Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

이 실험 절차의 전반적인 목표는 키네신 모터 단백질이 코팅된 표면 위에서 미끄러지듯 이동하는 미세소관에 나노구체를 결합시키는 것입니다. 이는 먼저 유리 유동 셀(flow cell) 표면을 카제인 용액으로 코팅함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 유동 셀 표면에 키네신 모터 단백질을 흡착시키는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 미세소관을 추가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 미세소관에 결합할 strept haver 분자를 추가한 다음, 나노구체를 추가하는 것입니다. 나노구체는 유동 챔버 표면에 결합하며, 그곳에서 미세소관에 의해 포집될 수 있습니다.

최종적으로, 형광 현미경을 통해 나노구체가 미세소관에 의해 포착되어 표면을 가로질러 운송되는 과정을 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 플로리다 대학교 재료과학 및 공학과의 Henry Hess 교수님 연구실 소속 Elaine Jen Smith입니다. 오늘은 역방향 운동성 분석법(inverted motility assay) 절차에 대해 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 미세소관으로의 화물 적재 및 분자 셔틀의 이동을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 이 비디오의 서면 설명 부분에 기술된 대로 모든 스톡 용액을 신선하게 준비하십시오.

스톡 용액을 제조한 후, 0.65 mL 마이크로 원심분리 튜브에 성장 용액 25 µL를 피펫팅하여 마이크로 튜불 준비를 시작합니다. 그런 다음 동결 건조된 비오틴화 튜불린 20 µg에 성장 용액 6.25 µL를 첨가합니다. 용액을 볼텍싱하고 37 °C 열욕조(heat bath)에 30분 동안 두어 중합시킵니다. 배양 후, 용액을 Taxol Buffer로 100배 희석하고 가볍게 볼텍싱합니다.

이 용액은 미세소관을 안정화하는 역할을 합니다. 용액에 MT 100이라고 표시하고 상온에서 보관하십시오. 다음으로, anti fade 버퍼를 사용하여 MT 100을 10배 희석하고, 이 용액을 MT 1000으로 표시하십시오.

그런 다음 키네신 용액을 TP 버퍼로 20배 희석하여 키네신 모터를 준비합니다. 해당 용액에 kinesin 20이라고 표시하고 얼음 위에 보관하십시오. 마지막으로 스트렙타비딘과 나노스피어 용액을 제조합니다.

먼저, Antifa Buffer에 Alexa Fluor 568로 표지된 streptavidin을 100 nM 농도로 첨가합니다. 해당 용액을 STV 100으로 표시하고, nanospheres를 Antifa Buffer로 5,000배 희석한 후 이 혼합물을 NS 5,000으로 표시합니다. 이 두 용액을 모두 얼음 위에 보관하십시오.

화물 적재 분석을 위한 용액 준비가 완료되면, 커버 슬라이드와 유리 커버 슬립을 양면테이프로 고정하여 유체 칩(flow cell)을 제작합니다. 먼저 커버 슬라이드의 가장자리에 양면테이프 두 줄을 붙이되, 테이프 사이의 간격을 약 1cm로 유지합니다. 그다음 테이프 위에 커버 슬립을 덮어 놓습니다.

핀셋의 평평한 면을 사용하여 커버 슬립에 압력을 가해 밀봉합니다. 제작된 유동 셀(flow cell)의 크기는 길이 약 2cm, 너비 1cm, 높이 100 µm이며, 부피는 약 20 µL입니다. 이제 도립 분석 장치 조립을 시작합니다.

피펫 팁을 커버슬립과 슬라이드 사이에 배치합니다. 그런 다음 0.5 mg/mL 카제인 용액을 플로우 셀에 주입합니다. 플로우 셀의 이러한 코팅을 통해 키네신이 흡착 후에도 그 기능을 유지할 수 있습니다.

카제인 용액이 코팅되도록 5분 동안 기다립니다. 다음으로, 키네신(Kinesin)을 20개 용액의 키나제(kinase)를 도입하여 플로우 셀(flow cell)에 흡수시킵니다. 파이펫 팁을 커버 슬립과 슬라이드 사이에 배치하여 플로우 셀에 용액을 도입합니다. 그런 다음 용액을 플로우 셀의 한쪽 끝에서 주입하는 동시에 반대쪽 끝에서 흡수하여 제거합니다.

거름종이를 사용하여 키네신(kinase in)이 흡수되도록 5분 동안 기다립니다. 다음으로, MT 1000 용액을 플로우 셀에 피펫팅하여 미세소관을 플로우 셀 내부로 도입합니다. 미세소관이 키네신 모터에 부착된 후, 미세소관이 가라앉아 키네신 모터에 완전히 결합될 수 있도록 5분 동안 기다립니다.

플로우 셀에 STV 100 용액을 주입하여 미세소관을 형광 strep TTR로 코팅합니다. strep TTR 분자가 미세소관에 결합할 수 있도록 5분 동안 기다립니다. 플로우 셀에 Antifa 용액 30 µL를 세 번 주입하여 과잉의 strep TTR을 씻어냅니다.

마지막으로, NS 5,000 용액을 플로우 셀에 피펫팅하여 비오틴화된 폴리스티렌 플루오레세인 나노구체를 도입합니다. 표면은 정지 상태로 흡수됩니다. 나노구체는 이동하는 미세소관과 충돌하여 그 위에 부착될 것입니다.

본 실험에서는 100 x 오일 대물렌즈, X site, 20 램프 1개 및 exon E-M-C-C-D 카메라가 장착된 eclipse TE 2000 U 형광 현미경을 사용합니다. 먼저, 대물렌즈 위에 이머전 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 그 다음, trixy 필터 큐브를 사용하여 현미경 스테이지에 플로우 셀을 장착합니다.

미세소관의 초점을 맞춘 후, 피츠 필터 큐브(fitzy filter cube)로 전환하여 나노구체를 관찰하십시오. 다음으로, and or I exon 프로그램을 열고 획득 모드를 키네틱(kinetic)으로 설정하십시오. 노출 시간은 0.5 seconds, 키네틱 시리즈 길이는 20, 키네틱 사이클 시간은 6 seconds로 설정하여 사용하십시오.

현미경의 관찰 경로를 접안렌즈에서 카메라로 전환하고 이미지 획득을 시작합니다. 처음 4장의 이미지에서는 trixi 큐브를 사용하여 미세소관을 촬영합니다. 다음 12장의 이미지에서는 Fitz 필터 큐브로 전환하여 나노구체 이미지를 획득합니다.

그런 다음 다시 trixi 필터 큐브로 전환합니다. 미세소관을 이미지화하기 위한 마지막 4장의 이미지에서는 Trissy 필터 큐브를 사용하여 미세소관을 관찰하며, 필터 큐브를 fite로 전환합니다. 여기서 나노구체를 시각화하면, 미세소관에 의해 운반되는 나노구체들이 화살표로 표시되어 있습니다. 모든 나노구체가 미세소관에 포착된 것은 아닙니다.

이제 36초 후의 나노구체 위치를 보여주며, 나노구체가 이동했음을 알 수 있습니다. 미세소관을 다시 촬영하면 미세소관 또한 시야를 가로질러 이동했다는 것이 분명해집니다. 이러한 이미지들은 나노구체가 미세소관 셔틀링으로 인해 변위되었음을 입증합니다.

지금까지 역전 운동성 분석법(inverted motility assay)을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 미세소관(microtubules)과 나노구체(nanospheres)를 모두 관찰할 수 있도록 이미지를 획득하는 동안 필터 큐브를 교체해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.