Name: Periventricular Leukomalacia의 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 배우세요 P6 마우스에서 단측 경동맥 결찰과 저산소증을 이용한 Periventricular Leukomalacia 마우스 모델 수술법. 이 방법은 조산아 뇌손상 병리 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 보건 국립 연구소 (RO1 NS059043 및 RO1 ES015988), 국립 다중 경화증 학회, 빈혈 연구, Feldstein 의료 재단 로체 재단, 그리고 슈라 이너스 병원에서 보조금 지원 부분이다. 우리는 그의 제안을 데이빗에게 기쁨을 감사드립니다. 이 작품은 일부 보건 국립 연구소에서 WD 부여 (RO1 NS059043 및 RO1 ES015988), 국립 다중 경화증 학회 및 슈라 이너스 병원에서 지원했다. 우리는이 문서에 관한 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

P6 생쥐의 신생아 뇌 손상을 만드는 자세한 절차 : <ol><li> 출생 후의 일 6 (P6) 마우스는 유해 자극 (깊은 마취)에 응답하지 않는 문제의 지점에 얼음 간접 냉각과 함께 anesthetized 있습니다. </li><li> 알코올로 피부를 청소에 따라, 정중선 복부 절개는 목 앞쪽에에서 이루어집니다. </li><li> 해부 현미경, 오른쪽 일반적인 경동맥의 분기점은 부드럽게 retracting omohyoid 및 sternocleidomastoid 근육으로 접근합니다. </li><li> 경동맥 칼집 주변 근막을 제거하고, 근위 내부 지점은 후크와 함께 인근의 미주 신경 및 교감 신경에서 격리됩니다. 내부 경동맥은 다음 cauterizing 팁을 사용하는 불로 지졌죠 있습니다. </li><li> 소작 따라 피부 절개는 봉합하고, 다음 완전히 깨어하고는 댐에 반환까지 동물이 따뜻한 유지됩니다. </li><li> 한 시간 내고 후, 동물은 O 2에 도달 6.0 % 수준까지 질소로 주입 밀폐 챔버에 배치됩니다. 동물은 다음 hypoxia 35 분에 노출됩니다. </li><li> hypoxia 노출 후, 마우스는 30 분 가열 패드 (33 ° C)에 복구하고 강둑에 반환됩니다. 통합 hypoxia / 국소 빈혈과 감염 / 염증과 뇌 손상의 생성에, 동물은 다음 lipopolysaccharide의 0.015 ML (LPS, 1 MG / kg)와 intraperitoneally를 주입합니다. </li><li> post-hypoxia/ischemia 4 일, 마우스 그러면 다음 생리와 4 % paraformaldehyde로 perfused 유해 자극에 응답하지 않는 문제의 지점에 얼음 간접 냉각과 함께 anesthetized 있습니다. 뇌는이 제거되고 cryoprotected 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. H &amp; E의 얼룩과 허혈성 / hypoxic 마우스 모델에서 뇌 손상의 특성화. (A) 경동맥 내고으로 ipsilateral 대뇌 백색 문제에 초점 괴사는 (화살표) contralateral 대뇌 백질 (B)에 비해,있다. Ipsilateral 괴사와 초점 microinfarcts은 해마 (C)와 ipsilateral 대뇌 백질의 부상과 함께 두뇌의 시상 (D)에서 관찰됩니다. 대표 결과 및 피규어 : hypoxia / 국소 빈혈 및 / 또는 감염 / 염증과 PVL의 마우스 모델은 hypoxia와 LPS의 주입에 노출 다음 일방적 경동맥에 의해 이루어 내고 있습니다. 우리는 적당한 PVL 모델로 새로운 마우스 모델을 정의하고 있습니다. 전체 forebrain 통해 hematoxylin 및 - eosin (H &amp; E)와 스테인드 코로나 섹션 Neuropathological 심사에서 뉴런의 상대적인 살려주과 경동맥 내고 (그림 1A)에 ipsilateral 대뇌 반구의 중심 흰색 문제에 초점 괴사를 보여 overlying 대뇌 피질은 대뇌 백질 contralateral (그림의 1B)에 비해. 초점 인간 PVL의 특징이므로 초점 괴사성 백질에서, macrophages 및 반응 astrocytes 구성된 cellularity의 증가가 표시됩니다. contralateral 중앙 흰색 문제에 oligodendroglial 핵은 fascicular 같은 묶음으로 배열되어,이 아키텍처는 완전히 ipsilateral 측면에 초점 괴사에 의해 중단될 수 있습니다. 참고의, 우리는 ipsilateral 대뇌 백질의 부상과 두뇌에 ipsilateral 해마의 괴사 (그림 1C)와 시상 (초점 microinfarcts) (그림의 1D)를 관찰합니다. 인간 PVL는 또한 회색 물질의 병변을 동반으로부터 완전히 격리 발생하지 않습니다. 우리의 마우스 모델에 존재라고 생각되는 기능 - PVL의 특징은 부상 흰색 문제를 overlying 대뇌 피질의 살려주는, 완전한 상대,하지만하지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. periventricular leukomalacia의 마우스 모델에서 MBP 또는 O1의 흰색 물질 부상을 평가하기위한 0-5의 점수 규모. 우리의 마우스 모델은 phenotypic와 분자 수준 모두에서 PVL의 특징을 보여줍니다. 우리는 부상을 평가하는 myelin 기본 단백질 (MBP) 또는 O1 - 항원의 immunocytochemical 감지를 사용한 흰색 물질 부상을 (그림 2) 점수를 0에서 5 표준 규모를 설립하고, 흰 문제 병리학 (그림의 특징이 3.). 최근 않은 편견 stereological 분석은 초기 세미 양적 방법을 대체할 구현되었습니다. 또한, 기능성 결과에 흰색 물질 부상의 상호 효과에 대한 테스트를, 우리는 모터 기능에 대한 행동 검사를 수행합니다. 우리는 쥐가 P6에서 P10 - 21 다음의 hypoxia / 국소 빈혈 플러스 LPS를 공격할 모터 적자를 전시 것을 증명하고있다. 우리는 P10에서 부상 생쥐의 contralateral 사지 장애를 정의하는 0-4의 규모와 채점 기준을 설립-21. 일반적으로, 정상적인 마우스는 30 ° 경사면을 (4 점수)까지 질주하고 45 올라가 있습니다 ° 미끄럼하지 않고 경사면을 (3 점수). 부상자 마우스는 흰색 물질의 부상의 정도와 상관 관계에있는 낮은 점수를했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. MBP 또는 전자 현미경 (EM)로 O1 얼룩과 myelin 구조의 흰색 물질 부상의 특성화. MBP와 contralateral 흰색 물질에 비해 결합에 ipsilateral 대뇌 백질에 O1의 얼룩 쇼 myelin 손실. EM 시험은 결합에 contralateral 대뇌 백질에 myelinated axons를 보여줍 ipsilateral 흰색 문제에 대해 조직을 퇴화한. 우리는 PVL의 새로운 마우스 모델의 설립은 우리가 유치한 두뇌 PVL 같은 부상의 특정 메커니즘을 연구하도록 것으로 기대하고 있습니다. 우리는 관심의 개별 분자의 역할을 검토하고 neuroprotection의 목표를 평가하는 유전자 변형 마우스 변종을 사용 pathogenesis를 해결합니다.

<ol><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVolpe%2C+JJ+%22Neurology+of+newborn%22">Neurology of newborn</a>. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).</li>
<li>Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+periventricular+leukomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Progress in periventricular leukomalacia.</a> Arch. Neurol. 65, 1291-1295 (2008).</li>
<li>Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor-mediated+oligodendrocyte+toxicity+in+periventricular+leukomalacia%3A+a+protective+role+for+topiramate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate.</a> J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

개발 뇌에 부상은 치명적인 신경학 결과로 연결됩니다. 놀랍, perinatal 뇌 손상의 패턴은 높은 연령에 따라 달라집니다. 용어 영유아에서는 주로 특성의 연결 손실로 대뇌 피질에 영향을 미칩니다. 그러나, 조기 유아에서 그것이 선택적으로 개발 oligodendrocytes로 유명 부상과 대뇌 백질에 영향을 미치는, 장애 periventricular leukomalacia (PVL)를 칭했다. 조기 유아의 뇌 손상의 문제의 크기가 특이합니다. 조기 전달 및 개선 신생아 집중 치료가 1,500g 아래 birthweight 즉, 매우 낮은 출생 - 중량 유아와 함께 매년 출생 전세계 13,000,000 조기 유아 (미국에서 약 56,000)의 생존의 거의 90 % LED있다. 생존자의 약 10 % 이후에 뇌성 마비를 전시하고 약 50 %가인지하고 행동 적자 있습니다. PVL은시기 상조 영유아에서 가장 중요한 뇌 병리학 기본 뇌성 마비입니다. pathogenesis 잘 1,2 이해되지 않았기 때문에 PVL에 대한 구체적인 치료는 현재 부분적으로 존재하지 않습니다. PVL의 병인가 multifactorial지만, perinatal은 산모 자궁 내 감염 hypoxia / 국소 빈혈은 PVL의 주요 원인으로 생각됩니다. P7에서 쥐에서 PVL의 hypoxic / 허혈성 모델은 이전에 3 설립되었습니다. 이 모델은시기 상조 유아에서 PVL과 비슷한 점에서 고유합니다. 이 모델의 특징은 회색 물질의 경색을 특징으로하는 스트로크 모델의 대다수와는 대조적으로, 선택 흰색 물질 병리학입니다. 그러나, 쥐에서 hypoxic - 허혈성 모델의 한계는 간과해서는 안됩니다. 첫째, PVL의 병인은 종종 multifactorial입니다. hypoxia / 국소 빈혈, 모성 - 태아 감염 / 염증 이외에 강하게 PVL과 관련된 것입니다. 따라서, 결합 hypoxia / 국소 빈혈과 감염 / 염증 가능성이 더 PVL와 같은 모델을 만들 것이다. oligodendroglial 차별은 주로 설치류 동물의 출생 후의 행사이기 때문에 최선을 PVL 병변 (회임의 24~32주)에 대한 가장 큰 위험의 인간 발달 기간 상호 쥐 연령은 출생 후의 수 있습니다. 그것이 출생 후의 연령에 산모 - 태아 감염 / 염증을 생산하는 것은 불가능로서 PVL의 쥐 모델을 생성하기 위해 관련 출생 후의 발달 단계에서 감염을 시뮬레이트하기 위해 합리적인 것입니다. 우리는 더 많은 임상 관련 PVL 병변을 생산, P6에서 생쥐에서 hypoxic / 허혈성 모델 LPS 주입을 결합 모색했습니다. 둘째, 분자의 원인이되는 역할에 대한 최적의 증명 개념 실험 방법은 유전자 변형 생쥐의 사용을 요구, 유전자 조작은 마우스보다 쥐 훨씬 어렵습니다. 따라서, 우리는 마우스 쥐에서 PVL 우리의 실험 모델을 변환하기 위해 모색하고있다. 2) 치료 잠재력을 지닌 후보 요원을 발견할 약물 실험의 전도,, immunodeficient 마우스 변종을 사용하여 줄기 세포의 유틸리티 3) 테스트 PVL의 마우스 모델은 크게 가능한 유전자 변형 마우스 변종을 사용하여 질병 생물학과 pathogenesis 1) 연구를 촉진합니다.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4130</td><td></td></tr><tr><td>저산소 챔버</td><td>BioSpherix</td><td>A-30274</td><td></td></tr><tr><td>수술용 훅</td><td>F.S.T.</td><td>10064-14</td><td></td></tr></tbody></table>

periventricular leukomalacia의 마우스 모델

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

우리는 periventricular leukomalacia (PVL)의 마우스 모델을 구축을위한 프로토콜을 설명합니다. PVL는 조기 유아와 뇌성 마비의 가장 일반적인 행사에 뇌 손상의 주된 형태입니다. PVL는 저명한 oligodendroglial 부상 periventricular 흰색 물질의 손상이 특징입니다. 전신 감염 / 염증 여부와 상관없이 Hypoxia / 국소 빈혈은 PVL의 주요 원인입니다. 우리는 함께 hypoxia / 국소 빈혈의 유도하거나 또는 내독소의 lipopolysaccharide (LPS)의 주입없이 hypoxia에 노출 다음 일방적 경동맥 내고 함께 체계적 감염 / 염증없이 신생아 뇌 손상의 모델을 만들 수 P6 생쥐를 사용합니다. myelin 기본 단백질 (MBP) 또는 O1 및 전자 현미경 검사의 Immunohistochemistry은 해마와 시상에 추가 손상과 뇌성 흰색 문제에 저명한 myelin 손실을 보여줍니다. PVL의 마우스 모델의 확립은 크게 면역 결핍 마우스 변종을 사용하여 사용 가능한 유전자 변형 마우스 변종, 후보 치료 요원을 식별하기 위해 상대적으로 높은 처리량 방식으로 마약 재판의 전도, 그리고 줄기 세포 이식의 테스트를 사용하여 질병 pathogenesis의 연구를 용이하게합니다.

우리는 periventricular leukomalacia (PVL), periventricular 흰색 물질 병변을 특징으로 조기 유아의 지배 뇌 손상의 마우스 모델을 만들었습니다. 와 / 전신 감염없이 Hypoxia / 국소 빈혈은 PVL의 주요 원인입니다. 일방적 경동맥 내고과 lipopolysaccharide 주입없이 /로 hypoxia 노출 P6 생쥐의 PVL과 같은 병변을 만듭니다.

Periventricular Leukomalacia의 마우스 모델

우리는 뇌실주위 백질연화증(periventricular leukomalacia, PVL) 마우스 모델을 구축하기 위한 프로토콜을 설명합니다. PVL은 미숙아에게 나타나는 가장 지배적인 형태의 뇌 손상입니다...

이 절차를 시작하기 위해, P6 마우스를 얼음 위에서 간접 냉각하여 유해 자극에 반응하지 않을 때까지 마취시킵니다. 해부 현미경 하에서 오른쪽 총경동맥에 접근합니다. 수술용 훅을 사용하여 총경동맥을 인접한 미주신경 및 교감신경절로부터 분리합니다.그 다음 총경동맥을 소작합니다. 안녕하세요, 저는 University of California Davis 세포생물학 및 인체해부학과의 bin 연구실 소속 hin입니다. 안녕하세요, Jennifer Plain입니다.저 또한 Ang 연구실 소속입니다. 오늘은 뇌실주위 백질연화증(PVL) 마우스 모델을 제작하는 절차를 보여드리겠습니다. 미숙아에게 나타나는 뇌 손상의 주된 형태는 뇌실주위 영역의 특징을 보입니다.우리는 병변을 분석했습니다. 우리는 편측 경동맥 결찰과 저산소증 및 LPS 주입을 통해 PVL 유사 손상을 유도하기 위해 P6 생쥐를 사용했습니다. 우리는 실험실에서 PVL의 병리학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.PVL 마우스 모델을 구축하면 사용 가능한 형질전환 마우스 계통을 통해 질환의 병인 연구를 크게 촉진할 수 있습니다. 이러한 모델은 치료제 후보 물질을 발견하기 위한 비교적 고효율의 약물 시험뿐만 아니라, 줄기세포 이식 및 면역결핍 마우스 계통의 테스트를 용이하게 할 것입니다. 이제 시작해 보겠습니다.신생아 뇌 손상을 유도하는 수술을 시행하기 전, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다. 마취된 P6 마우스의 목 주변 피부를 알코올로 소독합니다. 그런 다음 목 앞부분의 복측 중앙선을 따라 절개합니다.해부 현미경 하에서 경갑상근과 흉쇄유돌근을 조심스럽게 견인하여 우측 총경동맥에 접근합니다. 경동맥초 주변의 근막을 제거합니다. 그런 다음 갈고리를 사용하여 총경동맥을 인접한 미주신경 및 교감신경절로부터 분리합니다.소작 후 총경동맥을 소작하십시오. 조직 접착제로 피부 절개 부위를 폐쇄하십시오. 동물이 완전히 깨어날 때까지 가열 패드를 사용하여 체온을 유지한 다음, 어미에게 돌려보내십시오.경동맥 결찰 1시간 후, 산소 농도가 6%에 도달할 때까지 질소가 주입된 밀폐 챔버에 마우스를 넣습니다. 동물을 35분 동안 저산소증에 노출시킨 후, 가열 패드 위에서 30분 동안 회복시킨 다음, 저산소증, 허혈 및 감염이 결합된 뇌 손상을 유도하기 위해 어미 쥐에게 되돌려 보냅니다. 염증 유도를 위해 동물에게 처음에 0.015 milliliters의 리포폴리사카라이드를 주입한 후 다시 어미 쥐에게 되돌려 보냅니다.뇌실 주변 백질연화증(periventricular leukomalacia, PVL) 마우스 모델의 대표적인 결과입니다. 우선, 전뇌 전체에 걸쳐 hematoxylin, eosin 및 luxol fast blue로 염색한 관상면 절편의 신경병리학적 검사 결과, 경동맥 결찰을 시행한 쪽의 대뇌 반구 중앙 백질에서 국소 괴사가 관찰됩니다. 국소 괴사 백질 부위에서는 대측 중앙 백질의 특징적인 인간 PVL 양상과 마찬가지로 대식세포와 반응성 성상세포로 구성된 세포 밀도가 현저히 증가해 있습니다.올리고덴드라핵은 다발 모양의 묶음으로 배열되어 있습니다. 이러한 구조는 동측의 국소 괴사에 의해 완전히 파괴됩니다. 동측 대뇌 백질 손상이 있는 뇌에서는 해마의 동측 괴사와 시상의 국소 미세 경색 또한 관찰됩니다.다음으로, 손상 정도를 평가하기 위해 myelin basic protein (MBP) 또는 O1 항원에 대한 면역세포화학적 검출을 수행합니다. 여기에는 0에서 5까지의 척도를 사용하여 백질 손상을 점수화하는 표준 척도가 제시되어 있습니다. 백질 병증은 MBP 또는 O1 염색과 전자현미경을 통한 미엘린 구조 분석으로도 특징지어집니다. MBP 및 O1 염색 결과, 결찰 반대측 백질과 비교하여 결찰 동일측 뇌 백질에서 미엘린 소실이 관찰됩니다.EM 검사 결과, 결찰 반대측 대뇌 백질에서는 수초화된 축삭이 관찰되었으며, 동측 백질에서는 퇴행성 조직이 관찰되었습니다. 마지막으로, 백질 손상이 기능적 결과에 미치는 상관 관계를 테스트하기 위해, 이 그래프에 표시된 바와 같이 운동 기능에 대한 행동 테스트를 수행했습니다. 등반 테스트를 기반으로 한 행동 점수 측정 결과, LPS 처리를 하지 않고 저산소성 허혈에 노출된 마우스는 P 14 정상 대조군 마우스에 비해 점수가 유의하게 낮은 것으로 나타났습니다.또한, LPS를 처리한 저산소-허혈 유도 마우스는 P 14 저산소-허혈 유도 마우스에 비해 점수가 유의하게 낮습니다. 지금까지 저산소-허혈 및 LPS 복강 내 주사를 통해 PVL 마우스 모델을 구축하는 방법을 설명해 드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 소작 전 공통경동맥을 다른 조직으로부터 분리하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 손상이 너무 심해지거나 아예 손상이 발생하지 않을 수 있습니다. 이것으로 설명을 마칩니다.시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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신경과학

쥐 intraluminal 중간 뇌성 가림 모델은 여기서 제공됩니다. 대뇌 경색의 범위는 neurologic 점수와 cresyl 보라색의 착색, TTC의 대안 얼룩, 병렬 많은 관심 마커에서 테스트 큰 이점을 제공함으로써 평가됩니다.

Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

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