Name: 의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 Danio rerio에서 GFP 표현 블라스토미어 이식을 통한 키메라 배아 생성 및 실시간 현미경 영상 기법. 이 방법은 망막과 뇌 발달 과정에서 세포 운명 추적 및 유전적 변형 세포의 행동 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH 그랜트 R01EY016099 및 실명 경력 개발 상을 방지하기 위해 연구 : 본 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 코어 그랜트 (5P30EY008098) 다음과 같은 자금 XW에 의해 지원되었다. 우리는 공촛점 이미징에 도움 키라 라스럽 감사합니다.

1 일. 준비 1. 물고기 십자가를 설정 저녁에 zebrafish의 pairwise 교차를 설정합니다. 원하는 시간 전에 무작위로 교배를 방지하기 위해 짝짓기 카세트에서 암컷과 수컷 물고기를 구분하는 디바이더를 사용합니다. GFP - 표현 유전자 변형 물고기 것은 기증자 blastomeres의 소스로 사용됩니다. pt104 유전자 변형 라인 (Zou 외., 2008), 여기에 사용 EF1 모터의 제어하에 ubiquitously GFP를 표현합니다. GFP의 표현이 라이브 영상으로 기증자 세포의 시각화 수 있습니다. 적합한 형광 단백질을 표현하는 다른 유전자 변형 물고기 라인은 특정 요구에 맞게 사용할 수 있습니다. 2. 배아 보관을위한 쐐기 모양의 아가로 오스 웰스 준비 페트리 접시에 E3 계란 물 (웨스 터, 2007)에서 준비 녹아 1퍼센트 아가로 오스를, 하거라. 아가로 오스 솔루션 쐐기 모양의 라고나할까요을 가지고 있으며, 아가로 오스 솔루션이 완전히 응고하게 플라스틱 금형을 플로트. 자세히 곰팡이를 제거하고 E3 물과 아가로 오스 침대 젖어. 3. 이식의 바늘을 준비 유리 모세관 pipettes (세계 정밀 악기)를 당겨 바늘을 만들 11.5 설정을 전원에서 수직 니들 풀러 (데이비드 KOPF 악기)를 사용합니다. 좋은 바늘 팁 긴 샤프트와 테이퍼합니다. 내경 40 - 45μm의 beveled 개구부 (그림 1A)를 얻을 수있다 때까지 마이크로 그라인더 (Marishige)와 45도 각도로 바늘 도움말을 분쇄. 바늘 팁을 정리, 바늘의 뭉툭한 끝에 호스를 연결 주사기에 호스를 연결한 다음 빨아 모든 보이는 이물질이 제거될 때까지 10 % 불화 수 소산​​ 산성 솔루션을 출시. 다음, 100 % 에탄올 다음 증류수로 도움말을 씻으십시오. 모든 에탄올 증발까지 바늘을 공기 건조. 잔여 에탄올의 고온 연마 단계에서 바늘을 망치는 것입니다 도움말을 완전히 건조되도록하는 것이 중요합니다. 바늘 팁의 거친 모서리를 부드럽게하고 폴란드어하려면, 마이크로 위조자 (Marishige)의 필라멘트에 의해 생성된 열을와 바늘 팁을 구워. 바늘 도움말을 연마 중에 필라멘트를 만지지 않도록하십시오. 필라멘트와 바늘 팁 사이의 필라멘트와 거리지만 전달하는 전기의 양은 원하는 난방 조건을 달성하기 위해 조정할 수 있습니다. 온도가 너무 높으해서는 안됩니다 :이 녹으 바늘 조언을 변형합니다. 거친 가장자리가 smoothened 후 조심스럽게 바늘 끝으로 가열 필라멘트를 터치하고 부드럽게 지적 엔드 (그림의 1B)를 생성하는 바늘에서 멀리 필라멘트를 당기십시오. 날카로운 부드럽고 깨끗한 바늘은 그대로 기증 blastomeres를 취득하고 호스트 배아를 손상되지 않습니다 중요합니다. 4. 배아 - 위치 프로브를 준비 smoothened 끝에있는 고급 유리 프로브를 얻기 위해 가스 불꽃을 통해 유리 피펫을 당기세요. 이 프로브는 이전에 이식하기 위해 적절한 방향에서 배아를 위치로 사용됩니다. 일 2. Blastomere 이식 1. 수집 및 dechorionate 배아 다음날, 친구에게 물고기를 허용하도록 교차 카세트에 디바이더를 제거합니다. E3 물이 가득 배양 접시에있는 배아를 놓습니다. 그런 다음 수동으로 미세 포셉 한 쌍의와 배아에서 chorions 멀리 되는걸하여 dechorionate 배아. 신중하게 아가로 오스 웰스에 dechorionated 배아를 전송하는 구부러진 샤프트와 유리 피펫을 사용합니다. 공기와 배아의 접촉을 피하십시오, 이것은 버스트에 배아의 원인이됩니다. 배아는 28.5에서 개발하자 ° 아가로 오스 웰스의 C 3 시간 게시물 수정, 또는 HPF까지. 2. 이식 장치를 설정 배아가 발달하는 동안, 미네랄 오일 - 채워진 마이크로 펌핑 시스템에 이식 바늘을 연결하여 이식 장치를 설정합니다. 시스템이 누설되지 않으며 기포가 시스템에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 위로 0.5을 제외하고, 미네랄 오일과 함께 전체 이식 바늘을 채우기 - 공간 1 μl를 팁 오프닝에서. 3. blastomeres의 이식 blastomeres을 이식하려면, 이상 3 - 4 - HPF의 태아의 blastomere 측면을 동쪽을 향하게하는 유리 위치 프로브를 사용합니다. 그런 다음, 부드럽게 기증자의 배아에 이식 바늘을 삽입하고 천천히 바늘로 50-20 blastomeres을 빨아. 호스트 배아에 blastomere - 채워진 바늘을 넣고 천천히 blastomeres를 놓습니다. 그들의 자손들이 나중에 발달 단계에서 집중 어디 blastomeres가 출시되는이 사이트는 영향을 미칠 것이다. 망막과 두뇌 개발, 동물 극에서 출시 세포를 분석합니다. 이식하는 동안, 바늘 끝 공기에 문의 있지 않은지 확인하십시오. 기계적 피해를 최소화하기 위해, 호스트 배아는 다음날까지 28.5 ° C의 아가로 오스 우물에 남아한다. 그런 다음, T각각 잘 한 배 (胚)와, 1 % 아가로 오스의 0.5 ML 사전 코팅 24 잘 접시에 모자이크 배아를 ransfer. E3 계란 물 1 ML 각 잘에 추가됩니다. 박테리아 감염을 방지하기 위해, 100X 페니실린 및 E3 계란 물에 스트렙토 마이신 10 μl를 추가합니다. 3 일. 퍼가기과 모자이크 배아의 라이브 영상 1. 퍼가기 배아 E3 계란 물 속에 1.5 % 낮은 용융 점 아가로 오스 (LMP)를 준비하고 30 ° C의 물을 욕조에 솔루션을 유지. 두께 0.17mm의 유리 바닥을 가진 FluoroDish 조직 문화 요리 (세계 정밀 계측기)에 모자이크의 배아를 전송합니다. 단지 E3의 최소 금액이 적용되는 배아를 떠나 초과 E3 물을 제거합니다. 배아에 30-50 μl 녹인 1.5 % LMP를 추가합니다. 빨리 아가로 오스 솔루션 굳은하기 전에 가능한 한 유리 하단에 가까운 눈 또는 머리를 위치. 솔루션은 아래 냉각 후, 더 이상 장소에서 배아를 보호하는 추가 아가로 오스 솔루션을 추가합니다. 그런 다음, 2-3 ML E3 달걀 물로 확정 아가로 오스 블록을 담가. 2. 공촛점 이미징 공촛점 현미경을 위해, 큰 초점 심도있는 물이 침수 바뀌 목적은 (올림푸스, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, 일본)이 사용됩니다. 물방울이 목적에 추가하고 다음 목적에 FluoroDish 조직 문화 요리를 장소이기도합니다. 이미지 개발, 배아 5 분 간격의 사진을 복용하여 시간 경과 이미징을 수행합니다. 실험의 성격에 따라, 촬영 사이의 시간 간격을 조정해야합니다. 대표 결과 그림 2는 대표적인 24 HPF의 모자이크 zebrafish를 보여줍니다. GFP 표현이 녹색에서 기증자의 세포를 강조 표시합니다. 망막 neuroepithelial 세포가 망막 벽의 전체 두께에 걸쳐. 영화는 24 HPF에서 호스트 두뇌에 기증자 세포의 움직임을 보여줍니다. 공지 세포의 morphologies은 시간이 지남에 따라 변경합니다. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 이식 니들 팁 형태. A.는 바늘 끝의 beveled 오프닝은 불화 수 소산​​ 산성 세척 후 파편 무료되었습니다. B. 뾰족한 끝을 바늘 끝에 생성되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. GFP의 시각화 - 표현 24 HPF에서 키메라 zebrafish의 배아에서 기증자 세포를. 왼쪽 패널은 두뇌와 망막의 GFP 신호를 보여줍니다. 중앙 패널은 배아의 밝은 현장 사진입니다. 오른쪽 패널은 병합된 이미지를 보여줍니다. 영화 1. GFP 긍정적인 기증자 세포 이미징 개발 중에 뇌 세포 neuroepithelial의 morphologies의 광범위한 변화를 보여주는 살고 있습니다. 영화의 각 프레임은 24 일과 25 HPF 사이에 5 분마다 수집하고있는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 망막과 두뇌 개발을 분석 blastomere 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 단순히 호스트 배아의 해당 위치로 기증자 blastomeres을 출시하여 다른 조직과 기관의 발전을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. GFP 분자와 라벨링은 형광 염료 복합 Dextran (호 케인 1990)와 라벨보다 깔끔한 배경을 산출. 죽은 기증자 세포에서 Dextran의 염료의 잔해가 있으므로 영상 (카탈라노 외., 2007)와 inferring, GFP보다 훨씬 더 오래 지속되기 때문입니다. 또한, GFP - 긍정적인 기증자의 세포는 Dextran의 염료를 포함하는보다 건강 있습니다.

E3 달걀 물 : <ul><li> 5 MM NaCl </li><li> 0.17 MM KCl </li><li> 0.33 MM CaCl 2 </li><li> 0.33 MM MgSO 4 </li><li> 0.1 % 메틸렌 블루 </li></ul>

의 이식 gfp - 표현 키메라 zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 blastomeres을

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

세포 embryogenesis 동안 자신의 위치와 속성에 광범위하게 변경합니다. 이러한 변경은 세포와 그 환경 사이의 상호 작용에 의해 규제됩니다. 다른 유전 배경의 세포 구성되어 있으며 키메라 배아는 관심의 유전자에 의해 중재 세포 세포 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 초기 발달 단계에 zebrafish의 배아 투명성은 세포 수준에서 조직과 장기의 morphogenesis 직접 시각화 수 있습니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아의 망막과 두뇌 키메라를 생성하고 기증자의 세포의 라이브 영상을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 프로토콜은 이식의 바늘의 이식의 준비를 다루고 GFP - 표현 GFP - 부정적인 호스트 기증자 blastomeres를 라이브 공촛점 현미경 하에서 공여 세포 행동의 시험. 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 또한 zebrafish에서 다른 조직과 장기의 배아 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 레이블 기증자 세포에 GFP를 사용하는 장점도 설명합니다.

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

배아 발생 과정 동안 세포는 위치와 성질 면에서 광범위한 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 세포와 그 주변 환경 사이의 상호작용에 의해 조절됩니다.

Blasts는 발생의 난할 단계 동안 형성되는 배아 세포입니다. 여기서는 이식용 바늘을 사용하여 GFP가 표지된 Blasts를 한 제브라피시 배아에서 다른 배아로 이식합니다. 이 방법은 생체 현미경 이미징을 통해, 유전적 배경이 변경된 blastmere의 행동과 운명을 정상 배아 내에서 관찰하거나 그 반대의 경우를 추적할 수 있게 해줍니다.안녕하세요, 피츠버그 대학교 안과학과의 Shawe 박사 연구실 소속 Zoran 박사입니다. 오늘은 제브라피쉬 배아의 breast mial 운송 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 망막 및 뇌 발달 연구를 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.이제 시작하겠습니다. 저녁 시간대에 제브라피시의 무작위 교배를 방지하기 위해 쌍별 교배를 설정하십시오. 원하는 시간 전까지 칸막이를 사용하여 암컷과 수컷 물고기를 분리하십시오. 여기입니다.GFP를 발현하는 형질전환 물고기를 공여 낭포 세포의 공급원으로 사용합니다. PT 1 0 4 형질전환 라인은 EF one 프로모터의 조절 하에 GFP를 편재성으로 발현합니다. 배아를 담을 agros 웰을 준비하기 위해, E three egg water로 조제하여 녹인 1% agros를 페트리 접시에 붓습니다. 그 후 agros 용액 위에 쐐기 모양의 돌출부가 있는 플라스틱 몰드를 띄웁니다.그다음 식혀줍니다. 조심스럽게 응고시키기 위해 몰드를 제거하고 agros bed를 E three water에 담급니다. 이어서 이식용 바늘을 준비합니다.전원 설정을 11.5로 맞춘 수직 니들 풀러(vertical needle puller)를 사용하여 유리 모세관 피펫을 뽑아냅니다. 적절한 니들 팁은 긴 샤프트와 함께 가늘게 테이퍼져야 합니다. 마이크로 그라인더를 사용하여 니들 팁을 45도 각도로 갈아 내경 30 to 40 micrometers의 베벨 개구부를 만듭니다.바늘 팁을 세척하려면, 뭉툭한 끝부분에 호스를 부착하고 호스를 시린지와 연결한 다음, 10% hydrofluoric acid 용액을 흡입했다가 배출하십시오. 모든 가시적인 이물질이 제거될 때까지 이 과정을 반복합니다. 그 후 팁을 증류수로 세척하십시오.그다음 100% ethanol을 사용하여, 모든 ethanol이 증발할 때까지 니들을 공기 중에서 건조시킵니다. 팁이 완전히 건조되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 잔류 ethanol은 고온 연마 과정 중에 니들을 손상시킵니다.두 번째 단계로, 니들 팁의

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

Zebrafish 세포 이식은 조직 특정 chimeras를 생성하는 유전 발생학의 조합이 가능합니다. 이 비디오는 gastrula 우리 연구실은 forebrain의 접합면의 형성 중에 astroglial 인구와 구체적인지도 단서의 역할을 조사하기 위해 허용해야 세포 transplantations를 개최 보여줍니다.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

죽어가는 세포는 장벽의 기능을 중단하지 않고 인접 세포의 수축에 의해 공동 상피 조직에서 압출하고 있습니다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기 우리는 세포 해상도에서 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

배우세요 Danio rerio에서 GFP 표현 블라스토미어 이식을 통한 키메라 배아 생성 및 실시간 현미경 영상 기법. 이 방법은 망막과 뇌 발달 과정에서 세포 운명 추적 및 유전적 변형 세포의 행동 연구에 활용됩니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

더 많은 동영상 탐색