Name: Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T16:22:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: 배우세요 측두실 벽의 홀마운트 기법으로 성체 포유류 뇌의 신경발생을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 신경줄기세포 활동과 뇌척수액 흐름을 분석하는 데 활용됩니다.

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NIH 그랜트 HD - 32116, 재단, 존 보스 줄기 세포 기금, MEXT, MHLW 및 HFSP를 지원하는 샌들러 가족 지원 작업. ZM는 카를로스 Baldoceda 재단과 UCSF Krevans 원정대에 의해 지원. AA - B. 헤더와 멜라니는 둘러 싸인 의자를 혼란 보유하고 있습니다.

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</ol>

심실과 subventricular 영역에서 neurogenesis 대부분의 연구 microanatomy 이러한 지역에서 휴대 관계를 조사하는 클래식 sectioning 기술에 의존합니다. 여기 우리는 다음 방지 mitotic 처리 6, 그리고 가장 최근에 정확한 혀끝의 연구를하는 데 사용되는 다음과 같은 SVZ의 시조 인구의 재생을 연구하는 데 먼저 SVZ 1 생성 neuroblasts의 철새 체인의 네트워크를 분석하는 데 사용되는 대체 기술, 설명 성인 SVZ 신경 줄기 세포 2,3,4의 기저 세포 - 세포 상호 작용. 흥미롭게도,이 기술은 성인 SVZ의 신경 줄기 세포 또는 형식 B1 세포가 차별이 아닌 나누어 ependymal 전지와 혼합 neuroepithelium의 일부입니다 것으로 나타났습니다. wholemounts를 사용 엉 - 얼굴 영상이 혼합 neuroepithelium는 ependymal 세포 4 대형 혀끝의 표면에 둘러싸여 타입 B1 세포의 꼭대기의 엔딩 구성된 바람개비 아키텍처를 가지고 나타났습니다. 이 엉 - 얼굴 분석 혈관 틈새 문의 뇌실 표면에 혀끝의 엔딩과 기초 프로세스 세포의 구성으로 배아와 성인 두뇌의 신경 줄기 세포의 혈통에 대한 우리의 이해를 명확히하고 있습니다. 이러한 연구 결과는 고전 sectioning 기술을 사용하여 거의 불가능했을. Wholemounts들은 또한 뇌실 - 문의 혀끝의 과정을 통해 신경 줄기 세포의 식별을 용이하게합니다. 이러한 줄기 세포에 대한 더 구체적인 마커가 발견됨에 wholemounts는 신경 줄기 세포의 행동을 식별하고 분석의 중요한 부분이 될 것입니다. 측면 뇌실 벽의 Wholemounts도 ependymal 세포의 평면 극성을 공부하고 이상적인 관점을 제공합니다. Ependymal 세포는 조정 방식으로 CSF를 추진하기 위해 함수 심실을 안감 multiciliated 세포 수 있습니다. wholemount 기술과 함께, 전체 ependymal 상피는 엉 - 얼굴을 노출하고 사후하고 복부 등의 경계에 스테인드하고 앞쪽에에서 종합적으로 연구하실 수 있습니다. 또한, ependymal 흐름 assays가 심하게 해부에 수행, 라이브 wholemounts는 견고 ependymal 속눈썹에 의해 생성되는 평면 편광 흐름을 보여줍니다. wholemount 접근법을 사용하는 최근의 작품이 ependymal 평면 극성 5 determinants 세포를 발견했다. 흥미롭게도, wholemount 연구는 ependymal 생성된 CSF의 흐름 SVZ 7 젊은 뉴런의 마이 그 레이션 가이드 chemorepellents의 그라디언트를 설립 것을 제안했습니다. 처음에는 철새의 연결 고리의 네트워크를 확인 Wholemount 접근 따라서 체인 마이 그 레이션을 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해 계속됩니다. wholemount 영상으로 VZ과 SVZ 분석 모두 미래 연구와 기존 연구에 대한 우리의 이해를 명확히하는 방법에 대한 새로운 접근법을 추가합니다. 예를 들어, 최근 연구는 성인 SVZ에서 신경 줄기 세포는 뇌실 8 접촉 CD133 + / CD24 - 세포다고 제안했습니다. 섹션에서 immunostaining을 바탕으로,이 작가는 이러한 세포가 multiciliated ependymal 세포의 subpopulation다고 주장했다. 그러나, 전체 ependymal 상피의보다 포괄적인 전망을 제공 wholemount 접근법을 사용하여 우리의 연구에서, 우리는 발견 모든 ependymal 세포 표현 CD24 및 유일한 뇌실 - 접촉 타입 B1의 일부는 + / CD24 -되었습니다 CD133되었습니다 세포를 세포 4. 또한, wholemount 기술은 성인 뇌의 9 신경 줄기 세포의 최근 설명 모자이크 조직 검사 향후 연구에 도움이 될 것을 약속드립니다. 몇몇 연구는 성인 두뇌의 신경 줄기 세포가 균질 인구 아니라는 것을 보여주지만, 지역 지정 및 일반적으로 후각 망울의 interneurons의 특정 subtypes을 생산합니다. 이러한 연구는 신경 줄기 세포의 다른 subpopulations이 특정 전사 요인 10,11,12,13,14 및 / 표현하거나의 지느러미 - 복부와 앞쪽에 - 사후 extents 함께 자신의 지역 로컬 라이제이션을 통해 구분할 수있다 것을 제안 측면 벽 9,15,16. 성인 신경 줄기 세포의 지역 지정 subpopulations 더 많은 분자 마커가 발견됨에 wholemount 영상은 심실 벽을 따라 각 시조 도메인의 parcelation 종합 전망을 제공해야합니다. wholemount 해부 여기에 제시 이미징 기술은 또한 배아에있는 심실 벽을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 배아 측면 벽의 해부는 같은 방식으로, 단계별, 수행됩니다. 난이도에서만 약간의 차이가있다; 배아 심실은 절개가 쉽게 비교적 큰지만, 조직은 조작이 더 어렵게 부드럽고입니다. 특히, 측면 뇌실과 비슷한 노출 엠브리에서 사용할 수OS는 대뇌 피질의 neurogenesis을 공부하는 뇌실의 대뇌 피질의 장벽을 해부하다 수 있습니다. 최근 증거들은 비대칭 centrosome 상속 피질 neurogenesis 17시 심실 표면에서 요골 glia을 유지 제안합니다. 요골 glial 혀끝의 표면 엉 - 얼굴 영상이 나누어 세포 내에서 centrosomes가 불균형 상속하는 방법에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 특히 대부분의 기술, 정확한 손재주는 관련된 사람과 마찬가지로 숙달 연습이 필요합니다. 더 나은 결과를 핵심 해부 몇 요소, 그러나,있다 : 1) 조명은 그림자를 만들 수있는 샘플의 조명을 조절하면 같은 포셉를 사용하여) 그렇지 않으면, 2 비교적 균질는 조직의 절개하는 동안 귀중한 콘트라스트를 제공합니다 이 기법에서 두 곤충 핀 포셉 함께 비틀거나 조직을 데리러 사용하지 않습니다하지만), 부드러운 철회의 균형을 3 절단하고 칼을 절단하지 말아야하는 동안 조직을 안정화시키기 위해 지속적으로 재조정 수있는 기동성 핀으로 사용됩니다 단 줄일뿐만 아니라이 절개의 대다수가 실제로에만 간헐적으로 절단과 부드러운 철회를 통해 수행되는 기억, 중간과 측면 벽을 분리하기 위해 부드러운 철회를 제공하는 데 사용됩니다.

subventricular 존 엉 - 얼굴 : wholemount 스테 이닝 및 ependymal 흐름

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

측면 심실의 벽 성인 포유류의 두뇌에서 가장 큰 새싹 지역을 포함하고 있습니다. 이 벽에 subventricular 영역 (SVZ)은 신경 줄기 세포의 행동과 성인 neurogenesis의 규정을 이해하기위한 광범위한 연구의 모델 시스템입니다. 전통적으로,이 연구는 histological 분석을위한 고전 sectioning 기술에 의존합니다. 여기서 우리는 다른 접근이 새싹 지역의 종합 엉 - 얼굴보기를 제공 wholemount 기법을 제시한다. 섹션에 비해 wholemounts는 SVZ 이내에 완료 cytoarchitecture와 세포 관계를 유지하고있다. 이 방법은 최근 성인 신경 줄기 세포 또는 형식 B1 세포는 측면 심실을 안감 차별 ependymal 세포와 혼합 neuroepithelium의 일부입니다 것으로 나타났습니다. 또한이 접근들은 뇌실에서 생성 ependymal 세포와 뇌척수 흐름의 평면 편광을 연구하는 데 사용되었습니다. 성인 신경 줄기 세포가 지역 지정 이기종 인구는 것을 최근에 증거로 wholemount 접근 가능성이 줄기 세포 틈새의 조직과 parcellation을 이해하는 필수적인 도구가 될 것입니다.

측면 뇌실 벽은 성인 포유류의 두뇌에서 가장 큰 새싹 지역을 포함하고 있습니다. 전통적으로이 지역에서 neurogenesis 연구는 histological 분석을위한 고전 sectioning 기술에 의존합니다. 여기서 우리는 다른 접근이 새싹 지역의 종합 엉 - 얼굴보기를 제공 wholemount 기법을 제시한다.

Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름

측뇌실 벽에는 성체 포유류 뇌에서 가장 큰 신경발생 영역이 포함되어 있습니다. 이 벽에 위치한 뇌실하대(SVZ)는...

안녕하세요, 저는 Zaman입니다. 그리고 저는 Arturo Alvarez입니다. 저희는 오늘 신경외과 및 Eli Edith Broad 재생 의학 및 줄기 세포 연구 센터 소속의 Arturo 교수님 연구실에서 측뇌실 벽의 전체 마운트(whole mount) 표본을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.이 전체 마운트 시료는 면역 염색을 위해 고정하여 사용하거나, 뇌척수액 흐름을 분석하기 위한 생체 표본으로 사용할 수 있습니다. 오늘 Mann이 시연할 전체 마운트 기법은 수년에 걸쳐 실험실에서 개발되었으며, 신경 줄기세포가 존재하는 뇌실하구역의 하부 생식 활동과 뇌실막 세포를 포함하여 외측 뇌실의 벽 전체를 연구하기 위해 완성되었습니다. 이 방법은 원래 Fiona Dutch에 의해 개발되었으며, 이후 HIE Victor와 Casu Moto에 의해 완성되었습니다.이들은 모두 더 이상 실험실에 없습니다. 다음 도식들은 외측 뇌실의 외측벽 전체 마운트를 준비하는 방법을 보여줍니다. 먼저 뇌를 두 개의 반구로 나눕니다.해마와 여기 보라색으로 표시된 횡단면을 드러내기 위해 후방으로 관상면 절단을 수행합니다. 그다음 해마를 덮고 있는 보라색의 내측벽을, 수양강을 덮고 있는 분홍색의 외측벽으로부터 벗겨냅니다. 두 벽을 책을 펴듯 서로 반대 방향으로 벌린 후, 내측벽을 절단하여 제거함으로써 외측벽이 노출되도록 합니다.이 영상의 첫 번째 섹션에서는 전체 마운트 해부를 다루지만, 이것이 반드시 첫 번째 단계는 아닐 수 있습니다. 시간 순서상, 만약 페널 흐름(penal flow) 분석 계획이 포함되어 있다면 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 매 해부 전에는 모든 도구가 멸균되었는지 확인하고 가까이 둡니다. 37 °C의 L 15 leitz 배지가 담긴 6 cm 해부 접시를 형광 해부용 실체 현미경 아래에 두고, 갓 적출한 마우스 뇌를 실체 현미경 아래의 접시에 넣습니다.미세 핀셋을 사용하여 후각구를 박리합니다. 스탭 나이프를 사용하여 뇌를 두 개의 반구로 나눕니다. 한쪽 반구의 후단 부분을 관상면으로 절단합니다.등쪽 해마와 그 단면을 노출시키기 위해, 피질과 해마 사이의 좁은 뇌실 공간에 stab knife를 삽입하고, 피질이 해마의 등쪽에 연결된 부위를 절개하여 분리합니다. 모서리 부분의 피질을 쐐기 모양으로 잘라내고, 미세 핀셋을 사용하여 해마에서 천천히 벗겨냅니다. 해마의 배쪽 가장자리까지 감싸고 있는 피질을 계속해서 벗겨냅니다.스태브 나이프(stab knife)를 사용하여 해마를 피질의 복측 부분에서 분리합니다. 나이프와 미세 핀셋을 사용하여 해마를 피질에서 떼어냅니다. 뇌실 벽이 손상되지 않도록 주의하며 전방으로 조심스럽게 진행합니다.두 벽은 서로 반대 방향으로 열려야 합니다. 칼을 이용해 책을 펼치듯 측벽 위로 돌출된 피질 부분을 절개하여 제거하십시오. 견인 시 저항이 증가함에 따라 해당 표면을 더 잘 시각화하기 위해 두 군데를 추가로 절개해야 합니다.내측벽과 외측벽이 만나는 등쪽 부위 한 곳과 배쪽의 유사한 부위에 절개합니다. 스탭 나이프(stab knife)로 짧게 끊어서 절개하십시오. 이러한 추가 절개를 통해 내측벽을 더 많이 견인함으로써 뇌실의 앞부분을 드러낼 수 있습니다.내측 벽과 외측 벽 사이의 접합부가 골짜기처럼 보일 수 있도록 조명을 조절하십시오. 칼을 사용하여 정확히 그 골짜기 부분을 절개하여 시상과 돌출된 피질을 제거하십시오.홀 마운트는 뇌실막 흐름 분석을 위해 즉시 사용해야 합니다. 면역 염색을 위해 홀 마운트를 해부하는 경우, 완성되는 즉시 고정액에 담그면 한 번에 여러 개의 홀 마운트를 해부할 수 있습니다. 비디오의 다음 섹션에서는 뇌실막 세포 섬모에 의해 생성되는 액체 흐름 분석 방법을 시연하겠습니다.형광 마이크로비즈를 이용하는 방법입니다. 갓 해부한 측벽 전체 마운트 표본을 먼저 곤충 핀 두 개를 사용하여 해부 접시에 고정합니다. 그 후 형광 마이크로비즈가 채워진 유리 마이크로 피펫의 팁을 전체 마운트 표면으로 내리고, 타임랩스 촬영 중에 형광 비즈를 표면에 조심스럽게 도포합니다.비디오는 부속 흐름 분석(append flow assay)을 위한 비드의 움직임을 기록합니다. 본 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로, 전체 마운트 해부 전에 유리 마이크로 피펫을 준비해야 합니다. 완성된 피펫은 부드럽고 완만한 테이퍼(taper) 형태여야 하며, 내부 직경이 약 100 micrometers이고 45도 베벨(bevel) 처리가 되어 있어야 합니다.모세관 현상을 이용하여 미네랄 오일을 피펫의 약 절반 정도까지 채웁니다. 진공 그리스를 바른 플런저를 피펫 뒷부분에 삽입합니다. 그런 다음 플런저를 밀어 넣어 오일의 메니스커스가 피펫 팁까지 도달하게 합니다.플런저가 달린 피펫을 조절 가능한 암(arm)에 장착된 마이크로 매니퓰레이터로 고정합니다. 피펫의 전면에 50% 형광 마이크로비즈, 5% 글리세롤 및 45% 물 혼합 용액을 채웁니다. 앞서 설명한 방식대로 홀 마운트(hole mount)를 갓 절개하여, 37 °C로 채워진 깨끗한 절개 접시에 뇌실 쪽이 위로 향하게 옮깁니다.Leitz 배지를 사용하여, 시상과 전배측 피질에 곤충 핀 두 개를 꽂아 홀 마운트를 해부 접시에 고정합니다. 마이크로 조작기를 지탱하는 고정 암의 베이스를 실체 현미경 옆에 배치하되, 마이크로 피펫 바늘이 부러지지 않도록 암을 높게 유지하십시오. 마이크로 피펫의 팁을 배지가 든 튜브에 담가 팁 외부의 마이크로비즈를 제거합니다.팁이 부러지지 않도록 주의하십시오. 피펫 팁을 측벽의 등쪽 표면에 위치시키고, 암(arm)을 내려 피펫 팁이 조직 표면 바로 위에 오도록 합니다. 홀 마운트의 앞쪽 절반을 포함하는 시야에 초점을 맞추고, 원하는 이미지의 기록을 시작하십시오.플런저를 사용하여 약 5 L의 마이크로 비드를 홀 마운트 표면 위로 배출하십시오. 초기 비드 덩어리가 층류에 의해 표면에서 제거되면, 플런저를 사용하여 5 nL씩 마이크로 비드를 추가로 배출하십시오. 흐름, 방향 및 속도는 녹화된 영상을 통해 분석할 수 있습니다.이 비디오의 마지막 섹션에서는 홀 마운트(hole mount)의 면역 염색 방법과 공초점 이미징을 위한 슬라이드 마운팅 과정을 보여줍니다. 갓 해부한 홀 마운트를 먼저 24웰 플레이트로 옮긴 후, 파라포름알데히드(paraform aldehyde)에 침전시켜 고정합니다. 이어서 세척 과정을 거치며 1차 항체와 형광 표지 2차 항체를 순차적으로 반응시킵니다.염색 후, 전체 마운트(whole mount)를 미세 해부하여 하부 층과 피질이 포함된 나머지 부분으로부터 뇌실하구역(subventricular zone)이 포함된 측벽의 얇은 층만을 분리합니다. 이렇게 분리된 얇고 평평한 조직 조각을 슬라이드로 옮기고 커버 슬립을 덮어 면역 염색용 전체 마운트를 고정합니다. 4% paraaldehyde와 0.1% tritton X 100이 포함된 24웰 플레이트를 얼음 위에 준비합니다.화학 흄 후드 내에서, 절개된 홀 마운트(hole mount)의 심실 면이 위로 향하도록 플레이트의 웰 하나에 조심스럽게 담급니다. 4°C에서 샘플을 하룻밤 동안 고정시킨 후, 고정액을 흡입하여 제거하고 전이 피펫을 사용하여 0.1% Triton X가 포함된 1X PBS로 홀 마운트를 5분씩 3회 조심스럽게 세척합니다. 모든 액체 처리 단계에서는 홀 마운트가 뒤집혀 조직이 손상되는 것을 방지하기 위해 웰의 측면에서 조심스럽게 피펫팅하십시오.Triton X와 10% Normal goat serum이 포함된 블로킹 용액을 1x PBS에 첨가하며, 항체 침투가 필요한 깊이에 따라 Triton X를 최대 2%까지 사용합니다. 전체 마운트 시료를 블로킹 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 그 후 블로킹 용액을 제거합니다.블로킹 솔루션에 희석한 1차 항체를 첨가하고, 표적 항원에 따라 4 °C에서 24시간 또는 48시간 동안 배양합니다. triton X가 포함된 1X PBS로 빠르게 두 번 헹군 후, 상온에서 20분씩 세 번 세척합니다. 블로킹 솔루션에 희석한 2차 항체를 첨가하고, 1차 항체와 동일한 시간 동안 4 °C에서 배양하며, 1차 항체 때와 동일한 방식으로 세척합니다. 다음 단계에서는 전체 마운트의 나머지 부분에서 측벽만 분리하여 하나의 평면 표본으로 만드는 방법을 보여줍니다. 이렇게 분리된 표본은 고해상도 이미징을 위해 마운트할 수 있습니다.입체 현미경 하에서 후방에서 전방 방향으로 이동하며, 1X PBS가 채워진 깨끗한 해부 접시에 면역염색된 뇌실 부위의 홀 마운트를 놓습니다. 스탭 나이프(stab knife)를 사용하여 등쪽 피질과 그 아래의 백색 뇌량(corpus callosum)을 제거함으로써 뇌실하대(sub ventricular zone)와 선조체(striatum) 사이의 접합면을 시각화합니다. 그런 다음 홀 마운트의 복측면을 가로질러 길게 수평으로 절개합니다.미세 핀셋을 사용하여 조직의 등쪽 표면이 위를 향하도록 새로운 평평한 모서리에 맞춥니다. 뇌실하구역은 균일한 분홍색 조직의 얇은 띠 형태이며, 선조체에는 백질 다발이 침투해 있습니다. 뇌실벽이 손상되지 않도록 핀셋 두 개를 선조체 주변에 핀처럼 사용하여 조직을 고정합니다.전면부부터 시작합니다. 스타브 나이프(stab knife)를 사용하여 선조체와 뇌실하대 사이를 조심스럽게 절개하기 시작하십시오. 절개면을 뇌실 표면과 평행하게 유지하고 박리된 조직의 두께를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다.뇌실하구역(sub ventricular zone)이 후방으로 갈수록 얇아집니다. 홀 마운트에서 뇌실벽에 해당하지 않는 모든 주변 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 홀 마운트의 두께는 200에서 300 micrometers 사이로 균일해야 합니다.포셉을 사용하여 조직 조각을 아래에서 들어 올려 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 마운팅 용액을 바른 후 커버글라스를 덮습니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.커버슬립이 완전히 안착될 수 있도록 슬라이드를 슬라이드 북에 평평하게 넣어 4 °C에서 1~2일 동안 보관한 후 샘플 이미징을 진행하십시오. 다음은 전체 마운트 면역염색 및 부록 유세포 분석의 대표적인 결과입니다. 첫 번째 이미지는 더블코틴(doublecortin, 신경모세포 마커)의 전체 마운트 염색 저배율 영상으로, 성체 뇌의 뇌실하구역(subventricular zone)에서 이동하는 어린 뉴런들의 사슬 네트워크를 보여줍니다.다음은 KI 67을 녹색으로, 혈관을 적색으로 염색한 홀 마운트(whole mount)의 또 다른 저배율 이미지로, 고배율에서 관찰되는 뇌실하구역(subventricular zone) 내 분열 세포와 혈관계 사이의 최근 보고된 밀접한 상호작용을 보여줍니다. 다음 사진은 뇌실 표면의 공초점 이미지로, 뇌실을 둘러싼 세포의 정단면(apical surface)은 beta catine 염색을 통해 녹색으로, 해당 세포들의 기저체(basal bodies)는 gamma tubulin을 통해 적색으로 표시되었습니다. 마지막 고배율 이미지는 GFAP 홀 마운트 염색에서 얻은 공초점 스택의 최대 투영(maximum projection) 영상으로, 뇌실 표면에서의 CSF 흐름, 방향 및 속도를 분석하기 위한 S vz type B one 세포의 긴 GFAP 양성 기저 섬유를 보여줍니다.append 유동 동영상의 연속된 프레임들은 하나의 합성 이미지로 병합될 수 있습니다. 이 합성 이미지들은 단일 비드들이 append 또는 표면을 가로지를 때 서로 다른 시점에서의 위치를 보여줍니다. 다음은 결과물이 완성되었을 때의 모습에 대한 예시입니다.지금까지 측뇌실 외벽의 뇌실하구역(subventricular zone)에서 전체 마운트(whole mounts)를 준비하는 방법을 살펴보았습니다. 이 방법은 전체 벽면의 전체 마운트 뷰를 제공하며, 이 뇌실하구역이 연쇄 이동(chain migration)을 위한 경로 네트워크로 조직되어 있다는 관찰을 포함하여 지난 수년간 많은 발견을 가능하게 했습니다. 또한, 이 방법은 뇌척수액이 이 벽면 위로 어떻게 흐르는지 연구할 수 있게 해주었으며, 간접적으로 이러한 세포들이 매우 광범위한 경로 네트워크를 통해 어떻게 이동을 안내하는지에 대한 방법들을 제시해 주었습니다.최근 이 기술을 통해 우리는 뇌실하구역(sub ventricular zone)이 핀휠(pin wheel) 형태로 조직되어 있음을 발견했으며, 이 핀휠의 중심에 줄기세포가 위치하고 있어 이 구조 내 줄기세포의 광학적 끝단이 드러난다는 점을 확인했습니다. 전장 표본(whole mount) 제작은 뇌실구역의 전체적인 관점을 제공하므로 절편 제작으로는 얻을 수 없는 시야를 확보할 수 있으며, 이러한 이유로 다른 많은 연구에도 유용할 것이라 판단하여 이 방법을 공개합니다. 전장 표본을 준비할 때 해부 효율을 높이기 위해 기억해야 할 몇 가지 핵심 사항이 있습니다.첫 번째는 적절한 조명을 확보하는 것입니다. 조명을 조정하여 홀 마운트에 그림자가 지도록 하십시오. 그렇게 하면 대비가 생겨 어디를 절개해야 할지 알 수 있습니다. 두 번째는 포셉을 두 개의 이동식 핀으로 사용하는 것입니다.포셉을 사용하여 조직을 꽉 쥐거나 들어 올리지 마십시오. 대신, 절단하는 동안 조직을 고정하는 두 개의 이동식 핀처럼 사용하십시오. 세 번째는 일반적인 견인과 절단을 조합하여 사용하는 것입니다.해부 과정에서 알 수 있듯이, 실제로 조직을 절개하는 부분은 매우 적습니다. 해부의 대부분은 두 번째 해부 단계에서 전반적인 견인을 통해 이루어집니다. 이는 전체 마운트의 나머지 부분에서 외벽을 제거할 때 해당됩니다.가장 중요한 것은 절단면을 심실 표면의 평면과 평행하게 맞추는 것입니다. 그렇게 해야 외벽을 따라 전면에서 후면까지 일정한 두께를 확보할 수 있습니다. 또한, 이는 공초점 고해상도 이미징을 수행할 때 모든 이미지가 하나의 평면에서 초점이 맞도록 보장해 줍니다.이 영상이 여러분의 학습에 유용하기를 바랍니다. 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

the-subventricular-zone-en-face-wholemount-staining-and-ependymal-flow

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

MRI 스캔(인간), 3D 이미징 소프트웨어 및 면역조직학적 분석을 사용하여 뇌의 외측심실의 변화를 문서화합니다. 그런 다음 노화 또는 질병으로 인해 인간 뇌에서 발생하는 외심실 부피 변화의 종단 3D 매핑과 뇌실 주위 세포 변화의 특성화를 마우스에서 모델링합니다.

인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

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이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

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정확하고 심도 있는 정량적 프로테아메 분석을 위한 성인 Subependymal 영역의 극저온 단면 해부

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Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

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Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름

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