Name: 자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 배우세요 자기 변조 바이오센싱(MMB) 시스템을 사용하여 IL-8과 같은 생물학적 분자를 세척 단계 없이 신속하고 균일하게 검출하는 방법을. 이 기술은 형광 표지된 자기 비드와 교류 자기장을 활용하여 높은 감도로 타겟 분자를 식별합니다.

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이 작품은 일부 Ishaya 호로비츠 기금에 의해 지원되었다.

IL - 8 검정 : <ol><li> 각각의 농도의 분석 완충액 100 μl 최종 볼륨의 반응 혼합물은 다음 네 가지 구성 요소가 포함되어 있습니다. 100 구슬 / μl 최종 농도 1 nano-gram/μl 최종 농도에 biotinylated IL - 8 항체 2 μl, 20 nano-gram/μl 최종 농도에 streptavidin 형광 단백질의 1 μl에서 캡처 항체와 자석 구슬 10 μl 0.48 pico-gram/μl에서 IL - 8 대상의 1 μl. 구성 요소 분석 버퍼를 하나씩 추가하고 30 분 흔들리고 있습니다. </li><li> 제어 반응은 IL - 8 대상없이 동일한 방식으로 준비가되어 있습니다. </li><li> 반응은 나중에 cuvettes에서 분리 또는 세척 단계없이 배치와 MMB 시스템을 사용하여 검사하고 있습니다. </li></ol> MMB 시스템 : <ol><li> 두 전자기 채를 사이의 위치에 쿠베트를 놓습니다. </li><li> 변조 전류를 운영하고 구슬의 집합과 결로 수 있도록 30 초 기다 </li><li> 잠금 기능 증폭기 오실로 스코프를 사용하는 신호를 측정합니다. </li></ol> 대표 결과 : 집계 비즈의 육안 검사는 대상과 함께 반응과 목표없이 반응 사이에 뚜렷한 차이를 발표했다. 대상 모든 반응에서 구슬이 단결의 방식으로 레이저 빔을에서 이사 단일 고밀도 집적을 형성. 그러나, 대상없이 모든 반응에 구슬이 적게 집계되었으며 그들의 움직임은 (그림 1 참조) 덜 단결했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 목표없이 샌드위치 '면역 분석법의 육안 검사 (A) IL - 8의 대상 IL - 8 (B). 극 변조 시계 (노란색)와 PMT 출력 신호 (마젠타) 0.48 피코 그램 - IL - 8 목표를 감지하는 동안은 (A) 그림 1에서 제공됩니다. 각 극에 대한 변조 주파수 2 Hz에서에 있습니다. 그러나, 그것이 이론적으로 예상되면서, 구슬이 레이저 광선을 통과하면 PMT는 형광등을 감지하고 PMT 출력 전압의 피크가 있습니다. 따라서 복조 주파수는 4 Hz에서에 있습니다. PMT 신호와 두 - 변조 시계 (4 Hz에서에서) 증폭기의 잠금을 먹이로하는 경우, 민감한 위상 검출기는 동기화 및 고전압 (그림 2 참조) 결과를 감지합니다. <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : (A) 변조 시계 (노란색)와 PMT 신호 (마젠타) 감지 0.48 피코 그램 - IL - 8 타겟팅할 수 있습니다. 두 가지 검사에서 증폭기 전압에서 (B) 결과 잠금. 증폭기의 잠금 제어 샘플을 테스트되었습니다 어떤 신호를 감지하지 않았다. 이 사실은 함께 집합의 시각 차이와 MMB 시스템이 명확하게 IL - 8 대상의 존재를 확인할 수 제안합니다.

<ol><li>Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fluorescent-labeled+probes+at+sub-picomolar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation.</a> Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).</li>
<li>Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+homogenous+detection+of+the+Ibaraki+virus+NS3+cDNA+at+pico-molar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+%22Human+angiogenesis+assay+panel%22%22">Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel"</a>. , Bio-Plex Pro. Forthcoming.</li>
<li>Instruction Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Plex+Precision+Pro+Cytokine+Assay%22">Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay</a>. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.</li>
</ol>

요약, 우리는 MMB 시스템이 낮은 농도 (0.5 피코 - g가 [3,4] 바이오 플렉스 정밀 프로 시토킨 assays의 검출 한계입니다)에서 IL - 8 대상의 존재를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났다. 시스템의 기능은 IL - 8에 국한되지 않으며 다른 단백질을 탐지하는 데 사용할 수 있습니다. MMB 시스템의 장점은 빠른 속도로 및 분리 또는 세척 단계없이 목표물을 감지하는 능력입니다. 따라서, 그것은 검색 프로세스를 용이하게하고 시스템을 현장 애플 리케이션에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 세트</td><td>Bio-Rad</td><td>171-B5008M</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-8 타겟</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>R202625</td><td></td></tr><tr><td>Biotin 결합 단클론 마우스 항 인간 IL-8 항체 G265-8</td><td>BD Biosciences</td><td>554718</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 결합 형광 단백질</td><td>Bio-Rad</td><td>Streptavidin PE</td><td></td></tr></tbody></table>

자기 변조 biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 assays의 급속한 동차 검색

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

자기 변조 biosensing 시스템 (MMB) [1,2] 빠르게하고 세척 또는 분리 단계없이 낮은 농도에서 homogeneously 감지 생물 학적 대상으로하고 있습니다. IL - 8 목표는 현재의 때, &#39;sandwich&#39; 기반 분석은 IL - 8 대상과 biotinylated IL - 8 항체 결합을 통해 형광 단백질을 streptavidin하는 IL - 8 캡처 항체와 자기 구슬을 첨부. 자석 구슬은 두 개의 전자 기둥을 통해 교류 자기장 기울기를 적용하여 oscillatory 모션으로 였는데 있습니다. 자석 구슬에 연결된 형광 단백질은 직교 레이저 빔을 동기 검출을 사용 복조된하는 정기 형광 신호를 생산에서 퇴원 감지 영역과 운동으로 응축됩니다. 자기 변조 biosensing 시스템은 이전에 비 구조 이바라키 바이러스 단백질 3 (NS3) 보완 DNA (cDNA) [2]의 코드 시퀀스를 검색하는 데 사용되었다. 입자의 외부 조작 및 응축이 작품 시연되는 기술은 다른 응용 프로그램, 자기 (磁 气) - 결합 약물의 예를 들어 전달에 사용할 수 있습니다<em&gt;에 - 생체내</em&gt; 또는 대비를 강화<em&gt;에 - 생체내</em&gt; 이미징 응용 프로그램.

자기 변조 biosensing 시스템은 빠르게, sensitively 단순히 같은 DNA 분자와 단백질과 같은 생물 학적 assays를 감지하는 활용됩니다.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

자기 변조 바이오센싱 시스템(magnetic modulation biosensing system, MMB) [1,2]은 세척 과정 없이 낮은 농도의 생물학적 표적을 신속하고 균질하게 검출하였으며...

자기 변조 바이오센싱(Magnetic modulation BIOSENSING) 또는 MMB는 생체 분자를 검출하기 위한 새로운 기술입니다. 여기에서는 항-IL-8 항체가 코팅된 자성 비드와 형광 표지된 스트렙타비딘이 포함된 반응 혼합물에 IL-8이라고도 불리는 인터루킨 8을 첨가했을 때, 인터루킨 8이 검출되는 원리 증명 분석법을 보여줍니다. 이를 통해 형광 분자와 자성 비드가 효과적으로 연결된 분자 샌드위치가 형성됩니다.반응물을 큐벳과 교번 자기장 내에 배치합니다. 두 개의 전자기 극을 통해 구배를 인가하면 비드가 진동 운동을 하게 됩니다. 형광 단백질이 부착된 비드가 직교 레이저 빔을 주기적으로 드나들며 발생하는 형광 신호를 PMT로 수집하고 복조합니다.락인 증폭기를 사용하면, PMT 대신 CCD 카메라를 이용해 비드의 움직임을 시각화할 수 있으며, 자기 비드가 IL-8을 통해 형광 단백질과 결합된 샘플에서 동기화된 움직임이 관찰됩니다. 안녕하세요, 텔아비브 대학교 물리 전자학과의 비선형 광학 및 레이저 연구실 소속 Adia입니다. 시카고 일리노이 대학교 생물과학과의 NoGo입니다. 그리고 텔아비브 대학교 세포 연구 및 면역학과의 Marcelo Erlich입니다.오늘은 자기 변조 바이오센싱 시스템을 이용하여 생물학적 분석물을 신속하고 균질하게 검출하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 저농도의 특정 단백질과 DNA 서열을 검출하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.타겟 샘플과 비타겟 대조군 샘플을 포함하여 각 반응당 튜브를 준비하고 라벨을 붙이는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 각 튜브에 bio plex Precision Pro 사이토카인 분석 키트의 다음 구성 성분인 coupled magnetic beads, detection IL eight antibody, streptavidin PE 및 IL eight Target을 차례대로 첨가하십시오. assay buffer를 사용하여 부피를 100 microliters로 맞춘 후, 컴팩트 궤도 쉐이커(compact orbital shaker)에서 30분 동안 흔들어 섞어주십시오.시료를 상온에서 30분 동안 흔들어 섞은 후, 분석을 위해 큐벳에 직접 넣습니다. 렌즈 세척 티슈와 70% ethanol을 사용하여 MMB 시스템 투명 큐벳을 닦아냅니다. 분석에 사용되는 기기는 들뜸 광원으로 사용되는 488 nanometer 주파수 배가 레이저와, 562 nanometer 다이크로익 빔 스플리터를 통해 현미경 대물렌즈로 빛을 유도하는 장치로 구성됩니다.현미경 대물렌즈는 레이저를 400 µm 너비의 BO 규산염 유리관 내에서 27 µm의 빔 허리(beam waste)로 집속시킵니다. 방출된 빛은 두 개의 연속적인 밴드패스 필터를 통해 스펙트럼 필터링 된 후 광전증배관(PMT)에 의해 검출되며, 락인 증폭기(lock-in amplifier)를 사용하여 복조됩니다. 자체 제작한 전류 변조기를 사용하여 각 전자석에 순차적으로 사각파를 전달합니다.비드가 매 사이클마다 레이저 빔에 두 번 진입하고 빠져나오므로, 진폭은 1.4 amps, 주파수는 1~6 hertz여야 합니다. 락인 앰플리파이어의 복조 주파수는 2~12 hertz입니다. 488 nanometer 레이저 키를 on 위치로 돌리고 전원을 켜서 시스템을 시작하십시오.그런 다음 레이저 출력을 약 4~6 mW의 최소치로 설정하십시오. 오실로스코프를 켠 다음 PMT를 켭니다. 다음으로 두 전자기 극 사이에 샘플 큐벳을 배치하십시오.vete의 회전 스테이지를 사용하여 레이저 빔이 vete를 통과하고 vete의 벽면에 닿지 않도록 조정하십시오. vete의 XY, Z 이동 스테이지를 사용하여 대물렌즈 및 전자기 극에 대한 위치를 변경하십시오. 검출기로 들어가는 형광의 결합을 최적화하려면 vete를 극 라인보다 약간 뒤쪽에 위치시켜야 합니다.이제 오실로스코프를 시간 트레이스 측정 모드로 설정하십시오. PMT 게인 조절 장치를 0.5 bolts로 설정하십시오. 다음으로 전류 변조기를 켜고, 주파수를 3 Hz로 설정하십시오.비드의 응집과 응축이 일어날 수 있도록 30초 동안 기다립니다. 자성 비드가 진동하며 튜브 앞쪽으로 이동하기 시작할 것입니다. 레이저 빔이 진동하는 비드에 닿으면, 비드에서 반사된 레이저 빛의 깜빡임이 보여야 합니다.전류 변조가 증가함에 따라 비드가 더 빠르게 움직이고, 감소함에 따라 더 느리게 움직이는 것을 확인할 수 있습니다. 튜브 내 비드의 위치는 마이크로미터 제어 스테이지를 사용하여 조정할 수 있습니다. 극의 비드 이동을 관찰하려면 PMT 대신 배치된 CCD 카메라를 사용하여 시각화할 수 있습니다.오실로스코프는 형광 결합 비즈로부터 나오는 주기적 신호를 감지하며, 오실로스코프의 시간 추적(time trace)을 기록합니다. 저장된 데이터는 MATLAB을 사용하여 분석할 수 있으며, IL 8이 포함된 반응 혼합물과 포함되지 않은 반응 혼합물을 MMB로 분석하였습니다. 표적 물질이 포함된 모든 반응에서, 비즈는 레이저 빔 안팎으로 동기화되어 이동하는 단일한 조밀한 응집체를 형성했습니다.하지만 표적이 없을 때 비드는 덜 응집되었으며 그 움직임 또한 덜 일치했습니다. 여기에서 노란색으로 표시된 극 변조 클록(pole modulation clock)과 마젠타색으로 표시된 PMT 출력 신호는 각 극의 변조 주파수가 2 Hz임을 나타냅니다. 따라서 복조 주파수는 이론적으로 예상된 바와 같이 4 Hz입니다.비드가 레이저 빔을 통과할 때 PMT가 형광을 감지하며, PMT 신호와 이중 변조 클록이 락인 증폭기로 입력되면 PMT 출력 전압에 피크가 나타납니다. 정밀한 위상 검출기가 동기화 및 결과를 고전압으로 처리합니다. 두 가지 색상은 동일한 표적 농도에서 수행된 두 번의 서로 다른 스캔을 나타냅니다.검은색 선은 각 신호의 평균을 나타냅니다. 대조군 샘플을 테스트했을 때 락인 앰프(lock-in amplifier)에서 아무런 신호도 검출되지 않았습니다. 이 경우 락인 앰프에서 어떠한 락드 신호(locked signal)도 제공되지 않았습니다.이러한 사실은 응집의 시각적 차이와 더불어, MMB 시스템과 PMT 출력 신호의 시간 추적 측정값 차이를 통해 IL-8 타겟의 존재를 명확하게 식별할 수 있음을 시사합니다. 지금까지 IL-8을 예시로 하여 자기 변조를 이용해 생체 분자를 신속하고 균질하게 검출하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때는 레이저 안전 수칙을 준수하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

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Biology

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