Name: 주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 배아에서 주최자 및 동물 폴 explants의 해부와 세포 접착 분석 방법을. 이 기술은 발달생물학에서 세포 행동과 조직 형성 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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접착 챔버스 준비 (전날 사출 / 절개) 접착 분석 챔버스 당신은 종래의 복합 현미경 (무대 위 광학 찾아)이있다면, 그것은 낮은 높이 접착력 챔버는 다음과 같이 할 ncecessary입니다. 거꾸로 - 광학 현미경을 사용하는 경우, &quot;NUNC 연구소 - 테크 Chambered의 Coverglass은&quot;단지 사용하고, 단계 # 1 생략 수 있습니다 - 2. <ol><li> 40 X 24mm 커버 슬립에 &quot;언론 - 투 - 밀봉 실리콘 절연체&quot;중 하나를 첨부합니다. 단단히 깨끗한 benchtop에서 커버 슬립에 절연체를 눌러 절연체가 완전히 다른 공기 방울없이 연결되었는지 확인하기 위해 반대편에서보세요. </li><li> 선택 사항 : 소독하기 위해 드라이주기 왓먼 필터 종이 압력솥과 유리 페트리 접시에 부착 실 놔. RT에게 시원한 시간을 보내세요. </li></ol> 코팅 상공 회의소 <ol><li> sigmacoated 노란색 도움말을 사용하여 autoclaved 부착 챔버의 중심에 cadherin (10mg/ml) 또는 fibronectin (20mg/ml)의 솔루션을 작업의 200ml 비말 놔. 4 시간 RT에서 알을 품다. </li><li> cadherin이나 fibronectin 솔루션을 꺼내서하고 1.5ml 튜브에 전송할 수 있습니다. 이 솔루션은 다음 두 주 동안 활용할 수 있습니다. </li><li> 챔버를 차단하기 위해 MBS - H 1X의 4 % BSA의 500ml 분배. 1 시간 RT에서 알을 품다. </li><li> BSA 솔루션을 대기음. 두번 1X MBS - H의 500ml와 챔버를 씻으십시오. 두 번째 세척 후, (아니 완전히) MBS - H의 대부분을 기음, 4 º C.에서 밀폐된 용기에 보관 삼일 -이 유착 챔버은 다음 2 좋습니다. </li></ol> 해부와 동물 캡 Explants의 해리 <ol><li> 비 - autoclaved 매체 언젠가 dissociated 동물 캡 세포를 방해있는 작은 세균을 지니고 있듯이, autoclaved 1X MBS - H에서 희석 0.1x MBS - H에 주입된 배아를 품어. </li><li> 귀하의 샘플의 번호로 적어도 많은, 60mm 요리 1X 바쓰의 아가로 오스 접시와 CMF - MBS 아가로 오스의 번호판을 확인합니다. 1X 바쓰의 접시에 autoclaved 1X MBS - H 하거라. CMF - MBS 접시 들어, CMF - MBS의 10ml를 부어. </li><li> 배아가 무대 8.5이 될 때, 1X 바쓰의 접시에서 동물 모자를 해부 시작합니다. 10 - 샘플 당 15 explants은 실험을 위해 일반적으로 충분합니다. </li><li> CMF - MBS 판에 동물 캡 explants을 전송합니다. explants가 완전히 dissociated까지 60분 - 45 explants을 품어. 매 15 분 후에 부드러운 agitations은 분리 도움이 될 것입니다. </li></ol> 세포 접착 분석 <ol><li> 세포를 심는 것은 : 위의 섹션, 접착 분석 챔버 및 코팅 회의소의 단계에서 준비한 부착 실로 1X MBS - H의 500ml 분배. CMF - MBS 판에서 sigmacoated와 다진 - 오프 노란색 팁을 P200을 사용하여 부착 챔버에 dissociated 동물 캡 세포를 전송합니다. </li><li> 선택 사항 : 가능하면 신중하게 공기에 세포를 노출하지 않고 약 삼분의이 중간에하는 매체를 빨아. 거의 같은 매체가 충분한 칼슘이 포함되어 있는지 확인하기 위해 신선한 금액 MBS - H, +와 MG 2 +. 추가 </li><li> 90분 - 45 RT에서 알을 품다. 그들은 바닥의 표면에 부착하고 있는지 때때로 세포를 확인합니다. </li><li> 지금 당신은 현미경으로 세포의 사진을 찍을 수 있습니다. </li><li> 그리드 슬라이드 유리에 부착 챔버 놔. 그리드 슬라이드의 모서리에 부착 챔버의 모서리 중 하나를 맞춥니다. 백작과 여러 격자에 부착 세포의 수를 기록합니다. </li><li> 큰 플라스틱 양동이 (예 : 유리 섬유 복합 등)에서 MBS - H의 1L를 붓고. 부드럽게 부착 슬라이드 챔버는 양동이의 하단에 넣어. 저속 (- 60rpm 50)에서 5 분 동안 궤도 통에 회전합니다. </li><li> 이 섹션, 세포 접착 분석의 단계 # 5 한 것으로, 그리드 슬라이드의 같은 코너에 챔버의 동일한 모서리를 정렬, 그리드 슬라이드에 다시 부착 챔버 놔. 당신은 세탁하기 전에 계산이 같은 그리드에 부착 남아 세포의 수를 계산합니다. 세척 후 첨부 남아 세포의 비율을 계산합니다. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>Modified Barth&amp;rsquo;s medium: 1 L 레시피: 5.14 g NaCl 5 mg KCl 0.2 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0.2 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g HEPES, free-acid. NaOH로 pH를 7.4로 조절한다. 오토클레이브 멸균한다.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>이는 MBS-H의 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-free 버전이다. 500 mL 레시피: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1.19 g HEPES, free-acid. NaOH로 pH를 7.4로 조절한다. 오토클레이브 멸균한다.</td></tr><tr><td>1% agarose/1x Barth&amp;rsquo;s 플레이트</td><td></td><td></td><td></td><td>시료 수만큼 준비</td></tr><tr><td>1% agarose/CMF-MBS 플레이트</td><td></td><td></td><td></td><td>시료 수만큼 준비</td></tr><tr><td>E-Cadherin/Fc 키메라</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>0.1 mg의 고체 E-cadherin을 40% 글리세롤을 포함하는 100 µL의 1x MBS-H에 녹여 100x 마스터 스톡(1.0 mg/mL)을 제조한다. &amp;#8211;20 &amp;deg;C에 보관한다. 사용 직전에 1x MBS-H로 1/100 희석하여 10 µg/mL 작업 용액을 만든다. 시료당 200 µL의 작업 용액이 필요하다.</td></tr><tr><td>Fibronectin, 0.1% 용액</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>이 기제조 용액은 50x 스톡으로 사용할 수 있다. 사용 직전에 1x MBS-H로 1/50 희석하여 20 &amp;mu;g/mL 작업 용액을 만든다. 시료당 200 &amp;mu;L의 작업 용액이 필요하다. 고체 Fibronectin은 스톡 용액 제조 시 0.1% 농도에서 용해시키기 어렵기 때문에 권장하지 않는다. 가격은 더 비싸지만, 일관된 결과를 얻기 위해서는 이 기제조 0.1% 용액을 사용하는 것이 더 좋다.</td></tr><tr><td>4% BSA/MBS-H</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>BSA: 분자 생물학 등급 fraction V</td></tr><tr><td>Sigmacoted yellow tips</td><td>도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>No.1 커버슬립</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm 또는 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Press-to-seal 실리콘 인슐레이터</td><td>도구</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>깊이 2.5 mm x 직경 20 mm</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>슬라이드당 2개 웰</td></tr><tr><td>그리드 슬라이드 글라스</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>또는 세포 계수용 Finder graticule</td></tr></tbody></table>

주최자 및 동물 폴 explants xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

자기 눈썹 만든 전문 해부 도구 -이 비디오는 눈썹 나이프의 사용을 포함하여 Xenopus laevis의 배아에서 주최 및 동물 극 explants의 준비에 사용되는 기술을 설명합니다. 유착 분석을 조립을위한 프로토콜은 또한 주요 유착 분자의 존재에 대한 프로브가 표면 주최자 또는 적절한 개발을위한 중요 동물 극 세포에 존재하는, 주어진 것입니다.

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

안녕하세요, 저는 Sochi Agata입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 발달 및 세포 생물학과의 Dr. Ken Cho 연구실에서 박사후 연구원으로 근무하고 있습니다. 오늘은 아프리카 톱니개구리(Xenopus) 배아의 동물극 캡 외배엽(animal cap explant) 또는 형성체 외배엽(organizer explant)의 박리 및 부착 분석법을 보여드리겠습니다.이 절차는 박리된 조직 유래 세포의 세포 접착 특성과 세포 형태를 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 본 절차에는 제노푸스(xenopus) 개구리 배아에서 특정 조직을 박리하고, 이를 칼슘 및 마그네슘이 없는 배지에서 해리시킨 후, 세포 접착 분자가 코팅된 슬라이드 글라스 위의 칼슘 및 마그네슘 함유 조건으로 해리된 세포를 옮기는 과정이 포함됩니다. 이를 통해 본 절차에서 박리된 세포의 세포 거동, 세포 이동 및 접착 특성을 연구할 수 있습니다.자, 배아 박리 및 접착 분석의 전체 과정에서는 먼저 특수 도구를 사용합니다. 이것은 Ca²⁺/Mg²⁺-free 1x PBS, 1% agarose가 코팅된 것입니다. 그리고 바로 여기, 배아를 박리할 때 사용하는 1x PBS, 1% agarose 코팅 플레이트가 있습니다.그리고 이것은 핀셋 외의 특수 해부 도구인 해부용 칼입니다. 눈썹 칼이라고 불리는데, 특이한 이름이지만 실제로 얼굴의 눈썹을 다듬는 도구로 만들어진 것입니다. 그리고 이를 파스퇴르 피펫의 끝부분에 부착하여 사용합니다.그리고 여기 있는 다른 도구는 헤어 루프라고 하며, 이는 파스퇴르 피펫 끝에 머리카락으로 루프를 만든 것입니다. 이번에는 이 도구를 사용하지 않았지만, 일부 사람들은 부착 분석(adhesion assay) 시 아이볼 나이프보다 이 헤어 루프를 더 선호하기도 합니다. 저는 슬라이드 글라스 위에 부착하여 부착 분석 챔버를 만들기 위해 실리콘 고무 절연체를 사용합니다.먼저 배아에서 난막을 분리하십시오. 이 부분이 난막입니다. 그런 다음 동물극 쪽의 접착 부위를 절개하십시오.이것은 동물 프로젝트이므로 필요하지 않습니다. 배아를 뒤집으면 여기 투명한 배측순(dorsal lip)이 보일 것입니다. 아주 아름답습니다.그 다음 안구용 나이프로 배측 순(dorsal lip)의 측면에 찌르고, 반대쪽 측면도 찌른 후 배측 순 바로 아래의 이 조각을 절개합니다. 이 조각에는 조직화된 배아와 주변 진피가 포함되어 있습니다. 이를 뒤집어 복부

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 분석은 commissural axons를 방향에 대한 신호 분자의 능력, 여기에 본 Morphogenetic의 단백질 7 (BMP7)을 평가합니다. 배아 등의 척수의 explant는 COS 세포의 secreting 후보 성장 요인의 집계에 인접한 양식입니다. explant 내에서 성장 Reoriented commissural axons은 immunohistochemistry에 의해 시각입니다.

배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금

동물 모자 overexpressing 유전자 제품 (들)은 개발의 측면에 이식...

에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis</em

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

이 프로토콜은는 Xenopus laevis의의 neurulas에서 premigratory 두개골 신경 능선 (NC)를 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 외식은 피브로넥틴 및 체외 배양에 도금, 또는 다시 호스트 배아에 이식 할 수 있습니다. 이 기술은 NC 상피 - 투 - 중간 엽 이행, 이주 및 분화의 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

의 해부<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 신경 크레스트<em&gt; 시험관</em&gt; 이식편 문화 또는<em&gt; 생체</em&gt; 이식

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

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제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

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우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 분리된 깊은 자궁 근세포세포로부터 점도 상피 오르가노이드를 개발하는 간단한 프로토콜을 기술합니다. 다능성 선조는 상피 잔잔 세포 전구체를 재생하고 오르가노이드 표면의 세포 전이의 개시 및 진행을 실시간으로 추적할 수 있도록 합니다.

제노푸스 배아 세포에서 점동 상피 오르가노이드: 생성, 배양 및 고해상도 라이브 이미징

배우세요 Xenopus laevis 배아에서 주최자 및 동물 폴 explants의 해부와 세포 접착 분석 방법을. 이 기술은 발달생물학에서 세포 행동과 조직 형성 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

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