Name: 에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 Xenopus laevis 배아에서 동물 캡 이식(ACT) 어세이를 활용한 조직 결정 방법을. 유전자 과발현을 통해 눈과 같은 이소 조직 형성을 유도하고 형광 마커로 추적하는 기술을 익히세요.

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이 작품은 실명 (경력 개발 MEZ 및 ASV로 수상 및 안과의학과에 제한 부여), E. 마틸다 지글러 재단 (MEZ 및 ASV)와 국립 안과 연구소 / NIH (MEZ 방지 연구의 교부금에 의해 지원되었다 , 보조금 R01EY015748 및 R01EY017964).

부 I.는 ACT 분석을위한 셋업 <ol><li> 클로로포름 정화 방법 (; 응용 Biosystems / 앰비온, 오스틴, TX 예 mMessage mMachine 키트) : 자신의 페놀을 사용하는 것과 제조 업체에 의해 제안 주사 뒤덮인 RNA를 생성합니다. 형광 단백질을 인코딩 RNA는 추적으로 사용됩니다. 우리도 노란색 형광 단백질 (YFP) 또는 pCS2 + 발현 벡터에 cDNA mCherry 5, 고쳐 쓰다. </li><li> micropipette의 풀러를 사용하는 테이퍼 유리 도움말을 형성 borosilicate 유리 모세관 튜브를 당겨. 우리는 서터 Micropipette 풀러, P - 97 (셔터 인 스트 루먼트 주식 회사, 노바토, CA)를 사용하는 등 이전에 6 설명했다. </li><li> KCl 20 MM,, 20 MM CaCl 2; 50 MM의 HEPES, 1 M NaCl, 산도 7.5 조정, autoclaved과에 저장된 10 X 마크의 수정 링거스 (MMR) 솔루션 주식 (10 MM MgCl 2 표 1에서 살균 솔루션을 확인하십시오 RT). </li><li> 남자 개구리에서 testes 격리하고 1X MMR / gentamicin (50 μg / ML의 gentamicin 황산, BioWhittaker, 고양이 # 17 518Z)의 무균 용액 4 ° C에서 조직을 저장합니다. 이것은 실험 시작하기 전에 주일까지 할 수 있지만 시간이 지남에 따라 그 효능을 looses 그것입니다. </li><li> 에그 부설 솔루션은 (1X : 150 MM NaCl, 2.62 MM KCl, 0.8 MM 나 2 HPO 4, 20 MM Trizma 기지, 2.62 MM NaHCO 3 2.75 MM MgSO 4; 산도 7.6로 조정), 8X 주식으로 만들 수있는 4 저장할 수 있습니다 ° C 최대 2 주가에 대한 참고 사항 :.이 솔루션에서 오염에 대한 조심,이 계란의 품질에 영향을 미치지 않습니다. </li><li> 사출 접시를 생성합니다. 이렇게하려면 부드럽게 거품을 방지하고 약 식지하는 솔루션의 상단에 엘라스토머 금형 (그림 1)을 풀다, 60mm의 플레이트에 ~ 6 ML 녹아 아가로 오스 솔루션을 추가, 전자 레인지에 0.4X MMR에 1퍼센트 아가로 오스를 용융 RT 20 분. 필요한 번호를 확인하려면, 실험 조건의 수를 고려 (예 : 1, YFP, 2, YFP + 노긴) 및 이식 호스트 태아의 숫자가 필요합니다. 실험을 위해, 우리는 각각의 실험 조건에 대해 최소한 20 이식 호스트 배아를 생성합니다. 18-19 ° C에서, 배아는 약 한시간 단계 15 것입니다. 그것은 20 이식을 수행하기 위해 한 시간을 소요하는 경우가 두 수정 시간 지점은 호스트 배아 모든 이식을 받아 가정, 필요합니다. 따라서, 넷 사출 요리 (2 EXP 조건 X 2 수정 시간 포인트 = 4)가 필요합니다. 최대 일주일 4 ° C에서 접시를 저장합니다. </li><li> 사출 접시 등 금형과 1퍼센트 아가로 오스 + 0.7X MMR을 사용하여 절연 캡 플레이트를 생성합니다. 사출 번호판 더하기 하나 추가마다 수정의 시점 (4 + 2 수정 시간 점 = 6)로 절연 캡 같은 번호를 확인합니다. </li><li> microinjection 전날에 하루 늦게 인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 500 단위와 여성을 주사. 16-18 ° C 하룻밤에 저장 여자. </li></ol> 부 II. Xenopus laevis의 태아의 RNA의 Microinjection microinjection에 대한 A. 준비 <ol><li> hormonally 유도 여자를 제거하고 1X 계란 누워 솔루션 (ELS) 참고를 포함하는 각각의 탱크에서 그들을 장소 :. 우리는 계란의 품질이 감소로 ELS에 2 시간 이상 있었 계란을 사용하지 마십시오. 단 갓 알을 낳고가 수집되도록 따라서, 시간에 대한 체외의 수정에 전에, 우리는 수조의 모든 계란을 폐기합니다. </li><li> 25-35 μm의 직경을 얻을 수있는 팁을을 snipping하여 microinjection을 위해 바늘을 준비합니다. picoinjector에 바늘을 놓고 그것이 사출 당 10 NL을 dispenses 수 있도록 그것을 보정. </li><li> 14 ° C.에 배양기를 설정 </li><li> 일단 여성이 한 시간, 전송 피펫을 사용하여 탱크에서 계란을 제거하고 60mm 페트리 요리에 넣어 달걀을 마련했습니다. 가능한 계란에서 많은 ELS로 제거하고 1X MMR로 바꿉니다. 계란은 바로 수정된거나 시간을위한 1X MMR에 머물 수 있습니다. 장기 이식 분석을 위해, 그것은 주위 오전 11시, 오후 1시 별도의 세 가지 배치까지에 계란의 단일 층의 80 %가 꽉 들어찬 두개의 요리를 비옥하는 것이 좋습니다. 주입 후, 14에 배치됩니다 ° C 그래서 그들은 캡 절연 (무대 8.5-9)과 이식에 원하는 단계로 성장할 것으로 (단계 15; 위의 I, # 6 부 참조). </li><li> testes의 품질을 확인하기 위해, 우리는 처음부터 정자가 가능한되지 않을 경우 우리는 다른 남자의 testes를 추출할 수있는 이른 아침에 수정을 (~ 8 AM), 수행합니다. 참고 : 1 ML 1X MMR에서 ~ 0.25 testes를 균질하고 oocytes의 플레이트 당 약 5-7 방울을 추가합니다. </li><li> 체외에서 균질 testes와 달걀을 비옥하게하고, 한 시간 후, 드 젤리 솔루션을 사용하여 달걀에서 젤리 코트를 제거 (164μl 1M DTT + 10mL 1M 트리스, 최대 50 ML autoclaved nanopure 물로 산도 8.8). 그들은 18에서 2 시간 정도 소요 정렬을 시작하는 두 세포 단계에 도달할 때까지 기다려 실내 온도 (22 ° C)에서 ° C 1.5 시간. </li><li> transf를 사용어 피펫, 정렬 균일하게 색소와 고르게 나누어 배아가 같은 0.4X MMR + 6 % Ficoll 가득 사출 접시의 우물에, 그림 3의 왼쪽 동물 모자에 표시됩니다. </li></ol> B.의 Microinjection <ol><li> 60mm 페트리 접시 뚜껑의 맨 위에 Parafilm를 스트레치. 당신의 주사 바늘을 채우기 위해 PLI - 100를 사용하여 Parafilm 및 대기음에 처음으로 RNA 샘플의 피펫 2 μl. 바늘 아직도 주사를 시작하기 전에 샘플 10 NL을 분배 있는지 확인하시기 바랍니다. </li><li> 다른 접시 7 500 PG YFP 한 접시에 RNA와 관심의 유전자 (예 : 20 PG 노긴 RNA) 플러스 YFP RNA와 함께 20-30 두 세포 단계 배아 (모두 blastomeres) 주사. </li><li> Ficoll 용액 다른 사출 접시의 시점마다 장소 100-200 아닌 주입된 배아. 주입된 배아 동시에 보육의 그들을 밖으로 이동. 이러한 파트 IV에 사용할 수있는 호스트입니다. </li><li> 주사 후 14 ° C 하룻밤에 모든 배아를 품어. 모든 시간 지점 반복합니다. </li></ol> 부 III. 주입 배아에서 동물 모자를 분리 <ol><li> 배아 단계로 이른 아침에 도착. 최초의 시점은 9 단계에서해야합니다. 생존하지 않은 사람을 제거합니다. 배치의 각 시점 작업 다음 단계를 진행합니다. </li><li> 각 접시에서 Ficoll 용액을 붓고 다시 0.7X MMR / gentamicin 솔루션을 추가합니다. 캡 분리 요리하려면, 0.7X MMR / gentamicin 솔루션의 관대한 금액을 추가합니다. 신선한 캡 고립 접시에 전송 피펫과 장소를 사용하여 사출 접시의 우물에서 배아를 이동시키다. </li><li> 준비를위한 2 또는 3 그대로 배아를 유지, 0.7X MMR + gentamicin 솔루션에서 동물 모자를 분리. 노란 팁 400 μm의로 구부러진, 또는 날카로운 넘버 5 포셉 한 쌍의가 장착되어 Gastromaster 역시 사용할 수 있습니다. </li><li> 다음날까지 14 ° C 배양기에 다시 뚜껑을 넣어. 호스트 배아가 기증자의 조직과 같은 발달 단계에서 그들을 유지하는 뚜껑과 같은 시간에 인큐베이터에서 제거되어야합니다. </li></ol> 부 IV. 측면에 모자의 이식 <ol><li> 14 ° C 배양기에서 처음 지점에서 뚜껑과 배아를 제거하고 배아를 무대. 추적 주입 (그림 2)에 따라 균일한 노란색이나 빨간색 형광 - 긍정적인 모자에 대한 정렬. </li><li> 모자의 개수를 카운트하고 0.7X MMR / gentamicin 솔루션 신선한 사출 접시에 단계의 수를 12-13 배아를 두 번 제거합니다. 날카로운 # 5 포셉로 각 vitelline 멤브레인를 제거합니다. 뚜껑과 접시로 전송하지만, 조심 해요. 자신의 vitelline의 점막없이 배아 신속하게 물의 표면에서 떼어 놓다 수 있습니다. </li><li> gastromaster (노란색 팁 200 - 250μm 벤트 와이어, 최고의 설정) 또는 # 5 포셉를 사용하여 스테이지 14-15 (그림 3)에서 배 (胚)의 측면에 사각형 200 μm의를 제거합니다. 그렇다면 반으로 잘라 모자 (gastromaster 또는 # 5 포셉)와 호스트 배아에서 만든 구멍에 조직을 놓으십시오. 치유를 허용하도록 잘 대해 배아를 회전합니다. 그들이 단계 15있는 동​​안 당신이 할 수 많은 배아 동안이 작업을 수행합니다. 모든 시간 지점 반복합니다. </li><li> 배아는 보통 30 분 이내에 치유됩니다. # 5 포셉과 부드러운 모션 솔질과 죽은 세포 (흰색)을 제거합니다. 18 ° C 야간에 그들을 성장. </li><li> 해부 형광 현미경으로, 찬란 - 라벨, 이식 조직과 정렬 배아. 18 그들을 돌려 놔 ° C 단계가 42-43까지 성장합니다. </li><li> tricaine에있는 동물을 마취. 이 시점에서, 당신은 형광 해부 현미경으로 사진을 찍을 수 있습니다. 작업이 완료되면, 섹션을 수정하고 관심을 귀하의 조직에 대한 마커를 사용하여 현장 하이브리드화에 immunostain 또는 수행합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 배아 들고 요리를 만드는 데 사용되는 엘라스토머 금형 주조에 대한 플렉시 글라스의 디자인. 38 X 38mm 둥근 모서리의 사각형은 (~ 5mm 깊이) 50 X 50mm의 광장과 두께 25mm는 플렉시 글라스의 조각 밖으로 전달되었습니다. 원형, 균등하게 게재 우물 (1.5 mm 직경)은 플라스틱으로 깊이 1mm을 뚫고있다. microinjection 요리에 대한 엘라스토머 금형을 위해, 우리는 제조 업체의 지침에 따라, 플렉시 글라스에 Sylgard 탄성체를 부은하고 응고 수있었습니다. 이 엘라스토머 사출 금형이와 뚜껑의 절연 판을하는 데 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 표현이 다를 수로 이식하기 전에 정렬 동물 모자는 것이 중요합니다. 오른쪽에있는 explant이 드문드문 표현을 보유하고 삭제되지만 왼쪽에있는 동물 모자가 조직 전반에 걸쳐 고르게 mCherry 표현합니다. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 호스트 tadpOLE는 이식 동물 캡 세포로부터 측면에 눈 같은 구조를 개발했습니다. 형광 이미지가 브라이트 이미지에 overlayed되었습니다.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

이 비디오에서는, 우리는 동물 캡 이식 분석을 만들 재배열 Xenopus의 생물학 자에 의해 사용 고전 기법, 우리의 버전을 증명하고있다. 상온에서, Xenopus의 배아는 단계 9 15 매우 신속하게 개발할 수 있습니다. 14에 그들을 배치함으로써 ° C, 배아의 발달 속도가 느려졌되고 더 많은 이식 한 실험에서 수행할 수 있습니다. 이 세 단계 (&gt; 43분의 42)에 배아를 성장하기 위해 필요한 경우, 우리는 나이 tadpoles에서 주입된 형광 단백질 신호 페이드 때문에, 유전자 변형 비너스 YFP 동물을 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 EFTFs 또는 노긴은 눈 같은 조직 형태 지정을 표현하는 것을 동물 모자 조직을 수립하는 분석를 사용합니다. 이 분석은 관심의 유전자가 (S) 특정 세포의 운명을 결정하는 필요 여부를 설정하는 간단한 테스트로 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>mMessage mMachine SP6 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>붕규산염 모세관 튜브 (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Sutter 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard/elastomer 키트 1.1lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>인성 융모성 성선 자극 호르몬</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Pico-Injector 미세주입 시스템</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm 배양기</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>전이 피펫</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Dumostar #5 포셉</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

에있는 동물 캡 이식 (act) 어세를 사용하여 조직 결정 xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

많은 단백질은 배아 발달의 이중 역할을한다. 특정 조직의 세포 운명 결정을 규제 이들은 또한 배아의 큰 지역의 발전에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 분석하기 어려운 특정 조직에서의 역할을 정의합니다. 예를 들어,<em&gt; 소량</em&gt;의 overexpression<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 태아의 눈을 포함 전체 앞쪽에 영역의 확장을 원인<sup&gt; 1,2</sup&gt;. 이 결과로부터, 그것은 노긴은 신경 조직의 확장을 일으키는하여 눈의 결정 또는에 직접적인 역할을 수행하는 경우, 노긴는 간접적으로 안구 형성에 영향을 알 수 없습니다. 이 복잡​​한 표현형를 갖는 것은 분석 세포 운명 결정에의 눈을 특정 역할이 어려운 공부합니다. 우리는이 문제를 극복 분석을 개발했습니다. 의 pluripotent 자연을 활용<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 동물 모자<sup&gt; 3</sup&gt; 우리는 같은 유전자 산물의 기능 (들)을 테스트하는 시험을 개발했습니다<em&gt; 소량</em&gt; 또는 눈 필드 전사 요인 (EFTFs)은 배 (胚)의 측면에이 조직을 이식하여 특정 조직이나 세포 종류로 모자를 변환하기<sup&gt; 4</sup&gt;. 우리가 노긴 단백질 치료 또는 전사 요소의 컬렉션 중 하나가 동물 대문자로 망막 세포의 운명을 결정할 수 찾았지만,이 절차는뿐만 아니라 다른 조직을 지정에 관련된 유전자 산물 (들)을 식별하는 데 사용될 수 있습니다.

동물 모자 overexpressing 유전자 제품 (들)은 개발의 측면에 이식 아르<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아는 순서대로 조직이 결정 여부를 설정합니다.

에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis</em

많은 단백질이 배아 발달에서 이중적인 역할을 수행합니다. 특정 조직에서 세포 운명 결정을 조절하는 단백질은 발달에도 영향을 미칠 수 있으며...

A CT 분석의 전반적인 목표는 관심 유전자 또는 유전자군이 원시 외배엽을 특정 세포 운명으로 지정할 수 있는지 테스트하는 것입니다. 이 절차는 먼저 형광 리포터 유전자를 코딩하는 RNA와 관심 유전자를 발달 중인 Xenopus laevis 배아에 과발현시키는 것으로 시작합니다. 다음 단계는 과발현된 RNA를 발현하는 동물 캡(animal cap) 또는 원시 외배엽을 분리하여 15단계까지 성장시키는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 15단계 호스트 배아의 옆구리 부위 조직을 제거하는 것입니다. 마지막 단계는 공여체 동물 캡 조직의 절반을 호스트 배아의 옆구리에 이식하고, 호스트를 42단계에서 43단계까지 성장시키는 것입니다. 결과는 절편 제작 및 조직 특이적 마커에 대한 면역 염색을 통해 눈과 유사한 구조와 같은 이異소성 조직 형성을 보여줍니다.안녕하세요, 저는 Upstate Medical University 안과 대학의 and sine입니다. 오늘 저는 Mike Suber와 공동으로 개발한 animal cap transplant assay라고 불리는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 두 실험실 모두에서 안구 형성에 충분한 유전자들을 연구하기 위해 이 분석법을 사용하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 주입에 사용할 cap RNA를 준비하십시오. 이를 위해 noggin 또는 다른 관심 유전자와 추적자로 사용할 YFP를 전사합니다. 또한 MMR 기반 용액, 8x 산란 용액 스톡 및 배아 주입용 바늘을 준비하십시오.배아 유지 디쉬를 제작하기 위해 맞춤 제작된 엘라스토머 몰드를 사용합니다. 마이크로파를 이용해 0.4 XMMR 내의 1% AROS를 녹여 실험 조건당 하나의 인젝션 플레이트를 생성합니다. 이 용액 약 6밀리리터를 60밀리미터 플레이트로 옮깁니다.기포 발생을 방지하기 위해 용액 위에 엘라스토머 몰드를 조심스럽게 올리고 약 20분 동안 식힙니다. 실온에서, 앞서 인젝션 플레이트에 대해 보여준 것과 동일하게 몰드를 사용하여 1% AGROS와 0.7 XMMR을 이용해 실험 조건당 하나의 캡 격리 플레이트를 제작합니다. 각 시점별로 추가 플레이트를 준비합니다.시간 지점 계산에 관한 자세한 내용은 함께 제공된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로 분리하십시오. 수컷 개구리로부터 이를 테스트하고, 50 µg/mL의 Gentamycin이 첨가된 1X MMR 멸균 용액에 조직을 4 °C에서 보관하십시오.이 과정은 실험 시작 최대 일주일 전까지 수행할 수 있으나, 정자는 시간이 지남에 따라 효능이 감소하며 미세주입 전날 늦은 시간까지 유지됨에 유의하십시오. 암컷에 human chorionic gonadotropin 500 units를 주입합니다. 암컷을 16 to 18 °C에서 하룻밤 동안 둡니다.이제 다음 날 진행할 미세주입을 위한 모든 준비가 완료되었습니다. 우선 호르몬 유도된 암컷들을 꺼내어 XELS 한 마리가 들어 있는 개별 수조에 넣습니다. 바늘의 끝부분을 잘라내어 미세주입용 바늘을 준비합니다.25에서 35 µm 직경을 얻으려면, 바늘을 PLI 100 pico injector에 장착하고 1회 주입 시 10 nL가 분사되도록 보정하십시오. 인큐베이터를 14 °C로 설정하십시오. RNA를 주입한 후 더 낮은 온도에 두면 배아의 발달 속도가 느려져 한 번의 실험에서 더 많은 이식을 수행할 수 있습니다. 수정 약 1시간 전에 탱크에서 알을 꺼내십시오. 암컷이 1시간 더 산란하면, 전송 피펫을 사용하여 탱크에서 새로 낳은 알을 제거하십시오.ELS 용액에 2시간 이상 담겨 있었던 난자는 사용하지 않도록 주의하십시오. 난자의 품질이 저하되므로, 난자를 60 millimeter 페트리 접시에 담습니다. 접시의 약 80%가 난자 단층으로 채워지도록 합니다.난자에서 ELS를 최대한 제거하고 XMMR 하나로 교체합니다. 난자는 최대 1시간 동안 XMMR에 보관할 수 있습니다. 다음으로, 균질화된 정소 조직을 사용하여 난자를 체외 수정시킵니다.배아가 원하는 단계(캡 분리를 위한 8.5~9단계 및 이식을 위한 15단계)까지 성장할 수 있도록, 오전 11시, 정오, 오후 1시경에 세 번에 나누어 수정시키는 것이 가장 좋습니다. 수정 1시간 후, D jelly Solution Wash를 사용하여 알의 젤리 코트를 제거하고 0.1 XMMR로 충분히 세척한 다음, 수정란이 2세포기에 도달할 때까지 기다립니다.분류를 시작하려면 0.4 XMMR과 6% F ccal가 채워진 주입 디쉬를 준비하십시오. 배아가 2세포기에 도달하면, 전이 피펫을 사용하여 색소 침착이 균일하고 고르게 분열되는 배아를 선택해 주입 디쉬의 웰로 분류하십시오.마이크로인젝션 단계로 넘어가기 위해 먼저 60 mm 페트리 접시 뚜껑 위에 스트레치 퍼필을 씌웁니다. RNA 샘플 2 µL를 바이오필름 위에 피펫으로 분주하고 흡입합니다. 피코 인젝터를 사용하여 주입용 바늘을 채웁니다.주입을 시작하기 전에 바늘이 여전히 10 liters의 샘플을 분주하고 있는지 확인하십시오. RNA는 2세포기 배아의 양쪽 블래스터에 주입합니다. 20~30개의 배아 각각에 500 picograms의 Y-F-P-R-N-A를 주입하고 하나의 디쉬에 담으십시오.다른 배아 20~30개에 Y-F-P-R-N-A와 미리 혼합한 Nain RNA 20 picograms를 각각 주입하고 디시에 넣습니다. 또한, 시점당 100~200개의 주입되지 않은 배아를 FICO 용액이 들어 있는 다른 주입용 디시에 넣습니다. 이 배아들을 주입된 배아들과 동시에 인큐베이터에 넣고 꺼냅니다.이들은 주입 후 캡을 이식하는 데 사용될 호스트입니다. 모든 배아를 14 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 계획된 모든 시점에 대해 이 과정을 반복하십시오.밤새 배양한 후, 동물극 캡(animal cap)을 분리할 수 있습니다. 배아의 단계를 확인하기 위해 이른 아침에 도착하십시오. 주입되지 않은 호스트 배아 또한 인큐베이터에서 꺼내는 것을 잊지 마십시오.가장 이른 시점은 9단계여야 합니다. 먼저, 생존하지 못한 배아를 제거하십시오. 이후 생존 가능한 배아로부터 동물극 캡(animal caps)을 분리하며, 각 시점별로 배치를 나누어 캡 분리 접시에 담습니다.0.7 XMMR 및 gentamycin 용액을 충분한 양으로 첨가합니다. 그런 다음 주입된 배아가 들어 있는 각 플레이트에서 fol 용액을 따라내고 0.7 XMMR 및 Gentamycin 용액을 다시 채웁니다. 트랜스퍼 피펫을 사용하여 주입 접시 웰에서 배아를 분리한 후, 새로 준비한 캡 격리 접시에 옮깁니다.400 µm로 구부러진 옐로우 팁이 장착된 gastro master 또는 날카로운 5번 포셉을 사용하여 0.7 XMMR 및 Gentamycin 용액에서 동물극 캡(animal caps)을 분리합니다. 단계 확인(staging)을 위해 손상되지 않은 배아 2~3개를 남겨둡니다. 동물극 캡을 분리한 후, 다음 날 호스트 배아의 측면에 캡을 이식할 때까지 호스트 배아와 함께 14 °C 인큐베이터에 보관합니다.14 °C 인큐베이터에서 첫 번째 시점의 캡과 호스트 배아를 꺼내 배아의 단계를 확인하고, 형광 양성 반응이 균일하게 나타나는 캡을 선별합니다. 캡의 수를 센 후 제거합니다. 날카로운 5번 핀셋을 사용하여 0.7 XMMR 및 Gentamycin 용액이 담긴 새로 준비한 주입 접시에 호스트 배아 수를 두 배로 옮깁니다.각 호스트 배아에서 Lene 막을 제거합니다. 이를 캡이 있는 플레이트로 옮기되, Lene 막이 없는 상태이므로 주의하십시오. 200~250 µm 굽은 와이어가 장착된 옐로우 팁을 끼운 gastro master를 최고 설정으로 사용하거나 5번 핀셋을 사용하여 배아를 수면에서 빠르게 분리할 수 있습니다.14~15단계 배아의 측면에서 200 µm² 크기의 조직을 제거합니다. 그 다음 gastro master 또는 5번 포셉을 사용하여 캡을 절반으로 자르고, 해당 조직을 호스트 배아에 만든 구멍에 배치합니다.배아가 15단계인 동안 가능한 한 많은 배아를 웰 벽에 대고 회전시켜 회복되도록 합니다. 모든 시점(time point)에 대해 이 과정을 반복합니다.배아는 보통 30분 이내에 회복됩니다. 그리고 5번 포셉을 사용하여 하얗게 보이는 죽은 세포들을 부드럽게 쓸어내듯 제거하십시오. 이식된 배아를 18 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.하룻밤 동안 배양한 후, 해부용 형광 현미경 하에서 형광 표지된 이식 조직이 있는 배아를 선별합니다. 선택한 배아를 18 °C로 다시 옮겨 42~43단계까지 성장시킵니다. 동물이 원하는 단계에 도달하면 trica로 마취시킨 후 형광 해부 현미경으로 관찰하고 사진을 촬영합니다.이식된 배아는 고정, 절편 제작 및 면역 염색을 거치거나, 관심 조직에 대한 마커를 사용하여 인시투 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행할 수 있습니다. 다음은 이식 1일 후, 형광 추적자와 noggin을 발현하는 공여자 조직이 포함된 숙주 올챙이의 대표적인 결과입니다. 조직이 올챙이의 측면에서 뭉쳐 있는 모습에 주목하십시오.형광 추적자만 발현하는 대조군 공여 조직을 이식받은 숙주 배아는 이미 측면에 동물 극 세포들을 통합시키기 시작합니다. 며칠 후, nain을 발현하는 공여 세포를 이식받은 올챙이는 측면에 눈과 유사한 구조를 형성하는 반면, 대조군 공여 조직을 이식받은 올챙이는 피부 표면에 형광 세포들이 나타납니다. 지금까지 Xenopus laevis에서 동물 극 이식 분석법을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.이 분석을 수행할 때, 배아가 실험자가 처리할 수 있는 속도보다 더 빠르게 발달하지 않도록 당일 절차 시작 전에 모든 준비를 마치는 것이 중요합니다. 이상으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

Xenopus의 사이에 얼굴 조직을 "극단적 인 전방 도메인"이식에 대한 기술은 배아가 개발 한 laevis의. 조직은 두개 안면 개발 및 얼굴 영역 사이의 상호 작용을 신호에 대한 지역의 요구 사항의 연구를 허용, 또 다른 한개로 1 유전자 발현 배경에서 이동할 수 있습니다.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

이 문서 섹션에 면역 형광 염색법을 사용하여 Xenopus의 배아의 중추 신경계에서 다른 신경 세포 집단을 시각화 편리하고 빠른 방법을 제시한다.

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

우리는 간단하고 빠른 병기 결정 방법으로 최적화된 투명한 제브라피시 배아의 난황에 이종 이식을 위한 프로토콜을 설명합니다. 주입 후 분석에는 생존 및 유세포 분석을 통한 이종 이식 세포의 질병 부담 평가가 포함됩니다.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

이것은 포괄적인 Xenopus 샘플링 프로토콜의 첫 번째 부분입니다. 표본 조직은 심실, 동맥 줄기, 왼쪽 간엽, 담낭, 폐, 췌장, 비장, 후두, 식도, 위, 장, 고환, 지방체, 난관, 쌍을 이루는 신장, 좌골신경총, 피부, 흉선 및 눈 전체입니다.

성체 제노푸스(Xenopus)에서 접근 가능한 조직의 포괄적인 샘플링을 위한 효율적인 기술

배우세요 Xenopus laevis 배아에서 동물 캡 이식(ACT) 어세이를 활용한 조직 결정 방법을. 유전자 과발현을 통해 눈과 같은 이소 조직 형성을 유도하고 형광 마커로 추적하는 기술을 익히세요.

에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis

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