자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

자기 변조 바이오센싱(Magnetic modulation BIOSENSING) 또는 MMB는 생체 분자를 검출하기 위한 새로운 기술입니다. 여기에서는 항-IL-8 항체가 코팅된 자성 비드와 형광 표지된 스트렙타비딘이 포함된 반응 혼합물에 IL-8이라고도 불리는 인터루킨 8을 첨가했을 때, 인터루킨 8이 검출되는 원리 증명 분석법을 보여줍니다. 이를 통해 형광 분자와 자성 비드가 효과적으로 연결된 분자 샌드위치가 형성됩니다.

반응물을 큐벳과 교번 자기장 내에 배치합니다. 두 개의 전자기 극을 통해 구배를 인가하면 비드가 진동 운동을 하게 됩니다. 형광 단백질이 부착된 비드가 직교 레이저 빔을 주기적으로 드나들며 발생하는 형광 신호를 PMT로 수집하고 복조합니다.

락인 증폭기를 사용하면, PMT 대신 CCD 카메라를 이용해 비드의 움직임을 시각화할 수 있으며, 자기 비드가 IL-8을 통해 형광 단백질과 결합된 샘플에서 동기화된 움직임이 관찰됩니다. 안녕하세요, 텔아비브 대학교 물리 전자학과의 비선형 광학 및 레이저 연구실 소속 Adia입니다. 시카고 일리노이 대학교 생물과학과의 NoGo입니다. 그리고 텔아비브 대학교 세포 연구 및 면역학과의 Marcelo Erlich입니다.

오늘은 자기 변조 바이오센싱 시스템을 이용하여 생물학적 분석물을 신속하고 균질하게 검출하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 저농도의 특정 단백질과 DNA 서열을 검출하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

타겟 샘플과 비타겟 대조군 샘플을 포함하여 각 반응당 튜브를 준비하고 라벨을 붙이는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 각 튜브에 bio plex Precision Pro 사이토카인 분석 키트의 다음 구성 성분인 coupled magnetic beads, detection IL eight antibody, streptavidin PE 및 IL eight Target을 차례대로 첨가하십시오. assay buffer를 사용하여 부피를 100 microliters로 맞춘 후, 컴팩트 궤도 쉐이커(compact orbital shaker)에서 30분 동안 흔들어 섞어주십시오.

시료를 상온에서 30분 동안 흔들어 섞은 후, 분석을 위해 큐벳에 직접 넣습니다. 렌즈 세척 티슈와 70% ethanol을 사용하여 MMB 시스템 투명 큐벳을 닦아냅니다. 분석에 사용되는 기기는 들뜸 광원으로 사용되는 488 nanometer 주파수 배가 레이저와, 562 nanometer 다이크로익 빔 스플리터를 통해 현미경 대물렌즈로 빛을 유도하는 장치로 구성됩니다.

현미경 대물렌즈는 레이저를 400 µm 너비의 BO 규산염 유리관 내에서 27 µm의 빔 허리(beam waste)로 집속시킵니다. 방출된 빛은 두 개의 연속적인 밴드패스 필터를 통해 스펙트럼 필터링 된 후 광전증배관(PMT)에 의해 검출되며, 락인 증폭기(lock-in amplifier)를 사용하여 복조됩니다. 자체 제작한 전류 변조기를 사용하여 각 전자석에 순차적으로 사각파를 전달합니다.

비드가 매 사이클마다 레이저 빔에 두 번 진입하고 빠져나오므로, 진폭은 1.4 amps, 주파수는 1~6 hertz여야 합니다. 락인 앰플리파이어의 복조 주파수는 2~12 hertz입니다. 488 nanometer 레이저 키를 on 위치로 돌리고 전원을 켜서 시스템을 시작하십시오.

그런 다음 레이저 출력을 약 4~6 mW의 최소치로 설정하십시오. 오실로스코프를 켠 다음 PMT를 켭니다. 다음으로 두 전자기 극 사이에 샘플 큐벳을 배치하십시오.

vete의 회전 스테이지를 사용하여 레이저 빔이 vete를 통과하고 vete의 벽면에 닿지 않도록 조정하십시오. vete의 XY, Z 이동 스테이지를 사용하여 대물렌즈 및 전자기 극에 대한 위치를 변경하십시오. 검출기로 들어가는 형광의 결합을 최적화하려면 vete를 극 라인보다 약간 뒤쪽에 위치시켜야 합니다.

이제 오실로스코프를 시간 트레이스 측정 모드로 설정하십시오. PMT 게인 조절 장치를 0.5 bolts로 설정하십시오. 다음으로 전류 변조기를 켜고, 주파수를 3 Hz로 설정하십시오.

비드의 응집과 응축이 일어날 수 있도록 30초 동안 기다립니다. 자성 비드가 진동하며 튜브 앞쪽으로 이동하기 시작할 것입니다. 레이저 빔이 진동하는 비드에 닿으면, 비드에서 반사된 레이저 빛의 깜빡임이 보여야 합니다.

전류 변조가 증가함에 따라 비드가 더 빠르게 움직이고, 감소함에 따라 더 느리게 움직이는 것을 확인할 수 있습니다. 튜브 내 비드의 위치는 마이크로미터 제어 스테이지를 사용하여 조정할 수 있습니다. 극의 비드 이동을 관찰하려면 PMT 대신 배치된 CCD 카메라를 사용하여 시각화할 수 있습니다.

오실로스코프는 형광 결합 비즈로부터 나오는 주기적 신호를 감지하며, 오실로스코프의 시간 추적(time trace)을 기록합니다. 저장된 데이터는 MATLAB을 사용하여 분석할 수 있으며, IL 8이 포함된 반응 혼합물과 포함되지 않은 반응 혼합물을 MMB로 분석하였습니다. 표적 물질이 포함된 모든 반응에서, 비즈는 레이저 빔 안팎으로 동기화되어 이동하는 단일한 조밀한 응집체를 형성했습니다.

하지만 표적이 없을 때 비드는 덜 응집되었으며 그 움직임 또한 덜 일치했습니다. 여기에서 노란색으로 표시된 극 변조 클록(pole modulation clock)과 마젠타색으로 표시된 PMT 출력 신호는 각 극의 변조 주파수가 2 Hz임을 나타냅니다. 따라서 복조 주파수는 이론적으로 예상된 바와 같이 4 Hz입니다.

비드가 레이저 빔을 통과할 때 PMT가 형광을 감지하며, PMT 신호와 이중 변조 클록이 락인 증폭기로 입력되면 PMT 출력 전압에 피크가 나타납니다. 정밀한 위상 검출기가 동기화 및 결과를 고전압으로 처리합니다. 두 가지 색상은 동일한 표적 농도에서 수행된 두 번의 서로 다른 스캔을 나타냅니다.

검은색 선은 각 신호의 평균을 나타냅니다. 대조군 샘플을 테스트했을 때 락인 앰프(lock-in amplifier)에서 아무런 신호도 검출되지 않았습니다. 이 경우 락인 앰프에서 어떠한 락드 신호(locked signal)도 제공되지 않았습니다.

이러한 사실은 응집의 시각적 차이와 더불어, MMB 시스템과 PMT 출력 신호의 시간 추적 측정값 차이를 통해 IL-8 타겟의 존재를 명확하게 식별할 수 있음을 시사합니다. 지금까지 IL-8을 예시로 하여 자기 변조를 이용해 생체 분자를 신속하고 균질하게 검출하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때는 레이저 안전 수칙을 준수하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.