe) 하나를 끌어냅니다. 가위를 사용하여 체벽 높이에서 해당 엽을 잘라냅니다.

조직을 난모세포 배양 배지(oocyte culture medium 또는 OCM)가 담긴 90 millimeter 디쉬에 넣고, 해부 현미경으로 난소의 상태를 즉시 확인합니다. 핀셋을 사용하여 난모세포를 몇 개 떼어낼 수 있습니다. 난모세포가 단단하고 크기와 색상이 균일하다면, 개구리로부터 필요한 양의 난소 조직을 제거하여 OCM이 담긴 90 millimeter 페트리 접시에 넣습니다.

절개 부위를 봉합합니다. 절개선에서 외측으로 몇 mm 떨어진 지점에 바늘을 삽입하며, 이때 근육과 근막을 모두 관통하도록 합니다. 포셉을 사용하여 바늘을 조작하되, 봉합사의 끝부분이 완전히 빠져나오지 않도록 주의하십시오.

단순 단속 봉합법과 서전스 스퀘어(surgeons square) 매듭을 사용하여 상처를 봉합합니다. 상세한 기술 방법은 동반 텍스트에 설명되어 있습니다. 피부층에서도 동일하게 봉합을 반복합니다.

암컷을 탈이온수로 헹군 후 시원한 물이 담긴 회복 버킷에 넣습니다. 수술 직후 가위를 사용하여 난소를 세분화합니다. 개별 엽을 절개하여 펼친 후 2cm² 크기의 조각으로 자릅니다.

깨끗한 배지로 헹구고 포셉을 사용하십시오. 개별 세포를 분리하기 위해 5~6개의 조각을 OCM이 담긴 새로운 90mm 디시로 옮깁니다. 우선 조각 하나를 작은 배지 디시로 옮긴 후 해부 현미경 아래에 둡니다.

시계 제작용 핀셋을 사용하여 3~500개의 난모세포를 수동으로 분리합니다. 두 번째 핀셋으로 완전히 성장한 6단계 난모세포 근처의 결합 조직층을 잡습니다. 첫 번째 핀셋으로 난모세포에 인접한 난소를 잡습니다.

난모세포를 가볍게 당겨 난포층을 찢어 엽니다. 조직에서 난모세포를 조심스럽게 분리해 냅니다. 난포가 제거된 난모세포는 가시적인 혈관이 없으며, 난포가 온전한 난모세포보다 더 유연합니다.

솜으로 막고 화염 멸균한 피펫을 사용하여 100~150개의 난자를 8 mL의 OCM이 들어 있는 60 mm 배양 접시로 옮깁니다. 난자를 접시째 18 °C에서 보관합니다. 이제 다양한 프로토콜에 따라 antisense oligonucleotides 또는 mRNA를 원하는 대로 미세 주입한 후, 18 °C 인큐베이터 내의 OCM에서 배양할 수 있습니다.

분리 후 96시간 이내의 난자를 사용하여 이식 전날 저녁에 이식을 진행하십시오. 필요한 난자를 성숙시키기 위해 프로게스테론으로 배양하며, 난자가 포함된 배지에 1 mM 프로게스테론 16 µL를 첨가하여 최종 농도가 2 µM가 되도록 합니다. 같은 날 저녁에 18 °C에서 10~12시간 동안 배양하고, 산란을 유도하기 위해 암컷 3~5마리에게 마리당 1000 units의 인간 임신성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)을 주사하십시오.

이전 작업을 진행하는 전날 밤, 암컷을 상온 또는 18 °C에서 하룻밤 동안 둡니다. 해부 현미경으로 관찰하여 배양된 세포가 성숙되었는지 확인합니다. 생존 염색약을 준비하고 10,000 Gs 이상의 속도로 5분 동안 원심 분리합니다.

데브리(debris)로 인한 배경 노이즈를 줄이기 위해, 각 실험군 난자에 적절한 생존 염색약 80 µL를 첨가합니다. 로커(rocker) 위에서 실온으로 15분 동안 배양합니다. 염색된 난자를 신선한 o cm가 담긴 90 mm 디시로 옮기고 가볍게 흔들어 세척합니다.

세포 전이에 사용할 피펫을 제작합니다. 다이아몬드 펜슬을 사용하여 피펫의 테이퍼진 부분에서 약 2cm 아래 지점에 흠집을 낸 후 깨끗하게 절단합니다. 이렇게 하면 난모세포가 충분히 들어갈 수 있는 1.5mm 구경의 피펫이 만들어집니다.

팁의 끝을 막지 않은 상태에서 가장자리가 매끄러워질 때까지 팁을 연마하십시오. 난모세포 이식. 수술은 가능한 한 신속하게 진행해야 합니다.

마취된 양질의 알을 낳는 암컷에 이전과 같이 절개를 실시합니다. 이 절개 부위는 이식관의 구경이 겨우 들어갈 정도의 최소 길이여야 합니다. 1 cm 미만으로 피펫팅합니다.

실험용 난자가 들어있는 디시를 가볍게 흔들어 난자들이 디시 중앙에 모이게 합니다. 준비된 파스처 피펫을 사용하여 최대한 많은 난자를 흡입합니다. 개구리로 옮겨지는 액체의 양을 최소화하기 위해 난자들이 피펫 끝부분에 가라앉도록 기다립니다.

포셉을 사용하여 근육과 근막의 플랩(flap) 하나를 잡고 들어 올립니다. 피펫 팁을 절개 부위에 삽입하고 난세포가 체강 내로 천천히 흘러 들어가게 합니다. 모든 난세포가 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다.

난모세포가 절개 부위 밖으로 쏟아지는 것을 방지하기 위해 근육층을 놓지 마십시오. 포셉을 사용하여 절개 부위의 양측을 잡고 서로 모아 난모세포가 체강 내로 가라앉도록 합니다. 이전과 같이 근육 및 근막층의 봉합을 시작하되, 첫 번째 매듭을 묶을 때까지 위쪽으로 텐션을 유지하도록 주의하십시오.

피부를 봉합합니다. 개구리를 탈이온수로 헹구고 이전과 같이 회복하도록 합니다. 개구리는 수술 후 2~3시간이 지나면 정상적으로 알을 낳기 시작해야 합니다.

암컷이 산란을 멈출 때까지 30분마다 일반적인 압착 방식으로 알을 회수하여 수집 접시에 옮깁니다. 1X XMMR에 신선하게 수집한 정자 현탁액 4mL를 첨가하고 실온에서 4분 동안 배양합니다. 실온의 용액으로 알을 충분히 침지하고 세척합니다.

활성화 및 절단을 위해 XMMR을 실온에서 배양합니다. 젤리 코트를 제거하기 위해 어느 단계에서든 시스테인을 사용하십시오. 이후 전이된 배아를 색상에 따라 서로 다른 디쉬로 분류하여 일반 배아와 동일하게 배양할 수 있습니다.

일반적으로, 이식된 난자의 3분의 2 이상이 수정 후 수 분 이내에 활성화되어 동물극에서 강한 피질 수축을 보입니다. 대부분의 실험에서 이식된 난자의 절반 이상이 정상적인 1차 난할을 거칩니다. 때로는 본 실험진의 결과에서 숙주 난자에 비해 난할이 20분 정도 지연될 수 있습니다.

이식된 배아의 30~60%가 정상적으로 위장관 형성에 진입하며 신경 단계 이후까지 생존합니다. 이식된 배아는 발달 과정 중 수일 동안 생존 염색액의 색상을 유지합니다. 주입되지 않은 대조군 난자에서 유래한 배아는 예상대로 정상적인 모습을 보일 것입니다.

대조적으로, 예를 들어 beta catenin과 antisense oligos가 주입된 난자에서 유래한 배아는 중앙 집중적인 형태를 띠게 됩니다. 지금까지 배양액 내에서 조작된 난자로부터 배아를 얻는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때는 건강하고 완전히 성숙한 공여자 난자로 시작하고, 양질의 난자를 가진 수용 암컷을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 이 방법의 성공 여부는 난자 분리와 수술의 수행 속도와 상관관계가 있는 경향이 있습니다. 따라서 일관된 결과를 얻기까지는 어느 정도의 숙련 과정이 필요할 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.