Name: 2 차원 가보 필터 기반으로 광학 현미경 스캐터 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-02T17:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 배우세요 가보 필터 기반 광학 현미경 산란 기법을 활용하여 살아있는 세포의 미토콘드리아 단편화를 정량 분석하는 방법입니다. 이 비침습적 기술은 세포자멸사 동안 소기관 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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본 연구의 마이크로 미러 장치 N. Boustany에 휘태커 재단 부여 RG - 02-0682에 의해 투자되었다. 진행중인 작품은 N. Boustany 부여 NSF - DBI - 0852857으로 후원됩니다. RM Pasternack는 부분적으로 루트 회장 대학원 원정대에 의해 지원되었다. 우리는 또한 광학 필터링 전략에 관한 유용한 논의를위한 연구와 박사 DN의 Metaxas에 사용되는 iBMK 세포 박사의 E. 화이트 감사드립니다.

<ol><li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Subcellular+Texture+by+Optical+Gabor-Like+Filtering+with+a+Digitial+Micromirror+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device.</a> Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).</li>
<li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+size+discrimination+of+submicron+objects+using+optical+Fourier+filtering+based+on+two-dimensional+Gabor+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive size discrimination of submicron objects using optical Fourier filtering based on two-dimensional Gabor filters.</a> Optics Express. 17 (14), 12001-12012 (2009).</li>
<li>Zheng, J. -Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+scatter+imaging+with+a+digital+micromirror+device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical scatter imaging with a digital micromirror device.</a> Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).</li>
</ol>

방법의 일부 측면과 발명 공개, 루트 거스 대학 꼬리표 # 09-049 포함되었습니다.

방법은 예를 들어, 입자 크기 또는 방향을 인코딩 수있는 개체의 수율 morphometric지도 위에서 설명한. 이 구조 정보는 여러 가지 방법으로 사용할 수 있습니다 : <ol><li> 이것은 특정 치료 중에 변경된 후 추가로 특정 분자와 생화 학적 assays와 함께이 지역을 분석 아르 조직 또는 셀 영역을 식별하는 초기 화면으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 그것은 subcellular 구조 (이 방법에 의해)의 양적 특성과 분자 활동의 동시 이해 (형광으로) 결합 세포의 multimodal 분석을 항복하기 위해 형광와 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> 일단 특정 구조 응답이 특정 생물 학적 과정 (예 : apoptosis)에 특정 organellar 활동과 상관이며, 방법이 구조적 응답에 영향을 미치는 다른 유전자와 실험 조건을 화면에있는 형광 레이블없이 사용할 수 있습니다. </li></ol> 현재까지 우리는 방법은 30 - 50nm [2]의 순서에...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>저포도당 DMEM</td></tr><tr><td>Liebowitz L15 배지</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>페놀 레드 미포함</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 뇌 추출물</td><td>Clonetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gemini Bio Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스타우로스포린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>DMD</td><td>Texas Instruments</td><td>TI 0.7 XGA DMD 1100</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascase 512B</td><td>고(16비트) 다이내믹 레인지 CCD</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Coolsnap cf</td><td></td></tr></tbody></table>

2 차원 가보 필터 기반으로 광학 현미경 스캐터

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

우리는 흠없는 살아있는 세포 내에서 organelle의 형태 및 조직에서 발생하는 subcellular 질감을 측정할 수있는 미세한 악기를 보여줍니다. 제안 악기는 organelle의 크기와 모양 nanoscale 변화에 라벨이없는 광학 현미경의 감도를 확장 및 프로그램 세포 사망이나 휴대 전화로 organelle 역학 기본 기본적인 생물 학적 과정에 관한 구조 - 기능 관계의 연구를 가속하는 데 사용할 수 있습니다 차별화. 현미경 쉽게 기존의 현미경 플랫폼에서 구현할 수 있습니다, 따라서 과학자들은 구현하고 접근할 수있는 제안된 방법을 사용할 수 있습니다 각각의 실험실에 전파 수 있습니다. 제안된 기술은 2 차원 광 가보 필터를 통해 세포를 관찰하여 subcellular 구조를 특징 수 있습니다. 이러한 필터는 nanoscale (10의 NM의) 감도가 아닌 구형 subcellular organelles의 크기와 방향에 관한 구체적인 형태학의 특성과 감각을 조정할 수 있습니다. 탄성 산란에 의해 생성되는 반면에 따라 반면, 기술은 morphometric 측정을 추출하는 자세한 역 산란 모델이나 미에 이론에 의존하지 않습니다. 이 기술은 따라서 정확한 이론적으로 흩어 설명 쉽게 부여되지 않은가 아닌 구형 organelles 적용되며, 그들의 기능을 평가하기 위해 흠없는 살아있는 세포 내에서 얻을 수있는 특유의 morphometric 매개 변수를 제공합니다. 기술은 그것이 discretized 개체의 강도보다는 변환 객체의 필드에서 직접 운영되는 디지털 이미지 프로세싱에 비해 유리한 것입니다. 그것은 높은 이미지 샘플링 속도에 의존하지 않기 때문에 따라서 크게 높은 확대 디지털 이미지의 형광 공촛점 현미경 개별 organelle 세분화와 재건축 넘어 organelle 구조의 연구를 촉진, 빠르게 한 번에 세포의 수백 이내 형태학의 활동을 화면으로 사용할 수 있습니다 보기의 제한된 분야. 이 예제에서 우리는 방법론을 설명하기 위해 해양 diatom에서 데이터를 표시합니다. 우리는 또한 메서드가 해당 생물 학적 맥락에서 적용될 수있는 방법에 대한 아이디어를주고 살아있는 세포에서 수집한 예비 데이터를 표시합니다.

우리는 하나의 살아있는 세포 내에서 subcellular 역학을 측정하는 필터링 가보와 같은 기반으로 한 어두운 현장 현미경 방법을 보여줍니다. 이 기술은 mitochondrial 조각 같은 organelles의 구조 변경에 민감합니다.

우리는 염색되지 않은 살아있는 세포 내 소기관의 형태 및 조직에서 기인하는 세포 내 텍스처를 측정할 수 있는 현미경 장치를 선보입니다.

본 영상에서는 광산란 현미경(optical scatter microscopy)을 사용하여 세포 사멸(apoptosis) 과정 중의 미토콘드리아 단편화를 정량화합니다. 본 프로토콜에서 광산란 현미경은 일반적으로 형광을 필요로 하지 않지만, 검증 목적으로 형광 이미지를 획득합니다. 이미징 시스템 설정을 마친 후, 세포를 MIT tracker green으로 라벨링하고 staurosporine을 처리하여 세포 사멸을 유도합니다.2시간 이내에 세포 소기관의 배향 변화를 감지하기 위해 광학 데이터를 획득합니다. 미토콘드리아 파편화의 시작은 하위 세포 입자의 배향 정도가 감소하는 것을 보여주는 광학 산란 데이터를 통해 측정할 수 있습니다. 이후 광학 산란 데이터를 미토콘드리아를 포함하는 형광 영역과 상관 분석하여 데이터를 검증합니다.안녕하세요, 럿거스 대학교 의생명공학과 Bio Optics 연구실의 Nada Bustani입니다. Bio Optics 연구실의 Rob Pak입니다. 그리고 저 역시 Bio Lab의 Deen입니다. 오늘은 형광 염료에 의존하지 않는 방법을 사용하여 세포 내 소기관의 형태학적 동역학을 정량화하는 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 세포 자살 또는 프로그램된 세포 사멸 동안의 세포 내 구조의 역동적인 변화를 연구하기 위해 이 기술을 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 70% ethanol로 장갑을 낀 손을 소독하며 이 절차를 시작하십시오.그런 다음, 준비된 100 nM MitoTracker Green 스톡 용액과 미리 데워둔 BAEC 세포 배양 배지를 조명이 꺼진 후드 안에 두고 모든 표면을 멸균합니다. 다음으로, 커버 글라스 위에 세포가 플레이팅된 6-웰 배양 접시를 후드 안에 놓습니다. 진공 라인에 연결된 파스퇴르 피펫을 사용합니다.웰에서 세포 배지를 제거합니다. 그런 다음 세포의 미토콘드리아를 표지하기 위해 각 웰에 표지 배지 2 mL를 즉시 첨가합니다. 조직 배양 플레이트를 덮어 실내 빛에 직접 노출되는 것을 방지하고, 세포를 빠르게 인큐베이터로 다시 옮깁니다.세포를 37 °C에서 45분 동안 배양하십시오. 먼저 광학 설정을 준비하기 위해 수은 아크 램프를 켭니다. 그런 다음 컴퓨터, 현미경 카메라 및 레이저를 켜고, 스피닝 디퓨저(spinning diffuser)에 디지털 미세 거울 소자(DMD)를 연결하십시오.다음으로, 현미경 접안렌즈를 통해 광학 런칭(optical launch)이

optical-scatter-microscopy-based-on-two-dimensional-gabor-filters

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

우리는 구조적으로 복잡한 물질로 흩어져 빛의 방향으로 공간 변화를 샘플링 비파괴 방법을 제시한다. 동시에 고해상도 이미지와 미세 규모의 방향 기여를 캡처하는 동안 물질이 그대로 유지함으로써, 우리는 총 규모의 산란 행동을 유지합니다. 결과는 생물학 관련 위치와 규모에서 소프트웨어의 시각이다.

생물 재료의 공간적 및 방향성에 따라 변화 광산란 측정

우리는 이전 유방 X 선 검사에서 건축 왜곡의 검출 방법을 보여줍니다. 배향 구조는 조직 패턴을 방사의 사이트를 검출하는 가버 필터 및 위상 인물을 사용하여 분석된다. 각 사이트의 특징과 spiculating 패턴을 표현하는 수단을 사용하여 분류된다. 방법은 유방암의 검출을 지원한다.

이전 유방 X 선 사진에있는 건축 왜곡의 검출를 통해 분석

약하게 산란 물체의 3 차원 위치를 고유 표준 현미경에 사소한 변형을 수반 인라인 디지털 홀로그램 현미경 (DIHM)를 사용하여 식별 될 수있다. 우리의 소프트웨어는 삼차원 위치 및 미세한 위상 객체의 형상을 수득 레일리-펠드 역 전파 결합 촬상 간단한 휴리스틱을 사용한다.

약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

명시야와 미분 간섭 대비 이미지의 조합을 통해 세포 질량, 부피 및 밀도의 정량적 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명합니다.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

비 교반 침전 중합 자극 성 폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드의) 좁은 크기 분포의 마이크로 겔의 합성에 대한 빠르고 재현성있는 조형 방법을 제공한다. 이 프로토콜 합성에서, 광 산란 특성과 넓은 필드 현미경 설정에서 이러한 마이크로 겔의 단일 입자의 형광 추적 증명된다.

제어 합성 및 매우 균일 한 폴리 형광 추적 (<em&gt; N</em&gt; 이소 프로필 아크릴 아미드) 미크로 겔

이 프로토콜은 ultrafast microfluidic 흐름과 이미징 유동 세포 계측법의 응용 프로그램에서 단일 셀 이미징을위한 비대칭 감지 시간 - 스트레치 광학 현미경 시스템의 구현을 설명합니다.

비대칭 검출 시간 - 스트레치 광학 현미경 (ATOM)에 의한 미세 유체 이미징 유동 세포 계측법

이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행...

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

이 프로토콜에서는, 우리는 개념 설계 요소 및 눈부심 시력 장치의 구조적 개발을 간략하게 설명합니다. 또한, 양성 실증(후광, 스포크) 및 2점 광 임계값을 측정하기 위한 장치의 설계가 설명된다.

안구 산란의 행동 효과 측정

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

배우세요 가보 필터 기반 광학 현미경 산란 기법을 활용하여 살아있는 세포의 미토콘드리아 단편화를 정량 분석하는 방법입니다. 이 비침습적 기술은 세포자멸사 동안 소기관 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

2 차원 가보 필터 기반으로 광학 현미경 스캐터

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