Name: 브래드 포드 단백질 분석의 선형화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 배우세요 브래드포드 단백질 분석의 선형화 방법을 통해 정확도를 높이고 감도를 약 10배 향상시키며 세제 간섭을 줄이는 기술입니다. 이 생화학적 기법은 정밀한 단백질 정량화가 필요한 연구자들에게 유용합니다.

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본 논문은 여기에서 설명한 원래 연구를 호스팅하는 후반 박사 Zvi 셀린저의 기억에 전념하고 있습니다.

브래드 포드 단백질 보정 그래프의 선형화 : 일반적으로 브래드 포드 분석 1로 알려진 쿠매시 화려한 파란색 단백질 분석은, 널리 때문에 신속하고 편리한 프로토콜뿐만 아니라 그 상대 감도의하는 데 사용됩니다. 불행히도, 단백질 농도의 광범위한 (그림 1) 이상의 곡률의 큰 정도가 있습니다. 따라서, 상대적으로 높은 단백질 농도, 20-10 MG / ML BSA의 단지 좁은 범위는 다음 더 나은 (그림 1, 녹색) 선형 회귀에 맞는 보정 그래프에 대한 사용됩니다. 그러나, 비선 형성은 큰 오류를 방지하기 위해 교정 그래프의 제한된 범위 내에서 가을에 알려지지 않은 샘플의 단백질 농도를 필요로하고 또한 제한된 범위의 정확성을 줄일 수 있습니다. 비선 형성은 단백질의 마이크로 그램 금액은 사용할 수 없습니다 특히 심각한 문제를 제시하고, 그것은 종종 알려지지 않은 샘플의 여러 dilutions이 필요합니다. 마찬가지로 원래 브래드 포드 종이에 명시된 바와 같이, "염료의 두 가지 색상 형태의 스펙트럼에 중복이되기 때문에 비선 형성의 원인은 시약 자체입니다."1. 사실, 쿠매시 화려한 파란색 색소의 세 형태 분석 2 일반적인 산성 산도에서 산성 - 기본 평형에 있습니다. 빨간색, 파란색, 그리고 녹색 양식, 470에서 각각 590과 650 nm의 (그림 2) 흡광도 맥시멈 있습니다. 파란 달아 NM 3, 4 (그림 2) 594에서 빛을 흡수 복잡한을 형성 단백질 바인딩 형식입니다. 브래드 포드는 또한 1 (그림 3) "더 많은 염료는 단백질 바인딩으로 시약의 배경 값이 지속적으로 감소하고있다"고 지적했다. 증가 단백질 수량이 추가로 따라서, 우리는 단백질 염색 단지가 흡수하지 않는 450 nm의에서 흡광도의 변화를 측정하여 590 nm의 배경의 감소를 계산하기 위해 시도했습니다. 우리는 발견 감소 배경 부분 것이 아니지만 완전히, 비선 형성 (그림 4)를 차지하고 있습니다. 단백질 염색 바인딩은 평형 5와 같이 있기 때문에 우리는 그때, 무료 염료 농도의 감소가 선형 응답의 또 다른 왜곡을 생성하는 가상, 복잡한 형성은뿐만 아니라 무료로 염료의에서뿐만 아니라 무료로 단백질의 농도에 따라 달라집니다 (그림 5). 계정에 무료 염료의 변수 농도와 관련된 두 문제를 복용, 우리는 단백질 농도와 흡광도 측정, 450 NM (그림 6)을 통해 590 nm의 비율 사이의 선형 관계를 설명하는 수학 방정식을 개발했습니다. 이론 및 실험적 연구에 대한 자세한 설명은 분석 생화학 6 우리 1,996 간행물에서 찾을 수 있습니다. 수학 방정식은 실험적으로 테스트하여 전체 단백질 농도 범위 (그림 7)을 통해 선형 보정 곡선을 얻을 것으로 판명되었다. 또한 방정식은 Y 축 절편 6 올바른 산도에 의존 가치의 독립적인 결정에 의해도 확인되었다. 향상된 브래드 포드 단백질 분석에 대한 자세한 프로토콜, Microplate의 흡광도 Reader를 사용하여 <ol><li> 표준 소 혈청 알부민의 0.1 MG / ML 재고 솔루션을 준비합니다. 다른 표준은 선택하지만, 같은 표준은 모든 실험에서 사용해야합니다 수 있습니다. </li><li> 탈이온수에있는 미지의 샘플을 희석. 5-50 μg / ML하는 것을 목표로하고 있습니다. 분석의 선형 범위에 대한 명백한 제한이 없기 때문에 아직 높거나 낮은 단백질 농도가 허용됩니다. 그러나, 측정 흡광도 리더의 선형 범위 내에서해야합니다. </li><li> 탈이온수의 브래드 포드 시약 (바이오 래드)가 2.5 배 희석. </li><li> 0 세중의의 우물 (0-5 μg BSA 보정 곡선을 만드는)에 BSA 주식 솔루션의 10-50 μl를 추가합니다. / 잘 100 μl에 도달 탈이온수로 보완합니다. </li><li> 다른 우물에서 triplicates에 알려지지 않은 샘플 100 μl를 추가합니다. 미지 시료의 농도는 몇 가지 정확성을 높이기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 모든 우물에 희석 브래드 포드 시약 100 μl를 추가합니다. 총 볼륨 잘 200 μl / 수 있습니다. </li><li> 적어도 5 분 아니지만 색상 개발을위한 이상 60 분 정도 기다립니다. </li><li> 빈은 탈이온수 (가 아니라 잘 제로 단백질 색소) 200 μl해야합니다. </li><li> 590 NM에서 450 nm의 흡광도에서를 측정. </li><li> 590 nm의 흡광도에서 네트워크의 가치를 나누어 450 nm의에서 보정 그래프를 준비합니다. 제로 단백질 (단 염료) 값이 데이터 포인트 (그림 8)로 포함되어야합니다. </li><li> 교정 곡선 (그림 9)의 선형 방정식을 바탕으로 미지 시료의 농도를 계산합니다. </li></ol> 대표 결과 : 590 NM의 단일 파장, 흡광도 값을 450 nm의 이상의 590 nm의 비율에서 흡광도와는 달리, 선형 w는ith 단백질 농도 (그림 10). 미지의 시료의 단백질 농도는 단순히 교정 곡선 (그림 10, 방정식)의 선형 방정식을 사용하여 계산됩니다. 그러나, 증가 정확도는 몇 가지 알려지지 않은 샘플 dilutions를 측정하여 얻을 수 있습니다. 이를 위해 두 개의 그래프를 준비합니다. 첫 번째는 X 축 (그림 11, 오른쪽)에서 μg 단백질과 표준 교정 그래프입니다. 두 번째 그래프는 X 축 (그림 11, 왼쪽)에있는 원래 undiluted 샘플 μl와 함께 미지의 샘플입니다. 염료 전용 값은 (그림 11) 두 그래프에 포함되어야합니다. 미지의 시료의 단백질 농도는 미지의 시료와 표준의 슬로프 (그림 11, 방정식)을 나누어 파생됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 기존 브래드 포드 교정 그래프. 선형 범위는 녹색 기호로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 단백질 염색 복합 혼자 염료의 스펙트럼. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 단백질 염색 평형. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 정확한 계산 배경 감소는 부분 비선 형성을 감소시킵니다. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 단백질 염색 평형. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 브래드 포드 단백질 분석의 선형화을위한 수학 기초. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 브래드 포드 보정 그래프의 선형화. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="그림 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 8"> 그림 8. 흡광도 비율 값 계산. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="그림 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 9"> 그림 9. 리니어 브래드 포드 교정 그래프. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="그림 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 10"> 그림 10. 브래드 포드 보정 그래프의 선형화. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="그림 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 11"> 그림 11. 불명 샘플 농도 계산.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

브래드 포드 단백질 분석 인해 성능과 상대 감도 자사의 용이성으로 인기가 있습니다. 프로토콜에 의해 얻은 범위 전체 단백질 농도 이상의 선형화는 미지 샘플의 교정 그래프의 범위 내에서 빠지지하지 않아도 여기에 추가로, 분석을 간단하게 제시. 중요한 것은 향상된 프로토콜은 더 이상 원래 브래드 프로토콜에 비해 다음과 같은 장점을 제공합니다 : <ol><li> 정확도를 증가했다. </li><li> 감도는 그것이 가능한 microplate 분석 6으로 작은 50로 NG의 BSA를 결정하고, 크기 약 1 명령에 의해 증가됩니다. </li><li> 향상된 감도는 세제의 면전에서 단백질 양을 정함 수 있습니다. 원래 브래드 포드 프로토콜로, 일반적으로 세포 용해에 사용되는 세제에 의한 간섭은 종종 단백질을 감소 반응의 결과 것입니다. 진도 중 하나의 명령에 의해 감도의 개선 세제에 의해 간섭이 제거되는 지점으로 샘플의 희석을 수 있습니다. 표준 샘플은 희석 알...

<table><tbody><tr><td>Bradford 시약</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>멀티플레이트 흡광도 측정기</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

브래드 포드 단백질 분석의 선형화

Linearization of the Bradford Protein Assay

브래드 쿠매시 화려한 파란색 분석에서 단백질의 마이크로 그램 수량의 결정은 590 nm의 흡광도에서 측정하여 수행됩니다. 이것은 가장 일반적인 분석은 생화 학적 측정의 정상화를 목적으로, 세포 lysates, 휴대 분수, 또는 재조합 단백질 샘플에 신속하고 간단하게 단백질 부량 수 있습니다. 그러나, 본질적 비선 형성이 방법의 감도와 정확성을 타협. 이것은 표준 분석 조건 하에서 흡광도 590 NM에서 측정과 450 nm의 비율은 단백질 농도와 엄격하게 선형임을 표시됩니다. 이 간단한 절차는 정확성을 증가 및 아래쪽 소 혈청 알부민 50 NG 10 배, 좋으 부량에 대한 분석의 감도를 향상시킵니다. 또한, 일반적으로 세포 lysates을 만드는 데 사용되는 세제의 도입 간섭은 크게 새로운 프로토콜에 의해 줄어 듭니다. 대량 작업 및 맥주의 율법에 기초하여 개발된 선형 방정식 완벽하게 실험 데이터를 맞는 데요.

신속하고 편리한 브래드 포드 분석에 의해 단백질 결정의 정확성과 감도는 본질적인 비선 형성에 의해 손상됩니다. 우리는 크게, 정확성을 증가 10 배에 대한 분석의 감도를 향상하고, 크게 세제에 의해 간섭을 줄일 수있는 간단한 선형화 절차를 보여줍니다.

Bradford Coomassie brilliant blue 분석법에서 마이크로그램 단위의 단백질 정량은 590 nm에서의 흡광도 측정을 통해 수행됩니다.

Bradford 단백질 분석은 96-웰 플레이트에 증가하는 양의 BSA 표준 물질과 희석된 미지 시료를 첨가하는 것으로 시작하며, 가변적인 부피를 보충하기 위해 탈이온수를 추가합니다. 그 후 블랭크를 제외한 모든 웰에 Bradford 시약을 첨가하며, 블랭크에는 물이 들어가야 합니다. 5분 후, 단백질-염료 복합체 검출을 위해 590 nm에서, 그리고 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.그래프의 선형화를 위해, 590 nanometers와 450 nanometers에서의 흡광도 값의 비율은 단백질 양과 엄격하게 선형 관계를 보입니다. 안녕하세요, 저는 이스라엘 텔아비브 대학교 생화학과의 연구원입니다. 오늘은 개선된 선형화 Bradford 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 결정하는 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 젤 로딩 전과 같이 SZaS의 단백질 양을 표준화하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 브래드퍼드 분석법(Bradford Assay)에서는 분석 시의 일반적인 산성 pH에서 쿠마시 브릴리언트 블루(Kumasi brilliant blue) 염료의 세 가지 형태가 산 기반 평형 상태를 이룹니다.적색, 청색 및 녹색 형태는 각각 470, 590 및 650 nanometers에서 최대 흡수 파장을 갖습니다. 청색은 단백질과 결합하여 594 nanometers에서 빛을 강하게 흡수하는 복합체를 형성하는 형태입니다. 널리 사용되는 이 분석법은 광범위한 단백질 농도 범위에서 상당한 곡률을 보입니다.따라서 검정 곡선에는 선형 회귀에 더 적합하도록 상대적으로 높은 단백질 농도의 좁은 범위만이 사용됩니다. 비선형성의 한 가지 원인은 유리 염료의 590 nanometers에서의 흡광도로, 이는 단백질 양이 증가함에 따라 감소합니다. 단백질-염료 복합체가 아닌 염료 자체만 흡광하는 450 nanometers에서의 흡광도 변화를 측정함으로써 비선형성을 부분적으로 줄일 수 있습니다.또한, 올바르게 계산된 공시료 값을 빼줌으로써 자유 염료 농도가 감소하면 선형 응답에 또 다른 왜곡이 발생하는데, 이는 단백질-염료 결합이 평형 상태에 있기 때문에 복합체 형성이 자유 단백질의 농도뿐만 아니라 자유 염료의 농도에도 의존하기 때문입니다. 자유 염료의 가변적인 농도와 관련된 이 두 가지 문제를 모두 고려하여, 단백질 농도와 450 nanometers 대비 590 nanometers 흡광도 측정값의 비율 사이의 선형 관계를 설명하는 수학적 방정식이 개발되었습니다.해당 수학 방정식은 실험적으로 검증되었으며, 전체 단백질 농도 범위에서 선형 검정 곡선을 생성하는 것으로 확인되었습니다. 우선, 0.1 mg/mL 농도의 표준 bovine serum albumin 스톡 용액을 준비하십시오. 다른 표준 물질을 선택할 수 있으나, 모든 실험에서 동일한 표준 물질을 사용해야 함에 유의하십시오.미지 시료를 탈이온수에 희석하십시오. 5~50 µg/mL 농도를 목표로 하되, 본 분석법의 선형 범위에 뚜렷한 제한이 없으므로 더 높거나 낮은 단백질 농도도 허용됩니다. 다만, 측정값은 흡광도 측정기의 선형 범위 내에 있어야 함에 유의하십시오.또한 Bradford 시약을 탈이온수로 2.5배 희석합니다. 다음으로, 96-웰 플레이트의 3반복 웰에 BSA 스톡 용액을 0 및 5에서 50 µL까지 첨가하여 0에서 5 µg BSA 검량선을 작성하고, 각 웰의 최종 부피가 100 µL가 되도록 탈이온수를 채웁니다. 미지 시료 100 µL를 3반복으로 첨가하며, 정확도를 높이기 위해 미지 시료의 농도를 여러 단계로 설정하여 사용할 수 있습니다.마지막으로, 모든 웰에 희석된 Bradford 시약 100 µL를 넣습니다. 웰당 총 부피는 200 µL가 됩니다. 또한 흡광도 측정을 위한 공시료(blank)를 준비합니다.여기에 0-단백질 염료가 아닌 200 µL의 탈이온수를 넣어야 합니다. 색상 발색을 위해 최소 5분에서 최대 60분까지 대기하십시오.590 nm와 450 nm에서 흡광도를 측정합니다. 이때 공시료(blank) 측정에는 물을 사용하십시오. 590 nm와 450 nm에서의 순 흡광도 값을 나누어 검정 곡선을 작성합니다.단백질 값이 0인 경우도 데이터 포인트로 포함해야 함에 유의하십시오. 검량선의 선형 방정식을 바탕으로 미지 시료의 농도를 계산하십시오. 590 nm의 단일 파장에서의 흡광도와 달리, 450 nm 대비 590 nm의 흡광도 값 비율은 단백질 농도와 선형 관계를 보입니다.미지 시료의 단백질 농도는 검량선의 선형 방정식을 사용하여 간단히 계산할 수 있습니다. 하지만 미지 시료를 여러 배율로 희석하여 측정하면 정확도를 높일 수 있습니다. 이를 위해 두 개의 그래프를 준비하십시오.첫 번째는 x축에 단백질 µg이 표시된 표준물질용 검정 곡선입니다. 두 번째 그래프는 x축에 희석되지 않은 원래 시료의 µL가 표시된 미지 시료용입니다. 염료 단독 값은 두 그래프 모두에 포함되어야 합니다.미지 시료의 단백질 농도는 미지 시료의 기울기를 표준 시료의 기울기로 나누어 도출합니다. 지금까지 개선된 선형화 Bradford 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 측정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 사용하면 분석의 정확도가 크게 향상되고, 민감도가 약 10배 정도 개선되며, 계면활성제에 의한 간섭을 유의미하게 줄일 수 있습니다.단백질 염료가 없는 제로 샘플 대신 물을 사용한 적절한 공시료(blank)를 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

이 비디오는 샘플에서 표적 단백질 발현을 정량화하기 위한 전체 단백질 정규화 기반 웨스턴 블로팅 기술을 보여줍니다. 샘플의 총 단백질 염색을 활용하여 비율계량 분석을 수행하여 표적 단백질의 상대적 발현 수준을 결정합니다.

단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

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브래드 포드 단백질 분석의 선형화

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