Name: DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 배우세요 정지 흐름 속도론 방법을 사용하여 Msh2-Msh6 DNA 불일치 복구 단백질의 결합 및 ATPase 활성을 측정하는 기술입니다. 이 방법은 DNA 복구 메커니즘 연구에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NSF 경력 수상 (MMH), 배리 M. 골드 워터 장학금 (FNB)과 ASBMB 학부 연구 수상 (CWD)에 의해 지원되었다. PBP 이상의 표현에 대한 복제가 친절하게 박사가 마틴 웨브 (MRC, 영국)에 의해 제공되었다.

<ol><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transient-state+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li>
<li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+KAE+%22Kinetic+analysis+of+macromolecules%22">Kinetic analysis of macromolecules</a>. , Oxford University Press. (2003).</li>
<li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li>
<li>Lamers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+DNA+mismatch+repair+protein+MutS+binding+to+a+G+x+T+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch.</a> Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).</li>
<li>Warren, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+MutSalpha+DNA+lesion+recognition+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex.</a> Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).</li>
<li>Kunkel, T. A. &amp, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).</li>
<li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+mismatch-repair+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).</li>
<li>Hsieh, P., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+mismatch+repair%3A+Molecular+mechanism%2C+cancer%2C+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).</li>
<li>Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+nucleotides+on+MutS-DNA+binding+kinetics+clarify+the+role+of+MutS+ATPase+activity+in+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair.</a> J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).</li>
<li>Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Msh2+and+Msh6+subunits+to+the+asymmetric+ATPase+and+DNA+mismatch+binding+activities+of+Saccharomyces+cerevisiae+Msh2-Msh6+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).</li>
<li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+recognition-coupled+stabilization+of+Msh2-Msh6+in+an+ATP-bound+state+at+the+initiation+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair.</a> Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).</li>
<li>Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+and+analysis+of+eukaryotic+multiprotein+complexes+in+Escherichia+coli+using+a+dual-vector+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy.</a> Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).</li>
<li>Zhai, J., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li>
<li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li>
<li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li>
<li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2%28ATP%29-Msh6%28ATP%29+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li>
</ol>

여기에 설명된 DNA 불일치 바인딩 단백질의 예제는 생물 학적 분자의 메커니즘을 연구에 대한 과도 운동 방법의 성능과 유틸리티를 보여줍니다. 단일 매출 시간 규모에서 중지 흐름 측정 일치하지 않는 기본 쌍과 반응 9 긴 단백질 X의 DNA 복합 형성에 Msh2 - Msh6 단백질의 신속하고 구체적인 구속력을 위해 모호하지 않은 증거를 제공했습니다. 또한, ATPase 활동 중단 흐름 (그리고 잃게 흐름) 분석은 구속력이 일치하지 않는 DNA 11,16 후 ATP - 바운드 형태로 Msh2 - Msh6 전환에 대한 직접적인 증거를 제공했습니다. 이 스위치는 DNA 복구 17,18 신호를 가상입니다. 보완 고해상도 구조 데이터와 함께 이러한 고해상도 운동 데이터는 macromolecular 기능의 이해를 발전하기 위해 필수적입니다.

dna 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

이 접근법은 macromolecular 기능을 적용 활성 사이트 농도 및 내장 속도 상수를 포함 기계론의 정보를 산출 이후 과도 운동 분석, 생물 학적 macromolecules의 동작을 이해하는 데 필수입니다. 정상 상태 측정은 전체 촉매 효율과 특이성을 낼 반면, 효소의 경우, 예를 들어, 과도하거나 사전 안정된 상태 측정 식별 및 반응 경로에서 개별 이벤트를 특징. 이러한 단백질 - 단백질 또는 단백질 리간드 상호 작용과 속도 - 제한 conformational 변화에 따라 개별 사건들은 종종 밀리초 timescale 발생하고, 정지 - 흐름과 화학 잃게 흐름 방법으로 직접 측정할 수 있습니다. 이러한 형광으로 광 신호를 감안할 때 중지 흐름은 제품 릴리스 및 촉매 매출 1,2에 바인딩 기판에서 모니터링 반응 진행에 대한 강력하고 접근 도구로 제공하고 있습니다. 여기, 우리는 정지 흐름 속도론의 응용 프로그램 Msh2 - Msh6의 행동의 메커니즘,베이스 - 페어 불일치 및 DNA와 신호 불일치 복구 (MMR) 3-5의 삽입 / 삭제 루프를 인식 진핵세포의 DNA 수리 단백질을 프로브에 신고. 이렇게에 따라서 Msh2 - Msh6 증가 정도의 세 주문 (오류 주파수 ~ 10 -6 to10 -9 기지에서 감소)에 의해 DNA 복제의 정확성하고 게놈 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. 되지 놀랍게도, 결함이있는 인간 Msh2 - Msh6 기능이 유전이 아닌 polyposis 결장암 및 기타 산발적 암 6-8와 연결되어 있습니다. 이 중요 DNA의 신진 대사 단백질의 행동의 메커니즘을 이해하기 위해서, 우리는 일치하지 않는 DNA뿐만 아니라 ATPase 활동과 Msh2 - Msh6 상호 작용의 역학을 탐색하는 연료 MMR에서의 행동. T 불일치 및 모니터링 실시간으로 2 aminopu​​rine의 형광의 발생 증가 : DNA 바인딩은 빠르게 G에 인접한 2 aminopu​​rine (2 - AP = 연합 뉴스) 형광단를 포함하는 DNA와 Msh2 - Msh6를 혼합하여 측정됩니다. T (2 - AP = 연합 뉴스) 레이블이 지정되지 않은 트랩 DNA와 시간 9 이상 형광의 모니터링 감소와 불일치 단지 : DNA 분리는 사전에 형성 Msh2 - Msh6 G를 혼합하여 측정됩니다. 사전 꾸준한 상태 ATPase의 속도론은 7 diethylamino - 3 - ((((2 - maleimidyl) 에틸) 아미노) 카르보닐) coumarin) - 라벨 바인딩 인산염의 인산 바인딩 단백질 (MDCC - PBP) (의 형광의 변화에​​ 의해 측정 PI)는 ATP 가수 분해 9,10 다음 Msh2 - Msh6 발표. T 불일치와 긴 Msh2 - Msh6 G 형성 : 데이터는 G에 Msh2 - Msh6의 급속한 결합 밝히지 T 복잡한을하는 ATP - 바운드 형태의 단백질이 ATP의 가수 분해 및 안정화의 억제에 차례 결과에 . 반응 속도론은 가설에 대한 명확한 지원을 제공하는 ATP - 바운드 Msh2 - Msh6 신호 이중 나선 구조에 일치하지 않는 기본 쌍을 결합에 DNA 수리가. F. 노아 비로 및 지에 Zhai 똑같이이 문서에 기여.

Msh2 - Msh6는 DNA의 복제 오류의 복구를 시작 책임이 있습니다. 여기 우리는이 중요한 단백질의 작동 방식 이해 향해 과도 속도론의 접근 방식을 제시한다. 보고서는 결합된 DNA 바인딩과 DNA 수리의 행동의 Msh2 - Msh6 메커니즘을 기본 ATPase의 속도론을 측정하는 정지 흐름 실험을 보여줍니다.

DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용

과도 상태 속도론 분석(Transient kinetic analysis)은 생체 고분자의 작동 원리를 이해하는 데 필수적이며, 이 방법은 기전적...

본 영상에서는 DNA 미스매치 복구 단백질인 MutS2-MutS6의 반응 속도론을 측정하기 위한 두 가지 정지 흐름(stopped flow) 방법을 소개합니다. MutS2-MutS6는 DNA의 염기쌍 미스매치를 인식하며, ATP를 에너지원으로 사용하는 반응을 통해 복구 신호를 보냅니다. 첫 번째 방법은 DNA의 GT 미스매치 인접 부위에 위치한 2-아미노퓨린(2-aminopurine) 염기의 형광 증가를 통해 MutS2-MutS6의 DNA 결합을 측정하는 방식입니다. 반응물들은 정지 흐름 장치에서 혼합되며, 시간에 따른 변화를 모니터링하여 속도 상수를 결정합니다.두 번째 방법은 형광 인산 결합 단백질 리포터를 사용하여 MutS2-MutS6의 ATPase 활성을 측정합니다. 반응물들을 정지 흐름(stopped flow) 장치에서 혼합하고 시간에 따라 모니터링합니다. ATP 가수분해 및 인산 방출의 속도 상수를 결정하기 위해, 결과로 얻은 반응 속도론적 데이터를 통해 DNA 미스매치 복구에서 MutS2-MutS6의 작용 기전을 규명합니다.안녕하세요, 저는 Wesleyan University 분자생물학 및 생화학과의 MONI 연구실 소속 Noah Biro입니다. 안녕하세요, 저 또한 Wesleyan University의 Man 연구실 소속인 DJ J입니다. 그리고 저는 JI 연구실의 Chris Dset입니다.오늘은 밀리초 단위의 시간 규모에서 반응 속도론을 모니터링하기 위한 두 가지 형광 기반 분석법을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 방법들을 사용하여 DNA 복구 단백질인 MutS(MutS homolog 6)가 DNA의 미스매치 염기쌍에 어떻게 결합하여 복구를 시작하는지 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하기 전에 필요한 단백질 및 DNA 시약을 준비해야 합니다. 이전에 E. coli에서 과발현시키고 이온 교환 및 친화성 크로마토그래피로 정제한 s visier mush two mush six 단백질을 준비하십시오. DNA 시약을 생성하기 위해 형광 뉴클레오타이드 유사체인 2-아미노퓨린으로 수식된 단독 가닥 DNA를 구매하고, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 가닥을 정제한 후, 이를 어닐링하여 GT 미스매치에 2-아미노퓨린이 인접한 미스매치 이중 가닥 DNA를 생성하십시오.마찬가지로, 변형되지 않은 단일 가닥 DNA로부터 표지가 되지 않은 DNA를 준비합니다. 여기에 사용된 DNA 서열

application-stopped-flow-kinetics-methods-to-investigate-mechanism

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

8 oxoguanine의 DNA glycosylase의 glycosylase 활동 시간 코스 제품의 형성과 선형 정상 상태 위상 버스트를 전시 이상성입니다. 각각 8-oxoguanine 및 제품 DNA에서 glycosylase 릴리스의 절제에 해당 담금질 흐름 기술, 버스트 및 정상 상태 속도를 측정 할 수 있습니다, 활용.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

여기에서는 뉴클레오티드 절제 복구 시스템을 예로 들어 단일 분자 AFM 이미징을 통한 다양한 DNA 병변 인식 접근 방식에 대한 연구를 시연합니다. DNA 및 단백질 시료 준비 절차와 AFM 실험을 위한 실험 및 분석 세부 사항에 대해 설명합니다.

핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

이 프로토콜의 목표는 플라스 미드 DNA에 정의 된 DNA-단백질 crosslinks의 수리 계량. Lesioned 플라스 미드는 받는 사람 포유류 세포 선 및 여러 시간 포인트 후 transfection에 수확 하는 저 분자 무게에 페. DNA 복구 속도 스트랜드 특정 뇌관 연장 정량 뒤를 사용 하 여 정량.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

효모의 유전자 연구는 세포의 DNA 대사에 인간 유전자의 분자 및 세포 기능을 조사하기 위해 고용 수 있습니다. 방법은 인간의 유전 특성에 대해...

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

배우세요 정지 흐름 속도론 방법을 사용하여 Msh2-Msh6 DNA 불일치 복구 단백질의 결합 및 ATPase 활성을 측정하는 기술입니다. 이 방법은 DNA 복구 메커니즘 연구에 필수적입니다.

DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용

더 많은 동영상 탐색