에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis

A CT 분석의 전반적인 목표는 관심 유전자가 특정 세포의 운명에 대한 원시 진피를 특정할 수 있는지 여부를 테스트하는 것입니다. 이 절차는 먼저 형광 리포터 유전자의 암호화에서 RNA를 과도하게 발현하고 XUS lavis 배아 발달에 관심 유전자를 발현하는 것으로 시작합니다. 다음 단계는 과발현된 RNA를 발현하는 동물 뚜껑 또는 원시 오덤을 해부하고 15기까지 성장시키는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 15기 숙주 배아의 측면에 있는 조직을 제거하는 것입니다. 마지막 단계는 기증자 동물 뚜껑 조직의 절반을 숙주 배아의 측면에 이식하고 숙주를 42기에서 43기까지 성장시키는 것입니다. 그 결과, 조직 특이적 마커에 대한 절편 및 면역 염색을 통한 눈과 같은 구조와 같은 이소성 조직 형성을 보여줍니다.

안녕하세요, 저는 Upstate Medical University의 안과에 재직하고 있습니다. 오늘은 Mike Suber와 공동으로 개발한 동물 캡 이식 분석이라고 부르는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 두 실험실에서 이 분석을 사용하여 눈 형성에 충분한 유전자를 연구합니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 주입을 위해 cap RNA를 준비하고, noggin 또는 다른 관심 유전자를 전사하고, YFP를 추적자로 사용할 수 있습니다. 또한 MMR 기반 용액, 8 x 난자 산란 용액 및 배아 주입을 위한 바늘을 준비합니다.

맞춤형 엘라스토머 몰드는 배아 담기 접시를 만드는 데 사용됩니다. 마이크로파에서 0.4 XMMR의 1%AROS를 용융하여 실험 조건당 하나의 주입판을 생성합니다. 약 6ml의 용액을 60mm 플레이트로 옮깁니다.

거품을 방지하기 위해 용액 위에 엘라스토머 몰드를 부드럽게 놓고 약 20분 동안 식힙니다. 실온에서 사출 플레이트에 대해 표시된 것처럼 1% AGROS와 금형이 있는 0.7 XMMR을 사용하여 실험 조건당 하나의 캡 격리 플레이트를 생성합니다. 각 시점에 대해 여분의 플레이트를 준비합니다.

시점 계산에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오. 다음 격리를 클릭합니다. 수컷 개구리에서 이것들을 테스트하고 Gentamycin의 밀리리터 당 50 마이크로 그램이 보충 된 하나의 XMMR의 멸균 용액에 섭씨 4도에서 조직을 보관하십시오.

이것은 실험 시작 일주일 전까지 수행할 수 있지만 정자는 시간이 지남에 따라 미세 주입 전날 늦은 시간에 효능을 잃습니다. 암컷에게 인간 융모막 성선 자극 호르몬 500 단위를 주입합니다. 암컷을 섭씨 16도에서 18도에서 하룻밤 동안 두십시오.

이제 다음 날 마이크로 주입할 준비가 모두 완료되었습니다. 호르몬으로 유도된 암컷을 제거하고 하나의 XELS가 들어 있는 개별 탱크에 넣는 것으로 시작합니다. 끝을 잘라 바늘 미세 주입을 준비합니다.

25 - 35 마이크로미터 직경을 얻으려면 PLI 100 피코 주입기에 바늘을 놓고 주입당 10 나노리터를 분사하도록 보정합니다. RNA를 주입 한 후 인큐베이터를 섭씨 14도로 설정하면 배아의 발달이 느려지고 수정 약 한 시간 전에 한 번의 실험에서 더 많은 이식을 수행 할 수 있으며 탱크에서 난자를 제거합니다. 암컷이 한 시간 더 알을 낳으면 이송 피펫을 사용하여 탱크에서 새로 낳은 알을 꺼냅니다.

ELS 용액에 2시간 이상 들어간 달걀은 사용하지 마십시오. 달걀의 품질이 떨어지므로 달걀을 60mm 페트로 접시에 넣으십시오. 이 요리는 약 80%가 한 겹의 계란으로 가득 차 있습니다.

난자에서 ELS를 최대한 제거하고 XMMR을 1개로 교체합니다. 알은 최대 한 시간 동안 하나의 XMMR에 머물 수 있습니다. 다음으로 균질화된 고환으로 난자를 시험관 내에서 수정합니다.

배아가 원하는 단계로 자랄 수 있도록 오전 11:00 정오와 오후 1:00 경에 세 개의 개별 배치로 배아를 수정하는 것이 가장 좋습니다.캡 분리의 경우 8.5-9, 이식의 경우 15기입니다. 난자를 수정한 후 한 시간 후에 0.1 XMMR의 풍부한 양으로 D jelly Solution Wash를 사용하여 난자의 젤리 코트를 제거한 다음 수정란이 두 세포 단계에 도달할 때까지 기다립니다.

정렬을 시작합니다. 0.4 XMMR과 6%F ccal로 채워진 주입 접시를 준비합니다. 배아가 두 세포 단계에 도달하면 전달 피펫을 사용하여 균일하게 착색되고 균등하게 분열된 배아를 주사 접시의 웰로 분류합니다.

먼저 미세 주입을 진행하여 60mm 석유 접시 뚜껑 위에 퍼필을 스트레칭합니다. 2마이크로리터의 RNA 샘플을 생물막에 피펫하고 흡인합니다. 피코 인젝터를 사용하여 주사 바늘을 채웁니다.

주입을 시작하기 전에 바늘이 여전히 10리터의 샘플을 분배하고 있는지 확인하십시오. RNA는 두 개의 세포기 배아를 통해 두 블래스터에 주입됩니다. 20-30개의 배아에 각각 500피코그램의 Y-F-P-R-N-A를 주입하고 한 접시에 담습니다.

또 다른 20-30개의 배아에 각각 20피코그램의 나인, Y-F-P-R-N-A와 미리 혼합된 RNA를 주입하고 접시에 넣습니다. 또한, FICO 용액을 함유한 다른 주입 접시에 시점당 100-200개의 주입된 배아를 배치합니다. 주입된 배아와 동시에 이러한 배아를 인큐베이터 안팎으로 이동합니다.

이들은 주입 후 캡을 이식하는 데 사용되는 숙주입니다. 모든 배아를 섭씨 14도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 계획된 모든 시점에 대해 반복합니다.

하룻밤 배양 후 동물 뚜껑을 분리할 수 있습니다. 배아를 준비하기 위해 아침 일찍 도착하십시오. 인큐베이터에서 주입된 숙주 배아도 제거하는 것을 잊지 마십시오.

가장 빠른 시점은 9단계여야 합니다. 먼저, 살아남지 못한 배아를 제거합니다. 생존 가능한 배아에서 동물 캡을 분리하는 작업을 진행하고, 각 시점을 배치하여 캡 분리 접시에 넣습니다.

넉넉한 양의 0.7 XMMR과 겐타마이신 용액을 첨가하십시오. 그런 다음 주입된 배아를 포함하는 각 플레이트에서 fol 용액을 붓고 0.7 XMMR과 겐타마이신 용액을 다시 추가합니다. 전사 피펫을 사용하여 주입 접시 웰에서 배아를 제거하고 갓 준비한 뚜껑 분리 접시에 넣습니다.

400 마이크로미터에 구부려진 노란 끝과 맞은 gastro 주인 또는 예리한 숫자 5 겸자의 쌍을 0.7 XMMR 플러스 Gentamycin 해결책에 있는 동물성 모자를 고립시키기 위하여 이용하십시오. 병기 결정을 위해 2개 또는 3개의 온전한 배아를 보관합니다. 동물 캡을 분리한 후, 숙주 배아와 함께 섭씨 14도의 인큐베이터에 다시 넣고, 다음 날 숙주 배아의 측면에 캡을 이식합니다.

섭씨 14도의 인큐베이터에서 첫 번째 시점부터 뚜껑과 숙주 배아를 제거하고 균일한 형광 양성 뚜껑을 위해 배아를 정렬합니다.뚜껑의 수를 세고 제거합니다. 0.7 XMMR과 날카로운 숫자 5 겸자가 있는 겐타마이신 용액으로 갓 준비된 주사 접시에 숙주 배아 수를 두 배로 늘립니다.

각 숙주 배아에서 렌막을 제거합니다. 캡이 있는 플레이트로 옮기되 렌 멤브레인이 없으면 주의하십시오. 배아는 200-250마이크로미터의 구부러진 와이어가 있는 노란색 팁이 장착된 위장 마스터를 사용하여 가장 높은 설정에서 또는 숫자 5 겸자를 사용하여 물 표면에서 빠르게 해리할 수 있습니다.

14-15단계에서 배아 측면의 200마이크로미터 정사각형을 제거합니다. 그런 다음 다시 위장 마스터 또는 숫자 5 집게를 사용합니다. 뚜껑을 반으로 자르고 숙주 배아에 만들어진 구멍에 조직을 넣습니다.

치유를 위해 배아를 우물 쪽으로 회전시킵니다. 15기에 있는 동안 가능한 한 많은 배아에 대해 이 작업을 수행합니다. 모든 시점에 대해 반복합니다.

배아는 보통 30분 이내에 치유됩니다. 그리고 5번 집게로 부드러운 칫솔질 동작으로 하얗게 보이는 죽은 세포를 제거합니다. 이식된 배아를 하룻밤 동안 섭씨 18도에서 성장시킵니다.

하룻밤 배양 후, 해부 형광 현미경 아래에서 작업하여 형광 표지된 이식 조직이 있는 배아를 분류합니다. 선택한 배아를 섭씨 18도로 다시 올려 42기에서 43기까지 성장시킵니다. 동물이 원하는 단계에 도달하면 트리카로 마취하고 형광 해부 현미경으로 검사하고 사진을 찍습니다.

그런 다음 이식된 배아를 고정, 절편 및 면역 염색하거나 관심 조직에 대한 마커를 사용하여 현장 교잡을 수행할 수 있습니다. 다음은 이식 하루 후 기증자 조직이 형광 추적자와 노긴을 발현하는 숙주 올챙이의 대표적인 결과입니다. 조직이 올챙이 측면에서 어떻게 뭉쳐 올라가는지 주목하십시오.

형광 추적자만 발현하는 조절된 기증자 조직을 받는 숙주 배아는 이미 동물 뚜껑 세포를 옆구리에 통합하기 시작합니다. 며칠 후, 기증자 세포를 발현하는 나인을 받는 올챙이는 옆구리에 눈과 같은 구조를 형성하고, 대조 기증자 조직을 받는 올챙이는 피부 표면에 형광 세포를 가지고 있습니다. Zaps Lavis에서 동물 캡 이식 분석을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 분석을 수행할 때. 배아가 당신이 얻을 수 있는 것보다 더 빨리 발달하지 않도록 그날 수술 전에 모든 것을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.