Name: Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 학습하세요 생체 발광 이미징을 이용한 뇌종양 이종이식 모델 구축 방법을. 두개골 주사를 통해 무흉선 마우스에 인간 뇌종양 세포를 이식하고 종양 성장과 치료 반응을 실시간으로 모니터링하여 전임상 신경종양학 연구에 활용합니다.

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1. 종양 세포의 준비. 종양 athymic 마우스의 피하 성장으로, 또는 세포 배양에서 증식에서 인간의 뇌 종양의 xenografts에 대한 세포 중 공급 수 있습니다. 두 세포 소스의 이용은 세포 주입하는 방법의 시범과 함께 아래에 설명되어 있습니다. 조직이 처음 셀 집합 서스펜션 만들기 1 반복적인 pipetting하여 메스 후 기계 방해와 다진 어디에 intracranial 구획로 전송하기 위해 피하 종양에서 세포를 준비하려면, excised 측면 종양은, 문화, 요리에 배치됩니다. 셀 집계 정지 후 intracranial 사출에 적합한 단일 세포 현탁액을 생산하기 위해 필터 70 μm의 나일론 메쉬를 통해 전달됩니다. 세포 현탁액은 1000 4 10 분 RPM ° C, 그리고 최종 작업 농도 (아래 참조)을 구하는 혈청이없는 미디어의 적절한 볼륨에있는 세포 펠렛을 resuspending 전에 aspirated 뜨는에서 centrifuged입니다. intracranial 이식을 위해 설립된 세포 라인을 준비하는 경우, 전지가 다음과 같은 2 위에 표시된 셀을 centrifuging하고 resuspending, neurosphere 서스펜션 문화를 수집하여 trypsinizing monolayers에 의해 수확, 또는 있습니다. 주입된 세포의 숫자가 분사의 neuroanatomical 위치에 변수에 따라 달라집니다. brainstem 주사 3, 5 X 10 4 세포처럼 몇 가지가 0.5 μL 주입하는 반면 supratentorial 주사에 대한 우리가 일상적으로, 혈청 프리 미디어 (DMEM) 3 μL에 3-5 X 10 5 세포를 주입. 권장보다 큰 볼륨을 주입하는 것은 결과 exophytic (그림 1)가 아닌 intracranial 종양의 성장과 함께, 바늘 트랙트를 통해 종양 세포 환류이 발생할 수 있습니다. intracranial 주사에 대한 샘플을 철수 후, 남아있는 세포 현탁액을 주입 시리즈의 구성원 간의 intracranial 종양 설립을 완료하는 동안 적절한 농도를 유지하기 위해 자주 혼합 내용과 함께 얼음에 배치해야합니다. 2. 종양 세포 주입 참고는 아래에서 설명하는 모든 절차는 캘리포니아 샌프란 시스코 대학에서 기관 동물 사용 및 관리위원회의 검토와 승인되었습니다. <ol><li> 외과 영역 등 2 % chlorhexidine 솔루션으로, 살균제 모든 표면을 분사하여 준비되어야합니다. 소독제를 사용한 후 다음과 같은 소모품은 외과 영역에 배치되어야합니다 <ul><li> 마우스 체온을 유지하기 위해 가열 패드 </li><li> 2 % chlorhexidine을 포함한 3 % 과산화수소를 포함하는 하나 하나, 2 작은 배양 접시 </li><li> 무균 거즈 및 면화 면봉 </li><li> 멸균 일회용 scalpels </li><li> Autoclaved 외과 스테이플러 </li></ul></li><li> 마취에 대한 주입 마취를 사용해야합니다, 일반적으로 케타민을 - xylazine 혼합합니다. </li><li> 마우스 anesthetized되면​​, 두피는 멸균 거즈의 조각 chlorhexidine 용액에 담근 여러 번 보라고하여 준비가되어 있습니다. 아이 연고는 절차를 수행하는 동안 충분한 수분을 유지하기 위해 적용해야합니다. 멸균 메스를 사용하여 길이 약 1cm, parieto - 후두 골을 통해 화살 절개를 완료하십시오. 노출된 두개골 표면은 다음 3 % 과산화수소 용액에 담가 면봉을 사용하여 청소합니다. bregma은 (비디오 참조)이 시점에서 명확해야합니다. </li><li> 종양 세포의 주입을위한 좌표는 종양 설립 원하는 사이트에 따라 달라질 수 있습니다. 다음은 우리가 많은 뇌종양 환자는 종양 개발을 경험되는 neuroanatomical 위치에 했습니다만 종양 설립 2를 사용하는 프로 시저를 나타냅니다. 뇌종양 연구에 대한 관심의 다른 위치 brainstem 종양 3 해부학 모델링 폰스, 그리고 meningeal 종양의 위치 4 모델링 경막하 주사를 포함합니다. 사전 종양 세포 주입으로, 따라서 종양 세포 (동영상 참조)의 분사에 대한 개방을 만드는, bregma 및 코로나 치료 앞쪽에 1mm의 오른쪽에있는 2mm에 찔린 두개골에 멸균 25 게이지 날카로운 바늘을 사용합니다. 이 절차는 생쥐와 쥐 (쥐 22 게이지 바늘) 모두 잘 작동합니다. </li><li> 전에 주사기로 세포를 그리기 위해 손가락으로 눌러서하여 세포 현탁액의 내용을 섞는다. 공기 방울을 생성하지 않도록주의하고, 세포 현탁액의 원하는 금액으로 주사기를로드합니다. 주사기의 외부는 다음 extracranial 종양 설립과 성장 (그림 1A)을 예방하는 데 도움이됩니다 어떤 자기편 세포의 무료 외관을 닦아 알코올 면봉과 청소해야합니다. 적절한 주입 깊이가 달성되었는지 확인하려면, P20 pipetteman 팁의 지적 끝에서 3mm를 잘라 메스를 사용합니다. 팁의이 섹션은 주사기를 통해 장착할 수 있으며 사출 깊이를 제한하는 역할을하며, 또한 보장됩니다 TI주사기 바늘의 P는 두개골의 아래쪽에서 3mm이다. 두개골에 주사기의 직각을 플레이스와 이전에 만든 구멍, 천천히 세포 현탁액 (3μL 현탁액이 1 분 동안 주입한다)을 주입. 주사 삽입의 부적 절한 각도가 세포와 후속 척추 보급 (그림의 1B : 오른쪽)의 심실 분사가 발생할 수 있습니다 주입 완료되면 다른 잠시 동안 자리에 바늘을두고, 다음 천천히 (동영상 참조) 취소 : 다음 단계를 줄일 도움이 될 것입니다 종양 세포 환류. </li><li> intracranial 종양 세포 주입 5 남의 도움이없는 또는 무료 직접 접근 방식의 대안으로, 하나는 일반적으로보다 일관된 분사 위치를 장려 작은 동물 stereotactic 프레임을 (배선의 개요 패널 F)를 사용하지만, 할 수의 상당한 양의 비용 절차 시간. 무료 직접 접근 방법을 사용할 때 작은 동물 stereotactic 프레임과 함께 최대한의 주입 속도가 약 15 생쥐 / 시간이지만 우리의 경험에서는 두 외과 직원, 많은 60 마우스 / 시간을 주입하실 수 있습니다. 절차적 편의 쥐가 많은 시리즈를 주입 때 중요한 고려 사항이며, 주입으로 종양 세포가, 얼음에 남아있는 시간을 줄일 수 있습니다. </li><li> 살균 건조 면봉을 사용하여 3 % 과산화수소와 건조와 두개골을 청소합니다. 구멍에 멸균 뼈 왁스를 적용합니다. 포셉 사용하여 닫습니다 두개골과 주식을 통해 함께 두피를 그립니다. 최적의 치유 들어, 두피는 서로에 대한 두피의 각 측면의 진피 (아래쪽으로부터 아래쪽)로 잘라해야합니다. 잘라 두피는 다음 포스트 수술 고통 구호를위한 피하 주사에 의해 관리 Chlorhexidine 솔루션 및 buprenorphine를 사용하여 청소해야합니다. </li><li> 그들이 걸을되고 정상적인 활동을 유지하기 전까지 사후 operatively 모든 생쥐를 모니터링합니다. 일반적으로, 복구 시간은 30 분 정도입니다. </li></ol> 3. 종양 성장의 Bioluminescence 모니터링 <ol><li> 배경. Bioluminescence 이미징 (BLI)가 luciferin의 산화를 기반으로 [(-) -2 - D - (60 - 히드록시 20 benzothiazolyl) thiazone - 4 - 카르복실산] 산소와 아데노신 삼인산 (ATP)의 존재 인치 이 반응은 빛을 방출 결과와 광자로 화학 에너지를 변환 효소 루시페라제에 의해 촉매이다. 인간의 세포는 luciferin 기판의 존재에 발광 빛의 수있는 유일한 루시페라제 - 표현 전지 (아래 참조) 루시페라제 표현을 수정할 수 있습니다. 종양 성장과 생체내의 치료에 대한 응답의 매우 민감한 모니터링을 허용, 루시페라제 - 수정 종양 세포에서 발광 방출을 검출 매우 유리한 신호 대 잡음 비율이 그러한 luciferin 취급 호스트 동물에서 최소한의 배경 발광이있다. 또한, 루시페라제 및 기판, luciferin는 포유 동물 세포에 무독성으로 표시되었으며, 우리는 해당 수정되지 않은 세포 루시페라제 상대를 표현 세포 사이에 기능적인 차이를 관찰 없습니다. Luciferin은 쉽게함으로써 루시페라제 - 수정된 세포를 포함 모든 구역의 이미지를 허용, 세포 점막과 intraperitoneal 후 혈액 뇌 장벽 (IP) 또는 정맥 주사 (IV) 주사 생쥐의 교차. 루시페라제 - 수정된 세포에서 방출되는 빛의 광자 방출과 스펙트럼의 수준은 마우스 및 쥐 같은 작은 연구 동물의 조직에 침투하는 적절한이며, 낮은 조명 이미징 카메라와 외부 검색하실 수 있습니다. bioluminescence 이미징의 비침 투 자연은 종양 성장과 개별 동물 과목에서 치료 반응의 반복 모니터링을 허용합니다. </li><li> 이식 세포의 소스는 안정 반딧불 루시페라제 표현 수정해야합니다. 이러한 세포 소스는 구입, 또는 루시페라제의 제정 표현 건설되었습니다 lentivirus을 사용하여 개별 실험실에서 생산 수 있습니다. 우리는 강력하게 반복있는 개별 동물 과목 종양 부담의 변화에​​ 정확하게 표시를 제공하기 위해 정량 발광 이미징에 필요한 생체내에 루시페라제의 안정적인 세포 표현을 보장하기 위해, 오히려 플라스미드보다 루시페​​라제 인코딩 lentivirus와 수정된 세포의 사용을 권장 실험 과정 중에 몇 군데. </li><li> BLI 모니터링. 우리는 종양 세포 주입에 따라 일주를 시작, 양적 bioluminescence 이미징 (qBLI) 1X - 2X 주간을 실시하는 것이 좋습니다. 우리 qBLI은 IVIS 루미나 영상 역 (칼리퍼 생명 과학)을 사용하여 실시하고, 우리의 결과는 유사한 데이터가 IVIS 루미나, IVIS 150 또는 200 IVIS 이미징 스테이션을 사용하여 얻을 수있다 표시이다. 이미징을위한 준비, 마우스는 주사 후 12 분 군데 쥐, intraperitoneal 주입을 통해 케타민을 / Xylazine과 관리 luciferin (D - Luciferin의 칼륨 소금, 150 MG / kg, 칼리퍼 생명 과학)와 동시에 anesthetized 있습니다. luciferin의 pharmacokinetics에 따르면 adminis 사이의 시간luciferin 및 세포 발광의 결정 tration 최대 발광 방출 및 검출의 가장 큰 감도를 얻기 위해서는, luciferin의 10-15분 게시물 주입 사이 여야합니다. 10~15분 시간 간격 이내에 선택한 시간의 길이는 몇 군데되는 동물 사이에서 상수로 유지 관리해야합니다. 그것은 BLI 읽을 luciferin 및 취득의 분사 사이의 시간 길이의 일관성을 유지하기 위해 매우 중요합니다. 신호의 intracranial 지역을 포함한 관심 영역은 생활 이미지 소프트웨어 (그림 2)를 사용하여 정의하고 있으며, 총 photons/s/sr/cm2는 (평방 cm 당 steradian 당 초당 광자) (동영상 참조) 기록됩니다. </li><li> 데이터 분석. 종양 성장과 치료 반응은 개별 동물 모니터링 반면, 우리는 높은 종양 반응에 관한 결론의 확실한 통계를 높이기위한 최소한 8 치료 그룹을 권장하거나, 치료, 그것의 부족. 6,7를 읽고 해당 최대한의 전처리의 발광과 치료 처방의 완료 이후에 제시 qBLI 결과에 관련하여, 발광의 수치는 각 마우스의 발광을 나누어 정규화 값으로 변환하는 동안 취득합니다. 생존 분석을 위해, 카플란 - 마이어 견적 도구 (Traffic Estimator)는 8 사용하고, 생존 곡선이 생성하는에서, 그리고 중간 생존 값 결정. 생존 곡선 사이의 차이는 로그 순위 테스트 9를 사용 비교됩니다. </li><li> 치료 및 치료 종양의 후속 분석을 위해 두뇌의 검색. 동물 안락사되면, 마우스의 두뇌는 빠르게 (동영상 참조) excised, 그리고 중 종양과 형태학 immunohistochemistry의 후속 분석을 위해 포르말린에 배치하거나,​​ 표본 냉동 OCT에 탑재되어야한다. </li></ol> 4. 대표 결과 연속 의미 발광 값이 진행성 종양의 성장을 지시하기 전까지 그림 3A에 표시된 예제에서는 intracranial 종양 세포 주사를받은 생쥐는 intracranial 발광에 대한 모니터링했고,되는 시간 치료는 일 34시 (회색 화살표 시작 시작되었습니다 erlotinib 150 밀리그램 매일 관리 필수 안락사까지 / kg). 각각의 마우스에 대한 발광 값은 최종 전처리 이미징 값으로 정규화 각 마우스에 대한 후속 발광의 판독과 함께 치료를 시작 당시 1 정규화 값으로 설정됩니다. 예를 들어, 발광 6.0 증가했다 일 34시 2.0 X 10 7 광자 / 초, 중 최종 미리 치료 발광 읽기와 마우스는 하루에 38에서 X 10 7 광자 / 초, 하루 38 표준 발광의 가치를했을 3.0. 정규 bioluminescence 및 제어 및 치료 그룹에 해당하는 표준 오류를 평균은 각 이미징 시점에 대한 꾸몄다 있습니다. 이 예제에서는 의미 정규 발광에 큰 차이가 이후의 시간 지점에서 추가 증가를 보여주는 의미 그룹 발광의 차이와 치료의 개시 (일 38)에 이후 첫 번째 이미징 시점에 분명합니다. 대부분의 경우에서와 같은 qBLI로 표시 요법의 안티 종양 활동이 같은 경우가 여기 (그림 3B)이며, 생존에 해당하는 큰 차이 (즉, P &lt;0.05)와 함께합니다. 패널 3C 및 3D보기 인접 hematoxylin &amp; eosin 및 마우스 두뇌의 안티 EGFR 묻은 부분 sectioning 위해 포르말린 이후 파라핀 - 퍼가기의 resected 두뇌의 배치에 따라, 안락사 시점에서 획득. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. intracranial 사출 오류 징후. A) Exophytic (extracranial) 종양의 성장 (빨간색 동그라미)가 너무 큰 주사 볼륨, 주사기에 부착된 잔여 세포 현탁액으로 인해 발생할 수, 또는 종양 세포를 주입 후 너무 빨리 주사기를 철수에서. B) 심실로 종양 세포를 주입하면, 제대로 주입 종양 세포와는 달리, 사출 사이트 (왼쪽 마우스)에 현지 숙박하는 신호를 종양의 척추 보급 (오른쪽 마우스)을 일으킬 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 치료 반응 실험의 그림 2. 히트지도 이미지 컨트롤에서 마우스에 대한 대표 bioluminescence 강도의 표현 (왼쪽)과 치료 (오른쪽) 그룹. 생활 이미지 소프트웨어는 관심의 영역을 (빨간 동그라미) 정의로 설정할 수 있습니다, 또는 악기 연산자는 수동으로 관심 영역을 정의할 수 있습니다. 같은 그림 건설에 다음과 같이 이미지를 사용하는 경우, 우리는 악기의 연산자는 동물 과목 간의 bioluminescence 차이의 범위의 시각적 표현을 제공하기 위해 같은 bioluminescence 열지도 범위를 (그림의 상단 부분)를 사용하여 열지도 이미지를 표시하는 것이 좋습니다. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. Bioluminescence, 생존, 그리고 치료 반응은 분명있는 실험에서 종양 조직 분석. 표준 오차와 제어 및 치료 그룹의 마우스에 대한 의미 bioluminescence의 판독의) 플롯은 각 이미징 포인트 지적했다. B) 같은 마우스의 생존의 줄거리, P - 값은 로그 순위 테스트 7을 통해 결정됩니다. 종양과 마우스 뇌의 C) H &amp; E 스테인드 섹션을 참조하십시오. D) EGFR 스테인드 섹션을 참조하십시오. 종양 억제 단백질 PTEN에 대한 부정적인 얼룩을 보여주는 패널 E와 함께 각각 패널 C와 D,에서 표시 영역의 E와 F)은 배율.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Orthotopic (intracranial) 뇌종양의 이종 이식의 설립은 치료 응답을 테스트하기 위해 모델링 CNS 암 10 적절한 microenvironment를 제공합니다. 모델링 이러한 유형의 또한 두뇌와 실험 에이전트가 환자의 임상 시험 평가 고급할지 여부를 결정하는 매우 중요한 뇌 종양에 치료 접근에 관한 정보를 제공합니다. intracranial 이종 이식 종양의 양을 직접 같은 캘리퍼스로로 측정할 수 없기 때문에, intracranial 종양의 성장과 치료에 대한 응답의 길이 모니터링 누구의 주요 목표는 실험을위한 가장 실용적인 방법으로 우리의 경험 나타내는 bioluminescence 이미징과 비침습 영상을 필요로 치료 종양 반응 정도를 평가합니다. bioluminescence 이미징의 결과가 동물 주제 생존 분석과 결합되면 두 데이터 집합이 실험 치료 효능을 평가하기위한 강력하고 안정적​​인 접근 방식을 제공합니다. 마지막으로, intracranial 뇌종양의 xenografts가 치료의 morphologic와 분자 효과를 평가하기 위해 euthanized 동물 과목에서 수확되는 매우 중요하고, 이것에 대한 우리는 이후 분석을 위해 resected 두뇌 보존과 안락사의 시간에 전체 뇌 절제술을 선호합니다. 이전 프레 젠 테이션이 뇌 종양 연구와 관련된하였습니다 반면, 개념은 확실하게 설치류에 orthotopic 모델링 의무가 다른 인간의 암에 generalizeable 있습니다.

<table><tbody><tr><td>일회용 메스</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>거즈</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>2% 클로르헥시딘</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>3% 과산화수소</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>25g 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>10ul Hamilton 정밀 마이크로시린지</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>피부 스테이플러 및 스테이플</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>정위 고정틀</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 소프트웨어</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-루시페린</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td>칼륨염</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 intracranial 뇌종양의 xenografts 구축

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

인간의 뇌 종양 세포를 사용하여 이식 모델은 여러 해 동안 신경 종양학 연구에 필수적인 기능을 제공합니다. 과거에는 인간의 종양 이종 이식의 설립에 가장 일반적으로 사용되는 절차는 immunocompromised 생쥐에서 수집된 세포의 피하 주입 다음에 문화 flasks에서 세포의 수집 구성되어. 이 방법은 아직도 많은 실험실에서 자주 사용을보고 반면, 뇌 종양의 인스턴스에 해당 neuroanatomical 구조로 종양 세포 주사를 필요 orthotopic 이종 이식 설립으로 지난 10 년간 강조에 큰 변화를가되었습니다. intracranial 이종 이식 설립은 캘리퍼스의 사용, orthotopic 뇌종양의 이종 이식 모델 대한 강조의 변화에​​ 의해 직접 측정을 통해 종양의 성장과 같은를 모니터하는 능력을 제거하기 때문에 호스트 동물에 종양 부담을 평가하는 비침습 영상의 활용을 necessitated있다. 현재 사용 가능한 이미징 방법, bioluminescence 모니터링은 일반적으로 감도, 편의 및 비용 최고의 조합을 제공하는 것으로 간주됩니다. 여기, 우리는 orthotopic 뇌종양의 설립, 그리고 실험 치료법을 테스트할 때 종양 성장과 치료에 반응을 감시하기위한 절차를 보여줄 것입니다.

루시페라제 - 수정된 인간의 뇌 종양의 xenografts은 종양 성장과 bioluminescence 이미징을 사용하여 치료에 대한 응답의 후속 모니터링과 athymic 생쥐에 intracranially 설정할 수 있습니다. 생존 분석과 함께, bioluminescence 모니터링 뇌 종양 치료를위한 고려되는 요법의 사전 임상 시험을위한 필수적인 연구 도구입니다.

Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축

인간 뇌종양 세포를 이용한 이식 모델은 수년간 신경종양학 연구에서 필수적인 역할을 해왔습니다. 과거에는 가장...

수년 동안 인간 뇌종양 세포를 이용한 이식 모델은 주로 면역 결핍 마우스의 피하 주입 방식을 사용해 왔습니다. 최근에는 적절한 해부학적 구조인 뇌로 주입하는 방식으로 전환되는 추세입니다.본 비디오 논문에서는 두개골에 구멍을 내고 바늘을 사용하여 생체 발광 이미징을 위해 수정된 종양 세포를 주입하는 방식으로 마우스의 뇌내 종양 모델을 구축합니다. 수술 후, 종양의 성장 속도와 치료 반응을 모니터링합니다. 생체 발광 이미징 스테이션, 생존 분석, 조직 병리학 및 단백질 발현 분석을 통해 얻은 데이터를 사용하여 실험적 뇌종양 치료법의 효능을 평가할 수 있습니다.이 방법은 항종양제가 뇌에 도달할 수 있는지와 같이 신경종양학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 동물 숙주에서 배양된 인간 뇌종양을 치료하므로, 이 기술의 함의는 환자의 뇌종양 치료까지 확장됩니다. 조직 배양 후드 내에서 작업하십시오. 두개강 내 구획으로 이식할 피하 종양 세포를 준비하십시오.먼저 적출한 옆구리 종양을 조직 배양 접시에 넣습니다. 메스를 사용하여 조직을 잘게 다집니다. 그런 다음 피펫터를 사용하여 조직을 기계적으로 분쇄하여 세포 응집체 현탁액을 만듭니다.다음으로, 세포 응집물 현탁액을 70 $\mu\text{m}$ 나일론 메쉬 필터가 있는 스트레이너에 통과시켜 라운드 바텀 튜브에 수집합니다. 이 과정을 총 3회 반복하여 뇌내 주입에 적합한 단일 세포 현탁액을 제조합니다. 4°C에서 1000 RPM으로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 적절한 부피의 무혈청 배지에 재현탁하여 최종 작업 농도를 맞춥니다. 이는 피하 종양의 해리법에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.종양 세포는 확립된 뇌종양 세포주가 포함된 세포 배양물에서 수확할 수 있습니다. 원심분리를 통해 트립신으로 세포를 수확하십시오.원심분리 후 세포를 재현탁하여, 수동 수술적 초천막 주입에 적합한 부피의 무혈청 DMEM에 현탁합니다. 3 µL에 3~5 × 10⁵개의 세포가 포함되도록 준비합니다. 모든 표면에 2% chlorhexidine을 분사하여 수술 부위를 소독합니다.다음으로 수술 부위에 필요한 물품을 배치합니다. 마우스의 체온을 유지하기 위한 가열 패드, 3% hydrogen peroxide가 담긴 페트리 접시 하나와 2% Chlorhexidine이 담긴 페트리 접시 하나, 멸균 거즈와 면봉, 멸균 일회용 메스, 그리고 오토클레이브 멸균 수술용 스테이플러를 준비합니다.케타민-자일라진 혼합물로 마우스가 마취되면, 클로르헥시딘에 적신 멸균 거즈를 사용하여 수술 부위를 여러 번 닦아냅니다. 시술 중 적절한 습도를 유지하기 위해 연고를 도포합니다. 멸균 메스를 사용하여 후두골 위로 약 1cm 길이의 시상 절개를 실시합니다.3% 과산화수소 용액에 적신 면봉을 사용하여 노출된 두개골 표면을 깨끗이 닦아냅니다. 이 시점에서 종양 세포 주입을 위한 구멍을 만들기 위해 bgma가 분명하게 보여야 합니다. 멸균된 25게이지 鋭침(sharp needle)을 사용하여 두개골에 구멍을 뚫습니다.bgma의 우측으로 2 mm, 관상봉합선(coronal suture)의 전방으로 1 mm 지점입니다. 탭핑하여 세포 현탁액의 내용물을 혼합합니다. 주입기에 원하는 양의 세포 현탁액을 채웁니다.기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 알코올 솜으로 시린지 외부를 닦아 부착된 세포를 제거합니다. 이는 여기에 표시된 바와 같이 적절한 주입 깊이를 확보하여 뇌 외측에 종양이 형성되거나 성장하는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.소동물 정위 고정 장치를 사용하지 않는 경우, 메스를 사용하여 P 20 피펫 팁의 뾰족한 끝부분에서 3 mm를 잘라냅니다. 주입 깊이를 제한하여 주사 바늘의 끝이 두개골 하단에서 3 mm 거리에 위치하도록 팁 절편을 주사기에 끼웁니다. 따라서 절차의 다음 단계는 전체 방법 중에서 가장 어려운 부분일 수 있으며, 종양이 뇌의 정확한 위치에 정착하고 성장하도록 하기 위해서는 적절한 깊이 도달과 약물 전달이 매우 중요합니다.다음으로 주사기를 두개골의 구멍에 수직으로 배치하고 세포 현탁액을 천천히 주입합니다. 권장량보다 더 많은 부피를 주입하면 바늘 경로를 통해 종양 세포가 역류하여 뇌내 종양 성장이 아닌 피하 종양 성장이 발생할 수 있습니다. 여기에서 보여주는 것처럼, 주사기 삽입 각도가 부적절하면 세포가 뇌실 내로 주입될 수 있으며, 주입 완료 후 여기에서 보이는 것과 같이 후속적인 척수 전이가 발생할 수 있습니다.바늘을 1분 더 그대로 둔 다음 천천히 뽑아냅니다. 이러한 단계는 종양의 역류를 방지하는 데 도움이 됩니다. 두개골을 3% hydrogen peroxide로 세척하고 건조합니다.멸균 면봉을 사용하십시오. 핀셋을 이용해 구멍에 멸균 본 왁스를 도포합니다. 두피의 각 측면 진피를 서로 맞닿게 하여 두개골 위로 모은 뒤, 안쪽 면끼리 밀착시켜 스테이플러로 고정합니다.그 후 클로르헥시딘을 사용하여 두피를 세척합니다. 수술 후 통증 완화를 위해 부프레노르핀을 피하 주사합니다. 여기서는 보여주지 않았으나, 부프레노르핀은 빠르게 흡수됩니다.추가 마우스에 주입을 진행하십시오. 주입 시리즈의 개체 간에 적절한 농도를 유지하기 위해 주입 사이에 세포를 반드시 혼합하십시오. 통계적으로 유의미한 결과를 확보하기 위해 최소 8마리 이상의 처리군을 구성하는 것을 권장합니다.모든 마우스가 보행 가능해지고 정상적인 활동을 회복할 때까지 수술 후 상태를 모니터링하십시오. 일반적으로 회복 시간은 약 30분이며, 종양 세포 주입 일주일 후부터 시작합니다. 정량적 생체 발광 이미징(Quantitative bioluminescence imaging) 또는 QBLI는 일주일에 한두 번 수행해야 합니다.QBLI는 IVIS Lumina 이미징 스테이션과 Living Image 소프트웨어 버전 3.2를 사용하여 수행합니다. Windows 시작 메뉴에서 Living Image 소프트웨어 프로그램을 선택하십시오. 프로그램이 실행되면 카메라 제어 패널에 있는 IVIS 시스템 초기화 버튼을 클릭하십시오.초기화 후 온도 상태 상자가 녹색으로 표시되면 CCD 카메라가 적절하게 작동하고 있음을 나타냅니다. 마취된 루시퍼레이스 주입 마우스를 이미징 챔버의 스테이지 위에 놓으십시오. 이미징 세션에서 저장된 파일 중 하나를 열고 이미지 데이터 표시 단위를 counts에서 photons로 변경하십시오. 표적 신호의 초당 광자 수를 결정하려면 ROI 드롭다운 메뉴에서 원형 아이콘을 선택하십시오.관심 영역(ROI)으로 표시된 영역이 표적 신호 주변에 나타나야 합니다. 해당 신호를 동물 번호와 영상 촬영일이 표시된 Excel 파일에 입력하십시오. 영상 촬영 세션 동안 분석된 모든 동물에 대해 이 과정을 반복하십시오.이미징을 수행한 각 마우스의 광자 수가 결정되고 광자 값이 Excel 파일로 전송되면, 치료 요법 진행 중 및 완료 후에 얻은 각 마우스의 발광 측정값을 해당 전처치 최대 발광값으로 나누어 정규화된 값으로 변환하십시오. Prism 소프트웨어를 사용하여 생존 분석을 수행하려면, KAPLAN-Meier 추정법을 사용하여 생존 곡선을 생성하고 중앙 생존값을 추정하십시오.생존 곡선 간의 차이는 로그 순위 검정(log rank test)을 사용하여 비교합니다. 동물의 건강 상태가 현저히 악화된 경우, 특히 최대 체중의 20% 이상의 체중 감소가 나타나면 동물을 안락사시켜야 합니다. 안락사시킨 마우스의 뇌를 신속히 적출한 다음, 종양 형태 및 면역조직화학 분석을 위해 뇌를 포르말린에 넣습니다.본 예시는 34일째에 erlotinib 치료를 시작하여 두개강 내 종양 세포 주입 요법을 받은 마우스의 평균 정규화 발광 값을 보여줍니다. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 치료 시작 후 첫 번째 영상 촬영 시점에서 평균 정규화 발광의 유의미한 차이가 나타납니다. 대부분의 경우, 그룹 간 평균 발광 값의 차이는 이후 시점에서 더욱 증가하는 양상을 보입니다.QBLI로 나타난 치료 유도 항종양 활성은 그에 상응하는 유의미한 생존율 차이를 동반합니다. 본 사례와 마찬가지로, 파라핀 임베딩된 마우스 뇌 절편의 hematoxylin 및 eosin 염색은 종양 세포의 분포 양상을 보여줍니다. p10은 EGFR 억제에 대한 종양 반응과 빈번하게 연관되는 마커입니다.갈색 염색이 나타나지 않는 것으로 보아, 처리된 종양 세포의 Otin에는 P 10 발현이 없는 것으로 보입니다. 여기서는 파라핀에 매립된 마우스 뇌의 단면이 제시되어 있습니다. EGFR 억제제에 민감한 뇌종양 세포는 갈색의 EGFR 염색을 통해 확인할 수 있습니다.보신 바와 같이, 이 절차에서 가장 까다로운 부분은 종양 세포를 적절하게 주입하는 것입니다. 종양 세포의 유전적 변형이 성장에 미치는 영향을 조사하는 것과 같이, 이 접근 방식을 사용하여 수행할 수 있는 가장 심화된 실험은 무엇일까요? 이것으로 마치겠습니다.이 프레젠테이션이 유용했기를 바랍니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.

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출처: Clark, AJ, et al. 교모세포종에 대한 면역적격 동물 모델의 생물발광 영상. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 루시페라아제 발현 종양 세포와 루시페린을 사용하여 종양 성장을 비침습적으로 정량화하는 면역 적격 마우스 모델에서 교모세포종 진행을 추적하기 위한 생물 발광 이미징을 보여줍니다.

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쥐에서 교모세포종 환자 유래 이종이식 세포주의 입체정위 두개내 이식

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