DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용

본 영상에서는 DNA 미스매치 복구 단백질인 MutS2-MutS6의 반응 속도론을 측정하기 위한 두 가지 정지 흐름(stopped flow) 방법을 소개합니다. MutS2-MutS6는 DNA의 염기쌍 미스매치를 인식하며, ATP를 에너지원으로 사용하는 반응을 통해 복구 신호를 보냅니다. 첫 번째 방법은 DNA의 GT 미스매치 인접 부위에 위치한 2-아미노퓨린(2-aminopurine) 염기의 형광 증가를 통해 MutS2-MutS6의 DNA 결합을 측정하는 방식입니다. 반응물들은 정지 흐름 장치에서 혼합되며, 시간에 따른 변화를 모니터링하여 속도 상수를 결정합니다.

두 번째 방법은 형광 인산 결합 단백질 리포터를 사용하여 MutS2-MutS6의 ATPase 활성을 측정합니다. 반응물들을 정지 흐름(stopped flow) 장치에서 혼합하고 시간에 따라 모니터링합니다. ATP 가수분해 및 인산 방출의 속도 상수를 결정하기 위해, 결과로 얻은 반응 속도론적 데이터를 통해 DNA 미스매치 복구에서 MutS2-MutS6의 작용 기전을 규명합니다.

안녕하세요, 저는 Wesleyan University 분자생물학 및 생화학과의 MONI 연구실 소속 Noah Biro입니다. 안녕하세요, 저 또한 Wesleyan University의 Man 연구실 소속인 DJ J입니다. 그리고 저는 JI 연구실의 Chris Dset입니다.

오늘은 밀리초 단위의 시간 규모에서 반응 속도론을 모니터링하기 위한 두 가지 형광 기반 분석법을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 방법들을 사용하여 DNA 복구 단백질인 MutS(MutS homolog 6)가 DNA의 미스매치 염기쌍에 어떻게 결합하여 복구를 시작하는지 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하기 전에 필요한 단백질 및 DNA 시약을 준비해야 합니다. 이전에 E. coli에서 과발현시키고 이온 교환 및 친화성 크로마토그래피로 정제한 s visier mush two mush six 단백질을 준비하십시오. DNA 시약을 생성하기 위해 형광 뉴클레오타이드 유사체인 2-아미노퓨린으로 수식된 단독 가닥 DNA를 구매하고, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 가닥을 정제한 후, 이를 어닐링하여 GT 미스매치에 2-아미노퓨린이 인접한 미스매치 이중 가닥 DNA를 생성하십시오.

마찬가지로, 변형되지 않은 단일 가닥 DNA로부터 표지가 되지 않은 DNA를 준비합니다. 여기에 사용된 DNA 서열은 본 프로토콜의 서면 부분에서 확인할 수 있습니다. 전체 과정 동안 형광 불순물을 최소화하기 위해 고순도 화학 시약을 사용하여 실험의 무결성을 높이십시오.

또한, 정지 흐름 장치를 막을 수 있는 입자들을 제거하기 위해 모든 스탁 용액을 0.2 micrometer 멤브레인으로 여과하십시오. DNA 결합 실험을 준비하려면 샘플당 최종 부피 400 microliters로 샘플을 준비하며, 이는 약 10회의 키네틱 트레이스 분석에 충분한 양입니다. 샘플은 얼음 위에 보관하십시오.

단백질 활성을 유지하기 위해, DNA 샘플은 0.12 µM, Mush2Mush6 샘플은 DNA 결합 버퍼 내에서 0.8 µM 농도로 준비하십시오. 이렇게 하면 스톱플로우(stopped flow)에서 1:1로 혼합한 후 최종 농도는 0.06 µM DNA와 0.4 µM Mush2Mush6가 됩니다.

정지 유동(stopped flow) 장치는 구동 모터를 사용하여 반응물 용액을 구동 주사기에서 혼합 장치로 동시에 빠르게 밀어 넣습니다. 혼합된 용액은 데이터 수집을 위해 관찰 셀로 흘러 들어갑니다. 장치를 준비하려면, 먼저 컴퓨터와 컨트롤러의 전원이 꺼져 있는지 확인하십시오.

그 다음 순환식 항온조(circulating water bath)를 켜서 램프를 냉각하고, 램프를 점등합니다. 단색화 장치(monochromator)를 원하는 들뜸 파장인 315 nanometers로 설정합니다. 2-아미노퓨린의 경우, SL 폭을 원하는 값으로 설정합니다.

광전자 증배관(PMT)에 350 nm 차단 필터를 장착하여 두 아미노 퓨린 형광 신호를 수집합니다. 컨트롤러와 컴퓨터의 전원을 켭니다. 이어서 순환식 항온 수조의 전원을 켭니다.

이는 실험 동안 원하는 온도의 반응성을 유지하기 위해 드라이브 시린지 주변의 워터 재킷을 채우는 과정입니다. 마지막으로, P-M-T-H-V 제어 메뉴에서 스톱 플로우 프로그램을 실행하십시오. PMT 전압을 설정하는데, 초기에는 PMT 감도를 조절하기 위해 가변적으로 설정할 수 있으나 이후에는 일정하게 유지해야 합니다.

실험 중에 암전류(dark current)를 측정하여 배경 전기 노이즈를 보정하십시오. 다음으로, 정지 유동(stopped flow) 구동 주사기와 관찰 셀을 세척하십시오. 시료 로딩 밸브를 로드 위치로 설정하십시오.

1mL 시린지에 탈이온 여과수를 채웁니다. 시린지를 구동 시린지 아래에 위치한 로딩 포트에 연결하고 두 시린지 사이에 물을 밀어 넣습니다. 각 시린지마다 이 과정을 두 번씩 반복합니다.

실험에 사용할 구동 시린지를 준비하십시오. 그런 다음 구동 시린지에 물을 채워 관찰 셀을 세척하십시오. 시료 로딩 밸브를 fire 위치로 전환하십시오.

주사기 드라이브 조정 명령을 사용하여 드라이브 플레이트를 내리고 관찰 셀을 통해 배출 라인으로 물을 밀어 넣으십시오. 이때 플런저를 드라이브 주사기의 끝까지 밀지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 드라이브 플레이트를 올리고 밸브를 로드 위치로 전환하십시오.

반응 버퍼로 한 번 세척하고 시린지를 비웁니다. DNA 결합 실험을 시작하려면, 각 샘플을 튜브에서 새 1 mL 시린지로 옮깁니다. 각 시린지를 로딩 포트에 연결하고 용액을 드라이브 시린지로 밀어 넣습니다.

두 시린지 사이의 용액을 간헐적으로 밀어내어 공기 방울을 제거합니다. 그 다음, 드라이브 플레이트가 드라이브 시린지의 상단에 닿을 때까지 내립니다. 데이터 수집을 위해 시간 설정 채널 창을 엽니다.

데이터 분석의 데이터 수집 채널 모드와 수집할 트레이스 수를 선택하십시오. 1000개의 데이터 포인트가 수집될 데이터 수집 시간을 입력하십시오. 다음으로, 밸브를 fire 위치로 설정하고 데이터 수집 버튼을 클릭하십시오.

이 동작은 mush 2, mush 6 및 DNA의 혼합을 시작하며, 이후 반응액이 관찰 영역으로 진입합니다. 2-아미노퓨린으로부터 발생하는 세포 형광 방출을 모니터링합니다. 고품질의 데이터 세트를 얻기 위해 최소 5개의 키네틱 트레이스를 수집하고, 실험이 완료되면 파일을 저장하십시오.

각 데이터 파일을 열고 여러 개의 키네틱 트레이스를 평균화합니다. 그런 다음 평균 데이터 파일을 저장하고 분석을 위해 그래프 작성 프로그램으로 내보냅니다. 마지막으로, 램프 전원을 끄고 시린지와 관찰 셀을 물로 충분히 세척합니다.

그런 다음 순환 수조를 제외한 나머지 장비의 전원을 끕니다. 램프를 냉각시키기 위해 수조를 15분 더 가동합니다. Mismatch 2~6이 미스매치 DNA에 결합하는 속도론적 데이터는 단일 지수 함수로 가장 잘 설명되며, 이는 $10^7 \text{ M}^{-1}\text{s}^{-1}$ 수준의 빠른 결합 속도를 나타냅니다. 유사한 stopped-flow 실험을 통해 $\text{mush 2-6}$ 미스매치 DNA 복합체의 해리 속도를 구한 결과, $0.01$에서 $0.02 \text{ s}^{-1}$로 매우 느리게 일어나는 것으로 나타났습니다.

이 결과들은 DNA 복구 반응 과정에서 MutS2-MutS6가 미스매치된 염기쌍에 결합하는 속도와 친화도를 직접적으로 측정해 줍니다. 다음으로, MutS2-MutS6의 ATPase 활성을 측정하기 위해 정지 유동(stopped flow) 실험을 수행하겠습니다.

본 분석의 전-정상 상태 조건 하에서는, 배경 인산염 수준을 최소화하기 위해 단백질 및 DNA 정제를 포함한 시약 조제의 모든 단계에서 유리의 사용을 반드시 피해야 합니다. e coli에서 정제하고 MDCC 형광체로 표지한 인산염 결합 단백질(phosphate binding protein) 또는 PBP는 ATP 가수분해 후의 인산염 방출을 측정하는 리포터로 사용됩니다. MDCC-PBP는 전-정상 상태 ATP 가수분해 및 인산염 방출 역학을 측정하는 강력한 리포터입니다. 이는 인산염과 빠르게 그리고 높은 친화력으로 결합하며, 그 결과 MDCC 형광이 크게 증가합니다.

4 µM Mush, 2 Mush 6 단백질을 6 µM 미스매치 DNA(mismatched DNA) 포함 또는 제외하여 샘플을 준비합니다. 또 다른 샘플에는 오염된 인산을 제거하기 위해 갓 용해한 1 mM HEP와 20 µM M-D-C-C-P-V-P를 준비합니다. 샘플에 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase)와 7-메틸구아닌(7-methyl guanine)을 첨가하고 얼음 위에서 최소 20분 동안 인큐베이트합니다.

앞서 설명한 대로 정지 흐름(stopped flow) 장치를 준비하십시오. 또한, 퓨린, 뉴클레오사이드, 포스포릴 및 7-메틸구아닌을 사용하여 구동 시린지에서 인산염 오염물을 닦아내십시오. 20분 동안 배양하십시오. 여기 파장을 425 nm로 설정하고, M-D-C-C-P-B-P 형광 검출을 위해 PMT에 450 nm 컷오프 필터를 사용하십시오.

앞서 설명한 대로 드라이브 시린지에 샘플을 로드합니다. 데이터 수집 파라미터를 설정하고 데이터 수집(collect data)을 클릭하여 mush two mush six를 TP 및 M-D-C-C-P-B-P와 혼합하여 mush two mush six에 의한 인산염 방출과 그에 따른 M-D-C-C-P-P-P 형광의 시간 경과에 따른 증가를 모니터링합니다. 고품질의 데이터 세트를 얻기 위해 최소 5개의 키네틱 트레이스를 수집하고 파일을 저장합니다. 앞서 설명한 대로 여러 키네틱 트레이스의 평균을 내고 분석을 위해 데이터 파일을 내보냅니다. 인산염 농도와 M-D-C-C-P-P-P 형광 사이의 선형 관계를 결정하기 위해 검정 곡선을 준비합니다. 먼저 스톱 플로우(stopped flow) 내에서 동일한 실험 조건 하에 M-D-C-C-P-P-P를 다양한 인산염 농도와 혼합합니다.

그런 다음 검정 곡선을 위해 최대 M-D-C-C-P-P-P 형광을 각 인산염 농도에 대해 도식화하고, 그 기울기를 사용하여 mush two mush six 반응의 인산염 농도를 결정합니다. 인산염 농도를 시간에 대해 도식화하고 데이터를 지수 함수 및 선형 함수에 피팅하십시오. 이 함수는 전정상 상태(pre-steady state)의 ATP 가수분해 및 인산염 방출의 버스트 단계와 그 뒤를 잇는 반응의 선형 정상 상태 단계를 설명합니다. 속도론적 데이터는 mush two mush six가 ATP를 가수분해하며, 첫 번째 촉매 회전(catalytic turnover)에서 1.4 s⁻¹의 속도로 인산염을 빠르게 방출함을 보여줍니다.

그 후 반응 단계가 느려지면서 이후의 회전율은 7배 더 느린 0.2 per second의 정상 상태 촉매 상수로 제한됩니다. 하지만 Mush to Mush 6가 미스매치 DNA에 결합하면, ATP 가수분해와 인산 방출의 버스트 현상이 억제됩니다. 이러한 결과는 미스매치 염기쌍과 DNA에 결합함에 따라 DNA Mush too Mush 6가 ATP 결합 상태로 전환된다는 것을 직접적으로 보여줍니다.

이 전환은 DNA 복구 반응에서 매우 중요한 단계입니다. 저희는 방금 정지 유동(stop flow) 장치를 사용하여 반응의 속도를 실시간으로 측정하는 방법을 보여드렸습니다. 이러한 측정은 MutSα, MutSβ의 작용 기전과 DNA 미스매치 복구에 대한 우리의 이해를 증진시켰습니다.

이러한 유형의 실험을 수행할 때는 매우 순수한 DNA와 단백질을 포함하여 고품질의 시약을 사용하는 것이 중요하며, 특히 ATP 분석 시 인산 오염이 발생하지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.