Name: Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 배우세요 Drosophila 배아에서 생체내 원심 분리를 통한 세포소기관 밀도별 분리 방법입니다. 이 기술은 공동국소화 실험과 생화학 분석을 가능하게 하여 세포생물학 연구를 발전시킵니다.

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우리는 각각 Sciara coprophila 및 Ilyanassa obsoleta에 대한 인 - 생체내의 원심 분리를 테스트하는 자료를 공급 수잔 Gerbi, 하이디 스미스, 데이비드 램버트 감사드립니다. 우리는 기술과 원고에 대한 의견에 대한 Welte 실험실 구성원 감사합니다. 인 - 생체내 원심 분리 분석의 개발 및 개선을 모우에 NIGMS 부여 GM64687에 의해 지원되었다. 이미지가 그림에 표시됩니다. 1 그림. 5E, F는 이전에 다음 ID로 2를 출판 및 권한과 함께 reprinted 있습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

중요 단계 한천 농도가 충분히 높지되어 있는지 확인합니다. 너무 낮으면, 한천은 원심 분리하는 동안 분해되며, 태아가 파열하거나 임의로 지향합니다. 한천 농도 단지 약간 한천이 (단계 4.3에서 초과하는 TSS의 충분 건조 또는 불충 분한 제거) 젖었거나 너무 낮은 경우 경우 태아는 원심 분리하는 동안 그들의 구멍에서 부동과 부적 절한 중심이 될 것입니다. 한천 너무 얇게 부어있다면, 그것은 또한 축소 또는 원심 분리하는 동안 균열 것입니다. organelles 개별 수천개의 세포 내에 분리된 될 것입니다 때문에 배아는 cellularization 단계 이상의 고급 않았는지 확인합니다. 그렇지 않으면, organelles의 분리 (그림 5C) 작동하지 않습니다. 한 세포 단계에서 젊은 배아에서 organelles 큰 거리를 마이 그 레이션하는 무료이며 자신의 특성 밀도에 따라 축적. 너무 오래 배아를 분석 방지하기 위해, 확실하게 (I)은 암컷은 오래된 달걀 (단계 2.4), (II) (단계 2.5) 3 시간 또는 더 적은을위한 배아를 수집, (III)를하다 수 있도록 미리 컬렉션을 포함 시각 한천에 삽입을위한 cellularization 단계 전에 배아를 선택합니다 (단계 4.2), (IV) cellularization (단계 4.6)의 끝 부분을 통해 개발을 방지하기 위해 짧은 시간을 포함 유지하고, (V) (단계 5.6) 정확하게 레이어 않았 배아를 폐기 . 원심 분리 시간에 날림으로하다하지 마십시오. 배아 중 일부는 심지어 원심 분리의 불과 10 분 후에 좋은 겹겹이 표시되지만, 분리는 배아로부터 배아에 일관성이있다. 30 분 놀이는 매우 일관성있는 결과를 제공합니다. 원심 분리가 끝난 후 또한, 더 이상 원심 분리 시간은 더 이상 레이어는 안정됩니다. 이것은 사용하기 전에 추가로 배아를 처리하는 데 시간이 걸립니다 어떤 이들 응용 프로그램에 중요합니다 (예를 들어, 그들은 이식 실험에 대한 처리 또는 공촛점 분석을 위해 장착해야하는 경우). 가능한 수정 에그 수집 및 chorion 제거 대부분의 다른 프로토콜은 2 단계와 3 단계 1, 3, 9 존재하고, 사용되는 배아는 어릴 같은 것들은 오랫동안 여기에 설명뿐만 아니라 작동합니다, 달걀 수율이 높다, 그리고 분수 잘못 개최 배아가 최소화됩니다. 앞쪽에 - 사후 정렬 프로토콜은 뒷부분 끝이 한천에 묻힌과 앞쪽에 끝이 접속 (그림 3)이다 그러한 모든 배아를 orients. 그것이 원심 분리 (그림 1, 5) 동안 지적 결국 랜드마크로 micropyle을 사용할 수 있습니다 있도록이 방향은 일관성을 위해 좋다. 그러나, 연습, 그것은 밝은 - 필드 현미경에 의한 지질 - 비말와 노른자 레이어의 독특한 외모로 centrifuged 태아의 방향을 선택하기 쉽습니다. 그런 다음 양쪽 끝에와 배아를 탑재 가능됩니다, 이러한 유연성은 설치 과정을 속도. Unoriented 원심 분리 프로토콜의 가장 많은 시간과 기술적으로 도전적인 측면 한천의 배아 (4 단계)를 설치합니다. 그것은 (한 구멍에 삽입하고 한 번 원심 분리 후 복구)을 두 번 각각의 배아를 감동 필요합니다. 대안으로, 하나는 TSS 가득 microcentrifuge 튜브에 4.1 단계에서 배아를 전송할 수 있습니다. 이러한 튜브는 microcentrifuge (13,000 RPM, 10-30 분)에 centrifuged 때, 배아 것입니다 역시 일반적으로 계층 10-13. 이것은 유사 하나가 매우 빠르게 동시에 배아의 수백을 처리하실 수 있습니다. 그러나, 겹겹이은 일관성이 없다는 것입니다, 배아의 일부가 위의 프로토콜에 적용보다 훨씬 높은 원심 분리 세력 (~ 1만6천그램)에도 불구하고 서로 다른 레이어를 개발하지 않습니다. 더 많은 도전 태아의 방향이 변수이고, 하나는 주요 배아 축에 다양한 각도에서 분리를 볼 수있다는 사실입니다. 이 변화는 실험자가 특정 배아가 원심 튜브에 정렬 방식을 원심 분리 후에 정렬해야합니다. 그것이 안정적으로 그것을 할 많은 연습과 더 많은 판단을 필요로하지만 배아의 가장 밀도 부분 마커로 노른자의 autofluorescence의 사용과 함께, 이것은 종종 가능합니다. 샘플에 충분한 배아가있다면, 하나는 배아는 그림처럼 배열하는 일이있는 해당 인스턴스를 정렬하실 수 있습니다. 1. 자신의 알 껍질에서 배아의 원심 분리가 chorion 처음 2를 제거하지 않고 단계 4 한천의 배아를 포함시킬 수도 있습니다. 이 방법에서 수집 접시 배아는 할로 카본 오일 대신 단계 3.2 (할로 카본은 chorion의 투명한 세가)의 50 % 표백제 덮여있다. 해당 단계의 배아가 선택되고 핀셋을 사용하여 새 한천 플레이트로 전송되며, 핀셋, 손상만을 계란 필라멘트를 잡아서배아 적절한는 피할 수 있습니다. 배아는 앞쪽에 계란 필라멘트가 한천에있는 구멍까지 붙어서, 4.8을 통해 단계 4.4로 내장하고 있습니다. 배아가 centrifuged 및 단계 5.4에서와 같이 한천 밖으로 파고되고 난 후에 알 껍질은 50 % 표백 처리에 의해 제거됩니다. 계란 껍질의 존재에 원심 분리는 고정 후 devitellinization의 속도 (단계 6.2) 향상지만, 원심 분리에 대한 올바른 단계의 선택 (단계 4.2) 자세한 도전입니다. 애플 리케이션 특정 단백질이 특정 주요 organelle에 localizes 경우 colocalization 실험, 즉, 테스트를위한 배아의 원심 분리가 특히 유용합니다. 예를 들어, Klar 단백질이 초기 배아 지질 방울에 존재이며, 아직이 지방화는 그대로 태아에서 보여주는 도전이다. Klar puncta 및 지질 방울 모두 열심히 가짜 colocalization은 배제하고, 배아 주변 10 풍부하기 때문에 일부에서는이 있습니다. 그러나, 원심 분리는 별개의 레이어로 지질 방울을 집중하고, 따라서, Klar 신호 colocalization 10 명백한됩니다. 비슷한 분석 unambiguously 특정 histones 같은 놀라운 사례를 포함한 지질 방울 8, 13-15, 2와 단백질 ubiquitously 존재하는 경우에는 다른 단백질의 지방화를 보여주지만, 지질 방울 8 풍부했다. 배아가 발달 단계 (단계 4.2)에 의해 시각적으로 선택할 수 있듯이, 그것은 지질 방울 8, 15 단백질의 발달 규제 채용을 감지도 가능합니다. 지질 방울은 시각적으로 뚜렷한 &quot;모자&quot;에 축적 이후 지질 방울과 colocalization에 대한 테스트하는 것이 특히 쉽게, 아니 더 이상 마커 때문에 또는 얼룩이 레이어를 확인하기 위해 필요합니다. 사실, 때문에 간편하고 잠재적으로 눈에 띄는 시각적인 결과를 (그림 1, 그림 5. D, E), 우리의 실험실은 후보 단백질이 지질 방울로 지역화된 여부를 첫 번째 테스트로 지금은 정기적으로이 기술을 사용합니다. 원칙적으로 유사한 colocalization 연구 그림에 표시된 다른 organelles를 위해 작동합니다. 1, 그의 가능성 유통 centrifuged 배아에서 다른 (세포내 기생충 포함) 문서로 아직 가지고 있죠. 원심 분리가 꽉 밴드로 organelles을 집중하고 있기 때문에 이러한 organelles의 풍부한 소수의 고립을 용이하게합니다. 이 접근법은 이미 기증 배아 이식이에 대한 지질 방울을 복구하는 데 사용되었습니다. 또한 화학적으로 농축 분율 (예, 고정 15 일 이후에 배아에서 레이어를 절단하여) 분석하는 것이 가능해 질 수 있습니다. 원심 분리는 16 일 (개구리, nematodes, tunicates, annelids, 성게, mollusks, 그리고 Cnidarians 포함) 여러 종류의 달걀을 계충화하다하는 데 사용할 수있는 방법은 여기 Drosophila의 배아 이상의 응용 프로그램을 설명했다. 우리 자신의 연구실에서, 우리는 집파리 무스카 domestica 2의 태아에 대한 이상의 프로토콜을 사용하고 곰팡이 냇 Sciara coprophila 17 달팽이 Ilyanassa obsoleta 17 태아의 분석에 unoriented 원심 분리를 고용했습니다. 마지막으로,이 방법은 태아에 제한되지 않습니다 원심 분리 또한 oocytes (예 : Drosophila 2, 18 밀크 위드 버그 Oncopeltus fasciatus 17) 등 다른 대형 세포를 계충화하다에 유용할 수 있습니다. 다른 표본에 대한, 정확한 원심 분리 조건은 최적화할 필요가있다 : 예를 들어, 3,000g 10 분 효율적으로 무스카 domestica 2 배아를 계충화하다 충분한이며, 더 이상 centrifuged 경우, 태아는 고정 및 immunostaining 동안 떨어져 휴식하는 경향이있다.

<table><tbody><tr><td>60x15 mm 페트리 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>Falcon 제품</td></tr><tr><td>와이어 메쉬</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>304 스테인리스강; 메쉬 크기 #150 x150, 와이어 직경: 0.0026 inches</td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0.25 mm</td></tr><tr><td>Moria 니켈 도금 핀/바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>초파리 케이지</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 또는 59-101</td><td>각각 직경 65 mm 또는 100 mm 페트리 접시용</td></tr><tr><td>Halocarbon Oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

세포 organelles의 다른 유형의 정화 및 분리를위한 주요 전략은 낙관적인 밀도의 차이에 따라 서로에서 분리하는 것입니다. 그러나, 세포가 이전 원심 분리, 단백질이 아닌 모국어 환경에서 organelles을 방해하는 경우 종종 부적절하게 서로 붙어. 여기 우리는 그대로, 살아있는 Drosophila의 배아에서 밀도에 의해 별도의 organelles하는 방법을 설명합니다. cellularization 전에 초기 배아는 인구 케이지에서 수확하고, 자신의 외부 달걀 껍질은 50 % 표백제와 함께 치료에 의해 제거됩니다. 배아는 다음 한천의 작은 수직 구멍에 먼저 작은 한천 플레이트 및 삽입, 사후 최종으로 전송됩니다. 임베디드 배아가 포함된 플레이트는 3,000그램 30 분 centrifuged 있습니다. 한천은 배아를 지원하며 정의된 방향에서 그들을 유지합니다. 후에, 배아는 뭉툭한 바늘로 한천 밖으로 파고있다. 원심 분리는 밝은 - 필드 현미경으로 충화 쉽게 볼, 층이으로 주요 organelles를 분리합니다. 형광 마커의 숫자는 살아있는 배아의 성공 충화을 확인하실 수 있습니다. 특정 organelles와 연관된 단백질이 colocalization을 보여주는 특정 계층에 풍부한 것입니다. 개별 레이어는 기증자의 난자에 생화 학적 분석 또는 이식을위한 복구할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 종류의 계란과 oocytes 등 다른 대형 세포에 organelle 분리에 대해 적용됩니다.

우리 삶의 밀도에 의해 별도의 organelles하는 방법을 설명<em&gt; Drosophila</em&gt; 배아. 배아는 한천에 포함된하고 centrifuged 있습니다. 이 기법은 앞쪽에 - 후부 배아 축을 따라 주요 organelles의 재현성 분리 산출. 이 방법은 생화 학적 분석 및 이식 실험에 대한 colocalization 실험 및 수율 organelle의 분수를 용이하게합니다.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

다양한 유형의 세포 내 소기관을 정제하고 분리하는 주요 전략은 ...의 차이를 기반으로 이들을 서로 분리하는 것입니다.

초파리 알 내부의 주요 세포소기관을 밀도에 따라 분리하는 과정은 3시간 미만인 배아를 수집하는 것부터 시작합니다. 그 후, 표지 작업 후 50% 표백제에서 배양하여 난각을 제거합니다. 특정 단계의 배아를 아가로 고정합니다.마지막 단계로, 배아를 원심 분리하여 회수한 후 명시야 및 형광 조명을 사용하여 회수된 배아를 관찰합니다. 현미경 관찰을 통해 특정 단백질이 특정 세포 소기관에 국소화되어 있음을 확인할 수 있습니다. 세포 내 소기관을 정제하고 분리하는 주요 전략은 밀도 차이를 이용하여 다른 모든 세포 구성 성분으로부터 분리하는 것이지만, 원심 분리 전에 세포가 파괴되어 평소에는 분리되어 있던 단백질과 소기관들이 섞일 수 있다는 어려움이 있습니다.이러한 비천연적 인비트로(in vitro) 조건에서는 단백질들이 서로 엉겨 붙습니다. 반대로, 일부 단백질은 평소에 결합하는 구조물에서 떨어져 나갈 수도 있습니다. 우리가 설명하려는 이 기술의 주요 장점은 생체 내(in vivo)에서 밀도에 따른 분리가 가능하다는 점입니다.따라서, 이 방법은 세포를 파쇄하지 않으므로 그로 인해 발생하는 아티팩트를 방지할 수 있습니다. 이 방법은 주요 세포 생물학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 공동국소화(colocalization) 실험을 매우 용이하게 하며, 이식 실험 및 생화학적 분석을 위해 특정 소기관 분획을 분리할 수 있게 해줍니다.본 절차에서는 동봉된 서면 프로토콜에 상세히 설명된 대로 사과 즙이 포함된 고농도 한천 배지를 준비하여 플레이트에 붓습니다. 이 플레이트는 산란 단계와 이후 배아의 임베딩 및 원심 분리 단계 모두에서 사용됩니다. 본 절차는 알 수집 단계부터 시작합니다.먼저, 건조 효모를 물과 섞어 피넛 버터 정도의 점도로 만들어 효모 페이스트를 준비합니다. 그런 다음, 신선한 사과즙 한천 배지 플레이트의 일부를 효모 페이스트로 덮습니다. 성체 초파리는 바닥에 한천 배지 플레이트가 부착된 케이지에 보관합니다.현재의 플레이트를 제거하려면, 초파리 케이지를 뒤집어 실험대 위에 가볍게 두드립니다. 몇 번 반복하면 초파리들이 바닥으로 떨어지며, 이 매우 짧은 시간 동안 잠시 방향 감각을 잃게 됩니다. 이때 신속하게 기존의 한천 플레이트를 효모 페이스트가 도포된 새 플레이트로 교체하십시오.효모는 알 생산을 위한 영양분을 제공하며, 한천 내의 사과즙과 함께 산란을 유도합니다. 처음 30~60분 동안 수집된 알은 폐기하십시오. 이 시기의 알은 암컷이 수정 후 보유하고 있었기 때문에 발달 단계가 일치하지 않는 배아의 비율이 높습니다.이후의 난자 수집은 수정 직후에 적층된 난자가 주를 이루는 경향이 있습니다. 가장 일관된 적층은 어린 배아에서 이루어지므로, 최대 3시간까지 난자를 수집하십시오. 1시간 이하의 더 짧은 수집 시간이 권장됩니다.일상적인 실험에서는 핀셋을 사용하여 효모나 한천 배지 표면에 달라붙은 파리를 제거하십시오. 알을 수집한 후, 알껍질을 제거하기 위해 한천 배지를 해부 현미경 아래에 두고 투과 조명으로 배아를 관찰하십시오. 배아에서 알껍질을 제거하려면 알 필라멘트를 정확히 확인해야 합니다.50% 표백제를 아가 플레이트 아래에 뿌려 배아를 덮고 수 분 동안 배양합니다. 아가 플레이트를 가끔 흔들어 배아가 표백제 속에서 회전하도록 합니다. 현미경으로 알을 다시 관찰합니다.난자 필라멘트가 더 이상 보이지 않으면 코리안(Corian)이 성공적으로 제거된 것입니다. 이는 일반적으로 표백액에서 3~5분간 배양하는 과정이 필요합니다. 다음으로, 와이어 메쉬 바스켓을 체로 사용하여 배아를 표백액으로부터 분리합니다.바스켓은 중앙이 오목하게 들어간 2 cm x 2 cm 크기의 와이어 메쉬 평면 시트로 준비합니다. 핀셋으로 와이어 바스켓을 잡고 뒤집어 놓은 아가 플레이트 덮개 위에 둡니다. 아가 플레이트에서 표백제와 배아 슬러리를 와이어 메쉬를 통해 부어 아가 플레이트 덮개로 배수시킵니다.배아들이 한천 플레이트에 남아 있는 경우, 증류수를 플레이트에 뿌려 배아들을 떼어낸 후, 증류수와 배아 혼합액을 와이어 메쉬를 통해 붓습니다. 와이어 메쉬의 바닥을 페이퍼 타월에 대어 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음, 배아 손실을 최소화하면서 남은 표백제를 씻어내기 위해 와이어 바스켓의 가장자리를 따라 증류수를 뿌립니다.과잉 액체를 자주 닦아내십시오. 모든 표백제가 제거될 때까지 세척 단계를 5~10회 반복합니다. 와이어 바스켓에서 여전히 표백제 냄새가 난다면 배아 세척을 계속하십시오.배아를 충분히 세척한 후, 한천(agar)에 고정할 수 있습니다. 와이어 바스켓에서 배아를 씻어내십시오. 빈 페트리 접시에 TSS를 넣으면 배아가 바닥으로 가라앉을 것입니다.해부 현미경 아래에서 투과 조명을 통해 배아를 관찰합니다. 특정 단계의 배아는 육안으로 쉽게 식별할 수 있습니다. P 200 피펫을 사용하여 원하는 단계의 배아를 선택하고, 이를 작은 한천 플레이트로 옮깁니다.배아가 노화되고 있으며, TSS에 30분 이상 오래 침지하면 발달에 영향을 줄 수 있으므로 신속하게 작업하십시오. 피펫을 사용하여 Kim wipe 아래에서 TSS의 대부분을 제거하십시오.배지의 표면은 배아를 더 쉽게 밀어서 옮길 수 있도록 약간 습한 상태여야 합니다. 하지만 원심 분리 중에 과도한 액체가 있으면 배아가 구멍 밖으로 미끄러져 나올 수 있으므로, 플레이트 어디에도 액체가 고여 있어서는 안 됩니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 배아와 오거(auger)를 고정하는 것입니다.배아는 매우 섬세하여 쉽게 파괴되거나 거칠게 다뤄질 수 있으므로 이 과정이 특히 까다롭습니다. 이를 방지하려면 바늘을 천천히, 신중하게, 그리고 조금씩 움직여야 합니다. 배아가 견딜 수 있는 접촉 강도와 압력을 정확히 익히는 가장 좋은 방법은 연습하는 것입니다. 관찰하는 동안 뭉툭한 끝부분이 밖으로 나오도록 텅스텐 바늘을 니들 홀더에 거꾸로 장착하십시오.현미경 하에서 니들을 사용하여 각 배아 근처의 한천(agar)에 수직 구멍을 뚫습니다. 이때 니들을 기울여 잡으면 한천에 구멍을 뚫는 동시에 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 따라서 구멍을 완전히 수직으로 뚫기는 어렵지만, 니들을 약간 기울여 뚫으면 구멍의 한쪽에 미세한 함몰부나 홈이 생겨 배아가 이를 따라 구멍 속으로 쉽게 미끄러져 들어갈 수 있습니다.다음으로, 배아가 일관된 방향으로 구멍에 삽입되어야 하므로 길쭉한 배아의 전단과 후단을 식별합니다. 일반적으로 전단이 위로 향하게 하며, 전단의 난막은 특수한 구조로 특징지어집니다. 바늘의 뭉툭한 끝부분을 사용하여 배아를 밀어 아가르 위에서 이동시키고, 배아의 후단이 뚫린 구멍을 향하도록 방향을 잡고 조절합니다.그다음 전단(anterior end)을 구멍 쪽으로 밉니다. 배아는 천공 과정에서 생성된 약간의 오목한 부분을 따라 구멍 안으로 쉽게 미끄러져 들어가야 합니다. 배아가 위로 기울어지면, 구멍 더 깊숙이 밀어 넣으십시오.한천은 배아를 뚫린 구멍에 부분적으로 삽입한 후 손상 없이 더 깊숙이 밀어 넣을 수 있을 만큼 충분히 부드럽습니다. 완전히 밀어 넣으면 배아는 보통 이미 상당히 수직인 상태가 됩니다. 그렇지 않은 경우, 배아를 더 수직으로 정렬하기 위해 옆방향으로 밀어 줍니다.구멍이 너무 크지 않다면, 원심분리 과정 동안 아가(agar)에 의해 배아의 위치가 안정적으로 유지됩니다. 숙련도에 따라 플레이트당 100개에서 250개의 배아를 임베딩할 수 있습니다. 필요한 배아의 수는 후속 응용 분야에 따라 달라집니다.마운팅 시간은 짧게 유지하십시오. 마운팅 과정 중에도 배아가 계속 발달하므로 좁은 발달 단계 설정이 필요한 경우, 남은 미사용 배아를 습윤 붓과 비행 붓(fly brush)으로 제거하십시오. 그다음, 아가로 마운팅된 배아를 원심분리기에 넣으십시오.초파리 배아가 들어 있는 플레이트를 원심분리기의 스윙 버킷에 한천 면이 아래로 향하도록 넣습니다. 원심분리기의 균형이 고르게 맞았는지 확인하고, 4~10°C에서 4,000 rpm으로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 한천 플레이트를 해부 현미경 아래에 두고, 바늘의 뭉툭한 끝을 사용하여 TSS 층으로 덮어줍니다.구멍에서 배아를 파냅니다. 배아는 TSS 내에서 떠 있지만 잠겨 있는 상태를 유지합니다. 배아는 전단부의 갈색 캡, 투명한 중간 영역, 후단부의 짙은 회색 영역으로 명확하게 층이 나뉜 것처럼 보입니다.명시야 또는 에피 형광 현미경을 통한 직접 관찰 시 뚜렷한 층 형성이 나타나지 않는 배아는 폐기하십시오. P 200 피펫을 사용하여 TSS 내에서 층 형성이 잘 된 배아를 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 버퍼 내의 배아를 유리 슬라이드로 옮기고, 동반된 서면 프로토콜에 설명된 대로 마운트합니다.배아를 고정해야 하는 경우, P 200 피펫을 사용하여 TSS에 층을 이루어 놓인 배아를 신틸레이션 바이알로 옮기십시오. 표준 고정 기술을 사용하여 배아를 고정하십시오. 원심분리된 배아의 경우, 탈활성화 단계의 효율이 낮기 때문입니다.실행 가능한 범위 내에서 최대한 많은 배아를 준비하십시오. 배아를 이식 실험에 사용할 경우, 배아를 아가르 플레이트로 옮긴 후 커버슬립 위에 고정하십시오. 표준 배아 취급 절차를 사용하며, 해당 절차에 관한 참고 자료는 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.원심분리에 의해 유도된 층 분리는 수십 분 동안 안정적으로 유지됩니다. 여기 원심분리 전의 살아있는 oph 배아를 촬영한 명시야 이미지들이 있으며, 앞쪽 끝이 왼쪽, 뒤쪽 끝이 오른쪽 등쪽으로 표시되어 있습니다. 위쪽과 배쪽 아래쪽의 난할 단계 배아들이 균일하게 나타납니다.이와 같은 갈색 단계는 생체 내 원심분리에 이상적입니다. Blaster derm 배아는 모든 면에서 비슷하게 보이는 투명한 테두리가 있습니다. 이 투명한 주변부는 분화가 거의 끝날 때까지 확장됩니다.배아는 분절화가 끝날 때까지 원심분리를 통해 성공적으로 층분리를 할 수 있습니다. 난황과 핵의 층 형성은 분할 단계만큼 일정하지 않습니다. 세포 배아가 비대칭으로 나타난 후에는 배측과 복측이 뚜렷해지며 다양한 주름이 발달합니다.표시된 배아는 초기 배엽대 신장 단계에 있습니다. 이 단계에서는 원심분리가 더 이상 주요 세포소기관을 층화하는 데 효과적이지 않습니다. 배아 발생은 연속적인 과정입니다.따라서 이러한 단계들은 별개의 개체들이 아니라, 발생이 진행됨에 따라 서로로 전환됩니다. 이 타임랩스 영상은 분할 단계부터 배아 형성까지 4시간의 과정을 담고 있습니다. 배엽대 신장 과정은 720배속으로 빠르게 재생되었습니다.투과 조명을 사용하여 촬영한 원심분리 배아의 이미지입니다. 왼쪽 배아는 층분리가 잘 되었습니다. 저밀도 지질 방울이 최전방 끝부분에 지질 캡을 형성합니다.고밀도 난황 소포들이 후단에 암회색 구역으로 축적됩니다. 이 두 층은 다른 세포소기관과 세포질을 나타내는 넓고 투명한 층에 의해 분리됩니다. 오른쪽에 있는 배아는 고정 후 원심분리되었습니다.에피 형광 현미경을 사용할 수 있는 경우 층 형성은 최소화됩니다. 원심 분리된 이러한 살아있는 배아는 UV 여기 하에서 관찰할 수 있으며, 이때 난황은 강렬한 청색 수성 형광을 나타냅니다. 후극에 응집된 자가형광 물질 층은 원심 분리가 성공적으로 이루어졌음을 나타내며, 후단의 마커 역할을 합니다.배아를 고정하면 층의 외형이 급격히 변화합니다. 명시야 현미경으로 관찰 시, 지질 방울은 반투명해지고 지질층은 암갈색이 아닌 흰색의 솜털 같은 모습으로 나타납니다. Yo corso 형광은 고정에 의해 부분적으로 또는 완전히 파괴되어 강도가 훨씬 약해지거나 심지어 검출되지 않을 수도 있습니다.이 이미지에서는 세포 소기관들이 형광 마커로 표시되어 있으며, 마커들이 전후축을 따라 특정한 위치에 축적되어 있습니다. 특정 히스톤 융합 단백질은 지질 방울과 핵 모두에 국소화되므로, 이러한 세포 구획을 표시하는 것뿐만 아니라 표지된 핵의 수를 통해 배아의 단계를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 방금 보셨듯이, 이 절차에서 가장 까다로운 부분 중 하나는 배아를 오거(auger)에 매립하는 것입니다.하지만 약간의 연습을 통해 이 과정을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면, otherwise tedious colocalization experiments(번거로운 공국소화 실험)를 매우 쉽게 진행할 수 있습니다.예를 들어, 본 실험실에서는 형광 현미경을 통해 관심 단백질이 특정 주요 세포소기관에 국소화되는지 테스트하기 위해 이 기술을 일상적으로 사용합니다. 또한, 원심 분리된 배아에서 개별 층을 회수하여 생화학적 분석이나 이식 실험에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 초파리 배아뿐만 아니라 다른 대상에도 유용합니다.원심분리는 다른 종의 난자와 세포질 등이 포함된 다른 거대 세포 유형에서도 밀도에 따라 세포소기관을 분리합니다.

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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