2 차원 가보 필터 기반으로 광학 현미경 스캐터

이 비디오에서는 광학 산란 현미경을 사용하여 세포사멸 중 미토콘드리아 단편화를 정량화합니다. 광학 산란 현미경 검사는 일반적으로 이 프로토콜에서 형광을 필요로 하지 않지만, 검증 목적으로 형광 이미지를 획득합니다. 이미징 시스템 설정 후 세포는 MIT tracker green으로 라벨링되고 stor sporin으로 처리되어 세포사멸을 유도합니다.

광학 데이터를 획득하여 2시간 이내에 세포 소기관의 방향 변화를 감지합니다. 미토콘드리아 단편화의 시작은 광학 산란 데이터를 사용하여 측정할 수 있으며, 이는 세포 내 입자의 배향 정도가 감소함을 보여줍니다. 그런 다음 광학 산란 데이터를 미토콘드리아를 포함하는 형광 영역과 연관시켜 데이터를 검증합니다.

안녕하세요, 저는 럿거스 대학교(Rutgers University) 의생명공학과 바이오 광학 연구소(Bio Optics Laboratory)의 나다 부스타니(Nada Bustani)입니다. 저는 Bio Optics Lab의 Rob Pak이고, Bio Lab의 Deen입니다. 오늘은 형광 염료에 의존하지 않는 방법을 사용하여 세포 내 형태학적 역학을 정량화하는 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 기술을 사용하여 세포사멸 또는 세포 사멸 프로그램 중 세포 내 구조의 동적 변화를 연구합니다. 시작하겠습니다. 장갑을 낀 손을 70% 에탄올로 소독하여 이 절차를 시작하십시오.

그런 다음 준비된 100 나노 몰 스톡 용액 miot tracker green과 prewarm, BAEC 세포 배양 배지를 불을 끈 후드에 놓고 모든 표면을 살균합니다. 다음으로, 후드 아래의 커버 유리에 세포가 도금된 6개의 우물 배양 접시를 놓습니다. 진공 라인에 연결된 페이스트 피펫을 사용합니다.

웰에서 세포 배지를 제거합니다. 그런 다음 즉시 2밀리리터의 라벨링된 배지를 각 웰에 추가하여 세포를 라벨링합니다. 미토콘드리아. 조직 배양 플레이트를 덮어 실내 직사광선에 노출되지 않도록 하고 세포를 신속하게 배양기에 다시 넣습니다.

세포가 배양하는 동안 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 광학 설정을 준비하고 먼저 수은 아크 cl을 켭니다.amp. 그런 다음 컴퓨터 현미경 카메라를 켜고 회전 디퓨저에 디지털 마이크로 미러 장치 또는 DMD를 레이저로 꽂습니다.

다음으로, 현미경 접안렌즈를 통해 광학 발사가 정렬되어 있는지 확인합니다. 시야는 레이저 광에 의해 밝게 조명되어야 합니다. 샘플을 로드하려면 63 x 오일 이멀젼 대물렌즈가 완전히 내려가는 동안 이멀젼 오일 1-2방울을 떨어

그런 다음 무대에 그라디(gradi)라고 하는 10마이크로미터 간격의 일정한 선 그리드로 구성된 슬라이드를 장착하고 오일이 초점을 잡을 수 있도록 대물렌즈를 올립니다. 다음으로, 콘덴서 필드의 육각형 가장자리에 초점을 맞춥니다. 중앙 Kohler 조명에 정렬되도록 중지합니다.

육각형 가장자리는 접안렌즈의 중앙에 있어야 하며 초점이 선명해야 합니다. 그런 다음 콘덴서 필드 정지 위치 손잡이를 사용하여 중심, 콘덴서 필드를 사용하여 시야를 정지합니다. IP lab을 시작하고 설정을 입력하여 카메라를 작동합니다.

카메라가 프레임 전송 모드로 설정되어 있는지 확인합니다. acquire focus 명령을 실행하여 실시간 미리보기를 시작합니다. 그런 다음 인덱스 접두사와 이미지가 저장될 파일 위치를 설정합니다.

다음으로 RS 이미지를 시작합니다. 쿨 스냅 카메라를 작동하기 위한 설정을 지정합니다. 클럭 모드는 정상으로 설정해야 합니다.

DMD 소프트웨어를 시작합니다. script 메뉴에 dark field iris를 배치합니다. 그런 다음 load and reset을 클릭합니다.

스크립트를 수동으로 실행하려면 뷰포트의 microscope optiv bar를 LSM으로 설정합니다. 이렇게 하면 정렬된 광학 장치의 DMD를 통해 이미지가 전송됩니다. 암시야 이미지를 Cascade five 12 카메라의 CCD에 투사합니다.

암시야 이미지는 IP 랩의 실시간 미리보기에 나타나야 합니다. 필요한 경우 실시간 미리보기에서 이미지의 초점을 맞춥니다. 이미지에서 최소 10, 000 카운트의 신호를 보장할 수 있을 만큼 노출 시간을 충분히 높게 설정하십시오.

그런 다음, 획득 후 acquire single 명령을 사용하여 시야의 스냅샷을 만듭니다. 인덱스로 저장 명령을 사용하여 이미지를 디스크에 저장합니다. GTI의 이미지는 시야의 크기를 측정합니다.

이제 GTI 샘플을 이동하여 시야를 벗어나고 배경만 보이도록 합니다. 최소 5, 000 카운트를 획득하기에 충분한 노출 시간으로 필드의 배경 이미지를 캡처합니다. 이 이미지는 필터링되지 않은 이미지의 배경 빼기에 도움이 됩니다.

이제 배경의 Gabor 필터링된 이미지를 얻으려면 Gabor Filter Bank 스크립트를 DMD 제어 소프트웨어에 로드합니다. 전체 스크립트를 실행하여 필터를 DMD의 온보드 메모리에 버퍼링합니다. 전체 스크립트가 버퍼링되면 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.

DMD 소프트웨어 내의 시작 및 중지 마커를 사용하여 하나의 Gabor Like 필터에 해당하는 한 세트의 필터만 한 번에 로드되도록 합니다. 스크립트를 실행하여 배경의 필터링된 이미지를 가져옵니다. 라이브 이미지 미리보기가 어두운 필드에서 필터링된 이미지로 변경되어야 합니다.

해당 필터의 경우 디스크에서 IP lab의 획득 스크립트를 엽니다. 노출 시간을 조정하여 최소 2000개의 카운트가 획득되도록 합니다. DMD 스크립트가 실행 중일 때 IP Lab에서 실시간 미리보기를 취소하고 획득 스크립트를 실행합니다.

이렇게 하면 자동으로 인덱스를 획득하고 필터링된 이미지를 디스크에 저장합니다. 첫 번째 이미지를 가져오면 DMD에서 실행 중인 스크립트를 중지합니다. 스크립트에서 사용된 명령을 삭제합니다.

그런 다음 다음 필터 세트의 시작과 끝에 있는 시작 및 중지 마커를 교체합니다. 전체 필터 뱅크가 사용되고 필터링된 모든 이미지가 획득 및 저장될 때까지 IP 랩에서 획득을 반복합니다. 실험실 벤치 탑에 납땜 인두를 꽂고 L 15 매체를 섭씨 37도까지 가열하여 셀을 도금 할 준비를합니다.

종이 타월과 Kim 물티슈로 작업대를 만들어 엎질러진 매체를 흡수하고 해당 영역을 깨끗하게 유지하십시오. 킴 물티슈를 찢고 빙빙 돌려 여러 심지를 준비합니다. 심지는 세포판을 통해 액체를 끌어당기는 데 사용됩니다.

다음으로, 금속 샘플 홀더를 사용하여 셀 샌드위치를 만듭니다. 주사기를 사용하여 가공된 금속판의 구멍 위쪽 주변에 진공 그리스의 얇은 구슬을 바르고 각 측면의 홈 끝까지 약 절반 정도 연장합니다. 깨끗한 1번 커버 슬립을 그리스에 부드럽게 통과시킵니다.

플레이트를 뒤집고 구멍 주위에 그리스를 바르십시오. 에탄올 살균 NI 평가판 시험 장갑을 끼고 실내 조명을 끕니다. 인큐베이터에서 세포를 회수합니다.

6개의 웰 플레이트에서 실험에 사용할 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립을 조심스럽게 말리십시오. 그런 다음 덮개 슬립 셀 쪽을 아래로 눌러 보기 구멍 위의 그리스를 바른 금속판에 넣습니다.

플레이트 안에 세포를 끼웁니다. 에어 갭이 남아 있지 않고 그리스가 방수 밀봉을 형성하여 매체를 로드할 수 있는지 확인하십시오. 이제 플레이트를 한 번에 200마이크로리터씩 피펫팅하여 다시 뒤집습니다.

액체가 반대쪽 홈에 거의 도달할 때까지 상부 커버 슬립과 금속판 사이의 홈을 통해 예열 L 15 매체를 샌드위치에 추가합니다. 다음으로, 반대쪽 홈에 심지를 잡고 샌드위치에 200마이크로리터의 배지를 추가로 피펫으로 주입하여 세포를 세척합니다. 매체는 심지가 오래된 매체를 제거함에 따라 한쪽에서 다른 쪽으로 흐를 것입니다.

이 단계에서 액체 내부에 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 헹굴 때마다 새 심지를 사용하여 이 과정을 2-3회 반복합니다. 이제 플레이트를 한 번 더 뒤집어 가장자리에서 플레이트를 지지하여 액체 탱크에 액체를 가둡니다.

납땜 인두를 veap 비커에 담그면 veap의 일부가 빠르게 녹아 납땜 인두 팁에 달라 붙습니다. 납땜 인두 팁을 사용하여 바닥 덮개 슬립의 가장자리 주위에 탈피 veap을 조심스럽게 적용합니다. 커버 슬립 둘레를 계속 담그고 적용하여 금속판에 밀봉합니다.

이렇게 하면 우수한 기계적 밀봉이 생성되어 덮개 슬립이 볼 때 플레이트에서 분리되지 않습니다. 바닥에서 잔여물을 청소하십시오. 김 물티슈를 휘둘러 커버를 청소하여 슬립 표면을 커버합니다.

커버 슬립이 보이는 중앙에서 가장 깨끗하도록 한 번의 슬라이딩 동작으로 미끄러지십시오. 6개의 벽 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 도금된 셀을 광학 실험실로 가져가 대물렌즈에 장착합니다.

이전과 마찬가지로 건강해 보이는 세포의 영역을 찾고 시야의 암시야 이미지를 획득합니다. 그런 다음 현미경을 DIC에 정렬하고 노출 시간이 적절한지 확인합니다. 캐스케이드 카메라로 DIC 이미지를 획득합니다.

이 설정에서는 현미경이 DIC에 정렬되어 있는 동안 cool SNAP 카메라를 사용하여 형광 이미지를 획득합니다. 현미경 VAR을 1x로, 뷰포트를 100% 양안경으로 설정하고 이미지를 접안렌즈에서 카메라로 전환합니다. 콘덴서 위에 파란색 LED를 놓아 자기장을 비춥니다.

그런 다음 RSS 이미지에서 시야를 미리 보고 미세한 초점을 조정합니다. 필요한 경우 DIC 이미지를 가져와 디스크에 저장합니다. 시야가 캐스케이드 카메라에서 얻은 것과 어떻게 다른지 주목하십시오.

이러한 이미지는 실험의 분석 단계에서 등록해야 합니다. 다음으로, 형광 필터 큐브를 제 위치로 이동하고 현미경 셔터를 사용하여 형광 여기를 잠시 켜서 형광 이미지를 획득한 다음 획득이 완료되는 즉시 끕니다. 광표백을 최소화하려면 형광 이미지를 디스크에 저장하십시오.

필터링된 이미지를 획득하려면 현미경을 필드로 재설정하고 LSM 포트를 통해 빛을 보냅니다. 이전과 마찬가지로 이전과 같이 전체 Gabor 필터 뱅크 스크립트를 실행하여 셀이 여전히 스테이지에 있고 시야를 방해하지 않는 동안 한 시점에 대한 데이터 수집을 완료합니다. 위킹 방법을 사용하여 STS의 1마이크로몰 용액을 포함하는 동일한 매체로 일반 L 15 매체를 교체합니다.

실험이 진행되는 동안 배지를 스테이지에서 제거하거나 시야를 방해하지 않고 cell plate의 홈에 pipetting하여 건조를 방지하기 위해 배지를 추가합니다. 이제 실험이 완료될 때까지 후속 시점에 대해 이러한 단계를 반복합니다. 수집된 데이터에는 세포 내 구조 데이터를 추출하기 위해 처리해야 하는 많은 수의 필터링된 이미지가 포함됩니다.

다음은 두 가지 예제 실험입니다. 이 그림은 해양 규조류 샘플의 순차적 이미지를 보여줍니다. 방향이 지정된 기능이 명확하게 보입니다.

암시야 이미징에서. 5는 0도이고 5는 160도와 같다고 표시된 광학적으로 필터링된 이미지는 샘플의 필터링되지 않은 이미지와 함께 표시됩니다. 비교를 위해 규조류의 9개의 Gabor 필터링 이미지 세트는 물체 방향에 대해 픽셀 단위로 처리되었습니다.

각 픽셀에서 최대 신호는 종횡비 값을 제공하기 위해 필터 방향의 함수로 평균 신호로 나눴습니다. 여기서, 파란색으로 표시된 종횡비에 가까운 종횡비는 선호되는 응답 각도가 없는 영역에 존재합니다. 빨간색으로 표시된 값이 크면 더 높은 선호 각도 응답이 존재하는 영역을 나타냅니다.

총 GABOR 필터 응답의 밝기 및 코드 유의성, 각 픽셀에서 최대 신호를 제공하는 필터 방향은 기본 객체 방향에 수직 방향에 해당합니다. 하부 구조 입자 방향은 퀴버 플롯으로 인코딩되며, 각 선은 필터링되지 않은 암시야에서 볼 수 있는 기본 로컬 물체 방향과 밀접하게 일치합니다. 퀴버 플롯은 반응 농도가 최대값의 10%보다 큰 물체의 방향을 보여줍니다.

살아있는 소 내피 세포를 포함하는 필드의 이러한 암시야 및 광학적으로 필터링된 이미지, 필터링된 이미지는 세포사멸 유도제인 stor sporin으로 처리한 후 3시간 동안 20분마다 획득되었습니다. 여기서, 상단 패널의 종횡비 맵과 하단 패널의 미토콘드리아의 형광 이미징은 시간의 함수로 표시됩니다. 색조는 배향 정도를 나타내며, 이러한 시간 플롯이 s thoro sporin으로 처리 된 내피 세포에서 입자 종횡비의 배향 정도의 감소를 비교하기 전에 개별 트레이스는 단일 세포 내의 시간 플롯을 나타냅니다.

drop-in orientedness는 형광 영역에 등록하는 세포의 영역에 국한됩니다. 이제 형광에 대한 검증이 완료되었습니다. 그것은 아카이브가 됩니다.

따라서, 다음 실험에서, 미토콘드리아 측정은 형광 이미징 단계를 생략하고 광학 산란 방법을 직접 사용하여 이루어질 수 있습니다. 방금 Gabor 필터를 기반으로 하는 광 산란 시그니처를 사용하여 세포사멸 중 미토콘드리아 단편화를 모니터링하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 올바른 생활 방식을 준비하고 광학 설정이 잘 정렬되고 보정되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

그럼 UI 실험을 시청하고 CoLab에 대해 알아보겠습니다.