Name: 마이트의 굿 미생물 (Zootermopsis Angusticollis)에서 DNA를 추출하고 굿 미생물을 떠올리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 배우세요 Zootermopsis angusticollis의 후장 미생물에서 DNA 추출 및 시각화 방법을. 이 기술은 미생물 생태학 연구와 에너지 대사 경로 분석에 활용됩니다.

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흰개미 전체 - 직감 DNA 추출을위한 절차 요약 : <ol><li> 얼음 얼음 흰개미는 멸균 핀셋을 사용하여 용기를 제거하고 버퍼에 굿 샘플을 안정화. </li><li> PVPP / SDS / 페놀 버퍼에 샘플을 균질. </li><li> Qiagen DNeasy 컬럼을 사용하여 원유 lysate에서 DNA를 추출하고 정화. </li></ol> 프로토콜 : <ol><li> 얼음, 살균 집게를 사용하여 노동자 계급의 흰개미의 내장을 제거하십시오. </li><li> 즉시 50 μL 얼음처럼 차가운 1X 분자 생물학 성적 TE 버퍼를 포함하는 멸균, nuclease없는 튜브에 창자와 내용을 전송 (1 MM 트리스 - HCL, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0). -20 ° C에서 샘플을 고정하거나, 균질와 직접 진행합니다. </li><li> 멸균, nuclease없는 두 ML 나사 뒤덮힌 튜브로 굿 샘플 버퍼를 전송 미리 로드된 1퍼센트 W / V polyvinylpolypyrrolidone (PVPP를 포함하는 멸균 지르코니아 / 실리카 구슬 (0.1 mm) 및 1X TE 버퍼 700 μl 500 MG와 ). </li><li> 20 % 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) 50 μl와 샘플에 페놀 500 μl를 추가합니다. </li><li> 30 초의 균질 세 사이클 얼음에 냉각 30 초를 사용하여 최상의 설정 (비즈 비트) 균질. </li><li> 8,000 X g에서 1 분 세디먼트 불용성 물질. </li><li> 원유 lysate 정화에 대해 설명한 방법을 사용 Qiagen DNeasy 컬럼과 수성 (맨 위에) 계층의 300 μl aliquots 정화. </li><li> 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 핵산 내용 및 동결 샘플을 계량. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

우리의 경험에서 Zootermopis의 nevadensis 같은 나무 먹이를 흰개미 종의 미생물 지역 사회에서 추출한 DNA는 추출과 정화의 한 라운드 후 PCR 템플릿에 대해 충분히 순수합니다. 그러나, 쓰레기 수유 및 토양 수유 종 같은 일부 흰개미들은 굿 내용에 humic 지방산의 높은 농도를 수 있고 굿 미생물 DNA의 추가 정화를 필요로 할 수 있습니다. 5 Z.의 nevadensis 근로자의 내장에서 총 DNA 수율은 10-30 μg의 범위에 있습니다. 크게 작게 또는이 종이보다 큰 흰개미 종 들어, 더 많거나 적게 표본은 DNA의 비슷한 금액을 얻기 위해 필요한 수 있습니다. 이 방법은 쉽게 RNA 추출을 허용하도록 적용할 수 있습니다. RNA 추출은 프로토콜의 2 단계에서 설명한 얼음처럼 차가운 TE 버퍼에 대한 Qiagen (catlog 안돼. 76506)에서 1X RNAprotect의 박테리아 시약을 대체합니다. Qiagen RNeasy의 시약과 열이 (없습니다. 74,104을 catlog 없음) 위에서 설명한 DNeasy 정화 절...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/phenol</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>균질화 완충액</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>키트</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>조추출물로부터 게놈 DNA를 분리하기 위한 프로토콜에 따라 사용 (부록 H, 제품 매뉴얼 버전: 2003년 7월)</td></tr><tr><td>TE</td><td>완충액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100x 농축액으로 조제한 1x 완충액 (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td></tr><tr><td>zirconia/silica beads </td><td>소모품</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>분말 시약을 TE 완충액에 1x 현탁액으로 조제한 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>동물</td><td></td><td></td><td>흰개미</td></tr><tr><td>SDS</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>분말 시약을 물에 녹인 20% Sodium dodecyl sulfate 용액</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>TE 포화, ~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>도구</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>완충염 용액, pH 7.2</td><td></td><td></td><td>리터당 조성: 2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, 및 1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 용액 10 mL</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>40x 대물렌즈, 1.6x optivar 및 10x 접안렌즈 장착. 위상차 조명을 사용하여 시료 관찰</td></tr></tbody></table>

마이트의 굿 미생물 (zootermopsis angusticollis)에서 dna를 추출하고 굿 미생물을 떠올리

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

흰개미는 나무 소비에 의해서만 존속 수있는 능력을 가지고 알려진 몇몇 동물들이다. 흰개미 창자의 넓이는 주로 아세테이트로 lignocellulose의 저하에 도움을 밀도와 종의 풍부한 미생물 인구를 포함, 흰개미의 신진 대사에 연료를 주요 영양소 (Odelson &amp; Breznak, 1983). 이러한 미생물의 집단 내에서 일부 ( &quot;낮은&quot;) 흰개미에 진핵세포는 원생 동물문 박테리아, methanogenic archaea하고입니다. 따라서 흰개미 우수한 연구 과목은 미생물의 종류와 그들의 호스트의 혜택을 수행할 수많은 생화학 기능 간의 상호 작용을 공부하고 있습니다. 흰개미 창자뿐만 아니라 다양한 생화 학적 과정에 관여 주요 유전자의 미생물 인구의 종 구성은 분자 기술 (., Schmit - 바그너 외, 2003;. Salmassi &amp; 레드 버터, 2003 쿠도 외, 1998)를 사용하여 탐색되었습니다. 이러한 기법은 흰개미 굿 환경에서 고품질 핵산의 추출 및 정제에 따라 달라집니다. . Berthelet 외, 1996,,. 퍼디 외, 1996;. Salmassi &amp; 레드 버터,이 동영상에서 설명한 추출 기술은 환경 샘플 (모 외, 1994에서 핵산의 추출 및 정화용으로 개발된 프로토콜의 수정 편집입니다 2003;. Ottesen 외 2006) 그리고 그것은 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 대한 템플릿으로 사용하기에 적합 흰개미의 hindgut 자료에서 DNA를 생성합니다.

이 동영상은 흰개미의 hindgut에 거주 미생물의 종 DNA를 추출하기위한 기술을 보여줍니다. 굿 미생물 커뮤니티를 시각화하는 데 유용합니다 젖은 마운트 슬라이드의 준비도 그림이고, 종의 풍부한 굿 환경을 통해 투어가 주어집니다.

마이트의 굿 미생물 (Zootermopsis Angusticollis)에서 DNA를 추출하고 굿 미생물을 떠올리

흰개미는 나무만을 섭취하여 생존할 수 있는 능력을 가진 몇 안 되는 동물 중 하나입니다. 흰개미의 장관에는 조밀한...

여기서 이러한 환경에 대한 당신의 반응은 결코 특별한 것이 아닙니다. 과학자가 아닌 사람들을 포함한 대부분의 사람들이 상당히 감명받곤 합니다. 네, 바로 그 다양성과 복잡성 때문입니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 공과대학교 환경 및 과학 공학과에서 박사후 연구원으로 재직 중인 Eric Matson입니다. 저는 Jared Ledbetter 교수님의 지도하에 흰개미 후장 내에 서식하는 종들의 미생물 상호작용과 다양성에 초점을 맞춘 연구를 수행하고 있습니다. 특히 저희는 일부 생화학적 경로에 관심을 가지고 있으며, 그중에서도 미생물이 수소와 CO2 가스를 소비하여 흰개미 숙주의 에너지 대사에 핵심 영양소인 아세테이트로 전환하는 아세토젠성(acetogenesis) 과정에 깊은 관심을 가지고 있습니다.저와 실험실 동료들은 이 경로의 핵심 효소들을 평가하기 위해 표적 프라이머 세트를 개발했습니다. 하지만 이를 위해서는 분석 표적으로 사용할 수 있도록 커뮤니티의 깨끗한 DNA 샘플을 생성해야 합니다. 따라서 오늘은 우리가 다루고 있는 흰개미 종을 해부하여 후장에 있는 DNA를 추출하고, 이후 연구에 사용할 수 있도록 이를 정제하는 방법을 시연하고자 합니다.오늘은 특히 Zo Opsis Nevadensis라고 불리는 흰개미 한 종에 집중해 보겠습니다. 이는 이곳 현지에서 채집한 캘리포니아 습성 나무흰개미로, 크기가 상당히 큰 종이기 때문에 해부 및 추출 작업을 수행하기가 매우 용이합니다. 자, 그럼 오늘 실험 절차에 필요한 준비물 중 일부를 미리 준비해 두었습니다.가장 먼저 준비해야 할 것 중 하나는 해부할 곤충들을 냉각시키기 위한 일정량의 얼음입니다. 또한 TE buffer를 미리 냉각해 두었는데, 여기에는 세포에서 DNA가 방출된 후 이를 안정화하는 데 도움이 되는 화합물이 포함되어 있습니다. 그리고 지르코니아 실리케이트 비드가 미리 채워진 멸균 튜브를 준비했습니다.이것들은 0.1 밀리미터 비즈이며, 약 0.5g 정도 들어 있습니다. 이것이 우리가 실제로 수행할 기계적 전단(mechanical shearing) 과정입니다. 그리고 용해 및 정제 과정에 사용될 몇 가지 시약들이 준비되어 있습니다.여기 TE 완충액에 1% polyvinyl PolyOne 또는 PVPP가 포함된 병이 있습니다. PVPP는 DNA 추출물에서 휴믹산을 제거하는 데 중요한데, 휴믹산은 결과에 대한 PCR 분석을 방해할 수 있기 때문입니다. 그리고 세포 추출 및 파쇄를 돕기 위해 사용할 계면활성제인 sodium dodecyl sulfate가 있습니다.그런 다음 흰개미 해부를 위해 필요한 것은 멸균 핀셋뿐입니다. 이 핀셋은 끝이 상당히 가늘며, 실제로 이를 사용하여 소화관을 제거하게 됩니다. 마지막으로, 기계적 전단을 위해 매우 높은 RPM으로 회전하는 비드 비팅 장치를 준비했습니다. 이 장치는 지르코니아 실리케이트 비드와 함께 세포를 기계적으로 파쇄하는 역할을 합니다.현장에서 흰개미를 채집한 후, 실험실로 가져옵니다. 저희가 연구하는 캘리포니아 습목흰개미(California damp wood termites) 대부분은 건조에 매우 취약합니다. 따라서 본 실험실에서 도입한 진보된 방법 중 하나는 10갤런 크기의 수조와 같은 습도 조절 챔버를 사용하는 것입니다.여기에서 개별 콜로니를 수집하여 이 박스들에 나누어 보관합니다. 그리고 탱크 바닥에는 서로 다른 염 용액이 담긴 용기들이 있습니다. 특히 이 용기에는 인산칼륨 용액이 들어 있어 상대 습도를 약 95에서 96%로 유지하며, 이는 매우 적절한 상태입니다.그리고 이러한 조건들 덕분에 흰개미를 실제로 사육 하에 번식시킬 수 있었습니다. 하지만 실제로 실험을 수행하고자 할 때는 야생에서 갓 채집한 개체들을 사용합니다. 이 상자 안에는 흰개미의 먹이가 되는 나무 일부를 보실 수 있습니다. 이것은 흰개미 둥지 현장에서 채집한 폰데로사 소나무(Ponderosa Pine) 또는 제프리 소나무(Jeffrey Pine)입니다.흰개미에는 수컷 및 암컷 생식 개체를 포함하여 여러 종류의 계급이 존재합니다. 군집의 대부분은 일개미로 구성되어 있으며, 병정개미 계급 또한 일정 수 존재합니다. 흥미로운 점은, 병정개미의 구강 구조인 큰턱은 나무를 갉아먹기보다는 군집을 방어하기 위해 설계되었다는 것입니다.따라서 이들은 먹이 공급 역시 일개미에게 의존합니다. 그래서 이 상자 안에는 일개미와 병정개미뿐만 아니라, 이곳 사육 환경에서 알로부터 막 부화한 어린 개미들도 함께 있는 것을 볼 수 있습니다.방금 보여드린 그룹에서 일개미 다섯 마리를 선택했습니다. 우선 이곳에서 얼음에 올려 냉각시키는 것으로 시작했습니다. 해부를 위해 핀셋을 사용할 예정이며, 해부 현미경의 도움을 받아 작업을 진행하겠습니다. 각 개체에서 제거할 수 있는 커다란 장의 부피를 확인하실 수 있을 것입니다.흰개미를 등으로 향하게 뒤집은 다음, 한쪽 핀셋으로는 머리 쪽을 잡고 다른 핀셋으로는 복부의 끝부분을 살짝 집어줍니다. 그리고 한 번의 당김으로 생체에서 소화관이 분리되는 것을 확인할 수 있습니다.그리고 보시면 상당히 큰 부피로, 곤충 무게의 약 30%~40%가 실제로 해당 환경 내에 포함되어 있음을 알 수 있습니다. 또한 여러 구역으로 나뉘어 있는 것을 볼 수 있는데, 전장과 중장, 그리고 발효를 수행하는 대부분의 미생물 군집이 포함된 매우 큰 챔버인 후장을 확인할 수 있습니다.여기 다섯 마리의 일개미 흰개미의 내장을 제거했습니다. 다음 단계는 ice cold TE buffer 용액을 사용하여 이 군집 내에 포함된 핵산을 안정화하는 것입니다. 야외에서 작업 중인 경우, 이 시점에서 -20 °C로 냉동 보관할 수 있습니다.또는 바로 추출 절차를 계속 진행할 수 있습니다. 하지만 모든 세포와 DNA 물질은 여전히 장 내에 포함되어 있습니다. 이를 100 µL의 TE buffer에 넣도록 하겠습니다.이제 본격적으로 장 샘플의 추출을 시작하기 전에, 세포와 조직을 파쇄하는 데 사용할 버퍼를 준비하겠습니다. Zircon 비즈 약 0.5g이 이미 들어 있는 이 튜브에, TE 버퍼 내 1% PVPP 700µL와 20% SDS 용액 50µL를 추가하겠습니다.PVPP는 수성 완충액에 용해되지 않으므로, 첨가하기 전에 다시 현탁시키는 것이 중요합니다. 이제 시료에 페놀을 추가할 준비가 되었으므로, 피펫을 사용하여 약 500 µL 정도를 넣겠습니다. 좋습니다. 이제 추출을 시작할 준비가 되었습니다. 네.페놀을 첨가했으므로, 앞서 흰개미에서 적출한 장 샘플을 넣을 준비가 되었습니다. 이때 조직을 약간 으깨주면 전이 과정이 다소 수월해집니다. 이제 페놀이 첨가되었으므로, 비드 비팅 장치를 이용해 기계적 파쇄를 시작할 준비가 되었습니다.사용할 기술은 최대 속도로 30초간 3회 반복하고, 이어서 30초 동안 얼음 위에 두는 것입니다. 마찰로 인해 샘플이 가열되는 경향이 있으므로, 샘플을 냉각시키기 위해 얼음 위에 두는 단계를 포함하는 것이 중요합니다. 이제 샘플을 여기 비드 비팅 장치에 넣고, 30초 동안 작동시키겠습니다.절차를 마치면 대부분의 조직이 균질화된 것을 확인할 수 있습니다. 덩어리가 거의 남아 있지 않아야 하며, SDS 성분으로 인해 거품이 있는 듯한 외관을 띠게 됩니다. 이제 원심분리를 수행한 후, 이 시료에서 DNA를 실제로 추출하고 정제하는 단계를 시작할 준비가 되었습니다.세포를 기계적으로 파쇄했으므로, 이제 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거하겠습니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 8,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 이제 튜브 바닥 근처에 대부분의 가용성 물질이 수집된 것을 확인할 수 있을 것입니다.우리가 관심을 가지는 부분은 상단의 수용액 층입니다. 이것이 바로 조추출물(crude lysate) 절차에 따라 KaiGen DNA 추출 키트에 실제로 첨가할 부분입니다. 샘플 원심분리가 완료되었으므로, 준비물당 200 µL의 상층액을 취하여 조추출물용 프로토콜에 명시된 대로 A-D-N-E-Z KaiGen 키트를 사용하여 DNA를 추출하겠습니다.이제 200 µL의 장 샘플이 준비되었으며, 조추출물(crude lysate)에 명시된 프로토콜에 따라 Kyogen D Easy 키트를 사용하여 진행하겠습니다. 장 추출을 수행할 때는 항상 장 내용물의 상태를 확인하는 것이 좋습니다. 따라서 흰개미를 해부하여 우리가 과거에 관찰했던 것들과 일치하는지 확인합니다.이 미생물 군집 내의 세포들을 관찰함으로써 이를 시각적으로 확인해 보겠습니다. 여기 복부의 바로 끝부분입니다. 한쪽 끝을 보시면 장관이 보일 것입니다.이것은 흰개미의 실제 장내 액체 조성과 매우 유사하게 맞춘 완충 염 용액입니다. 이것을 약간 으깬 다음 현미경 슬라이드에 올려 관찰하겠습니다. 이제 현미경으로 살펴볼 준비가 되었습니다.네, 정말 좋아 보입니다. 흰개미의 장입니다. 여기에는 생명체의 알려진 세 가지 도메인이 모두 존재합니다.진핵 원생동물과 메탄 생성 생물, 그리고 박테리아가 존재합니다. 저희 연구실은 주로 이 환경 내의 박테리아 군집에 관심을 두고 있습니다. 구체적으로는 SPI가 있으며, 이 특정 종류의 흰개미에서 spire keets는 공동체 내에서 가장 우세한 박테리아 구성원 중 하나입니다.현재 저희의 연구 결과에 따르면, 실제로 이들이 CO2 환원적 케토제네시스(reductive acetogenesis)에 상당 부분 관여하는 것으로 나타났습니다. 이들은 다양한 종류의 원생동물이며, 특히 나무의 1차 분해에 참여하는 것으로 생각됩니다. 따라서 이들은 효소가 이러한 나무 폴리머에 접근할 수 있게 하는 xylanase와 cellulase를 포함하고 있는 것으로 보입니다.그리고 그들은 그것들을 단당류 단량체와 다른 군집 구성원들에 의해 추가로 분해되는 중합체로 발효시킵니다. 또한 이 원생동물들은 스스로 아세테이트를 생성하지만, 그 부산물 중 하나는 수소와 CO2이며, 이 수소와 CO2가 다시 이 환경 내의 아세토(aceto) 개체군에 의해 사용되거나 소비됩니다. 여기서는 아마도 매우 큰 종의 트로피카리스(trophomonas) 근처에 원생동물 유기체 무리가 있는 것을 볼 수 있습니다.이것은 흰개미 장 내에서 가장 큰 유기체 중 하나입니다. 더 깊이 내려가서 이러한 대형 원생동물 세포가 없는 구역을 실제로 살펴보면, 배경이 되는 간질액에 스피로헤타(spirochetes) 및 기타 박테리아 세포들이 가득 차 있는 것을 볼 수 있습니다. 따라서 그러한 공간에서도 복잡성은 전혀 줄어들지 않습니다.한 가지 짚고 넘어가야 할 점은, 여기서 살펴본 것과 같은 후장 천자액의 전형적인 부피가 흰개미의 크기에 따라 2~5 µL 정도라는 것입니다. 따라서 제가 여기서 제작한 습식 마운트 표본은 해당 환경을 최소 1:20으로 희석한 상태를 나타냅니다. 즉, 실제 온전한 장 내부에서는 이 종들이 여기서 보이는 것보다 훨씬 더 조밀하게 분포해 있습니다.이를 통해 이 환경 내 생명체의 밀도와 다양성에 대해 어느 정도 파악하실 수 있을 것입니다. 오늘은 이렇게 정제된 샘플을 사용하여 흰개미 장에서 DNA를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이제 특정 표적 프라이머 세트를 적용할 수 있게 되었습니다.구체적으로, 저희 연구실에서 개발한 세 가지 프라이머 세트인 formate dehydrogenase, carbon monoxide dehydrogenase, 그리고 formyl tetra hydro folate synthesis 유전자를 살펴볼 예정입니다. 저희는 이 환경 내의 이러한 다양한 유전자들의 다양성과 특정 서열 특성을 연구하는 데 관심이 있습니다. 따라서 이는 각 유전자를 PCR로 증폭하고, 이를 클로닝 및 시퀀싱하여 유전자 목록을 구축하는 과정을 포함하게 됩니다.결과를 바탕으로, 이러한 상호작용의 특성과 특히 이러한 과정을 통해 서로 다른 미생물에서 이러한 경로가 어떻게 구축되는지에 대해 알 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

흰개미 - 굿 미생물 커뮤니티 미생물 사이의 복잡한 상호 작용을 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다 왜 제라드 레드 버터는 설명합니다. 호스트 곤충과 lignocellulose - 굴욕 굿 미생물 사이의 기존의 공생 관계는 물론 굴욕적인 식물 바이오 매스 및 바이오 연료 생성 이러한 미생물의 산업 사용으로 설명합니다.

인터뷰 - 마이트의 H​​indgut에서 미생물 커뮤니티를 조사

제라드 레드 버터는 흰개미의 hindgut 생활 거주의 다양성을 통해 자연 도보를 위해 소요 - 250 종을 포함하는 microenvironment는 세계 어디서도 발견했습니다. 제라드가이 시스템에 의해 전시 공생은 다층이며 흰개미와 굿 주민 사이의 관계뿐만 아니라 관련된뿐 아니라 창자 미생물 서로 공생의 복잡한 웹 관련되어있다는 것을 보여준다.

공생의 레이어 - 마이트의 H​​indgut의 미생물 커뮤니티를 떠올리

우리는 리간드가 원생 ​​동물문 lytic 펩티드와 결합하여 형광 현미경 그 리간드를 사용하여 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문 죽이는 셀룰로오스 - 소화 이들의 표면 막에 바인딩 입증 절차를...

원생 동물문 테미트 굿 반대 리간드 - lytic 펩티드의 Protozoacidal 활동 테스트 체외에서 (원생 동물문 문화) 및 생체내에 (테미트 Hindgut에 Microinjection)

스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

야생 Caenorhabditis 선충은 많은 미생물과 연관됩니다, 종종 창 자 루멘에서 또는 창 자를 감염. 이 프로토콜은 도어 큐티클의 저항을 활용하여 내장을 식민지화하는 헤아릴 수없는 미생물을 풍부하게하는 방법을 자세히 설명합니다.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

도끼 곤충을 얻기 위해 달걀 표면을 살균하고 부화 한 유충은 도끼 잎을 사용하여 사육됩니다. 이 방법은 항생제를 투여하거나 다른 잎을 먹는 곤충에도 적용 할 수있는 인공 식단을 개발하지 않고도 축산 곤충 준비를위한 효율적인 방법을 제공합니다.

잎 딱정벌레의 숙주 - 장 microbiota 상호 작용 연구를위한 조직 배양 묘목으로 축 곤충 준비 및 사육

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

우리는 미생물군 및 생물막과 함께 식물 및 곰팡이 바이오매스를 포함하는 매우 이질적이고 섬세한 샘플을 시각화하기 위한 최적화된 주사 전자 현미경 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜을 사용하면 미생물군 조직의 공간적 차원을 설명할 수 있습니다.

Attine Ants' Gardens의 미생물군: 주사 전자 현미경을 통한 미생물 풍경 시각화

배우세요 Zootermopsis angusticollis의 후장 미생물에서 DNA 추출 및 시각화 방법을. 이 기술은 미생물 생태학 연구와 에너지 대사 경로 분석에 활용됩니다.

마이트의 굿 미생물 (Zootermopsis Angusticollis)에서 DNA를 추출하고 굿 미생물을 떠올리

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