Name: Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 키네신 모터 단백질 위에서 활주하는 미세소관을 이용한 나노입자 화물 적재 방법을. 이 기술은 나노스케일 수송 시스템 개발에 활용됩니다.

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우리는 그의 그룹 이후 회사에 의해 조정되었다 글라이딩 운동성 분석을위한 기본 프로토콜을 개발 조나단 하워드에 크게 빚을 수 있습니다. NSF 그랜트 DMR0645023의 재정 지원은 기꺼이 인정받고 있습니다.

1.) 버퍼 및 시약 이러한 솔루션은 사전에 준비하고 편리하게 크기 aliquots에 보관해야합니다. 나누어지는는 전형적인 실험과 신선한 나누어지는 각 운동성 분석을 위해 사용되어야에 대한 충분한 해결책을 포함해야합니다. 저장 조건 및 전형 나누어지는 크기는 다음과 같은 프로토콜에 언급하고 있습니다. 1. BRB80 버퍼 (80 MM 파이프, 1 MM MgCl 2, deionized 소주 1 MM EGTA (DD) 물, 코에서 6.9로 조정 PH) <ul><li> DD 물에 0.5 M EGTA의 100 ML 주식 솔루션을 확인하십시오. 2 M NaOH 용액을 사용하여 7.0으로 산도를 조정합니다. </li><li> DD 물 1 M MgCl 2 100 ML 주식 솔루션을 확인하십시오. 솔루션을 압력솥. </li><li> 파이프와 DD의 물을 약 800 ML에 3.1 g 코 알약의 24.2 g을 추가하고 디졸브로 저어. 1 M 코 솔루션을 사용하여 6.9으로 산도를 조정합니다. 0.5 M EGTA 주식 솔루션과 1 M MgCl 2 주식 솔루션 1 ML 2 ML을 추가합니다. DD 물로 볼륨 1000 ML로 가져 오십시오. </li><li> 나중에 사용하기 위해 -20 ° C 50 ML 팔콘 튜브 및 동결로 나누어지는. BRB80 튜브 현재 사용중인 4 ° C 또는 상온에서 저장할 수 있습니다. </li></ul> 2. 마그네슘 염화물 MgCl 2 (DD 물을 100 ㎜) <ul><li> 100 mm의 최종 농도를 달성하기위한 DD의 물에 희석. </li><li> 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 저장소로 나누어지는 (10 μL 볼륨) </li></ul> 3. 구아 노신 5' - 삼인산 -, 나트륨 소금, GTP (NaOH에 의해 7 조정 DD 물, pH를 25 ㎜) <ul><li> 밖으로 무게와 DD 물에 용해 2 M NaOH 용액에 의해 7 산도를 조정합니다. </li><li> 260 nm의 UV 흡광도에서 측정하여 농도를 확인합니다. (11.7 X 103 M -1 cm -1의 흡광 계수를 사용하여). </li><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (10 μL 볼륨). </li></ul> 4. 디메틸 sulfoxide, DMSO <ul><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (10 μL 볼륨). </li></ul> 5. Taxol (DMSO 1 ㎜) <ul><li> 밖으로 무게 1 mm의 최종 농도를 달성하기 퓸 후드 아래에 DMSO에 용해. </li><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨). </li></ul> 6. D - (+) - 포도당 (DD 물 2 M) <ul><li> 밖으로 무게 2 M.의 최종 농도를 달성하기위한 DD의 물에 용해 </li><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨). </li></ul> 7. 포도당 산화 효소 (BRB80 2 MG / ML) <ul><li> 2 MG / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 BRB80에 디졸브. </li><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨). </li></ul> 8. Dithiothreitol, DTT (DD 물 1 M) <ul><li> 1 M.의 최종 농도를 달성하기 퓸 후드 아래에 DD 물에 용해 </li><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨). </li></ul> 9. 카탈 라 아제 (BRB80의 0.8 MG / ML) <ul><li> 0.8 MG / ML의 최종 농도를 달성하기위한 최소한 2 단계에서 BRB80에 용해. 276 NM 및 406 nm의 (276 NM에서 3.1 X 10 5 M -1 cm -1 및 2.2 X 10 5 M -1 cm 406 nm의에서 -1의 흡광 계수를 사용하여 UV 흡광도에서 측정하여 각 단계에서 농도를 확인하고 방정식 A = CL). </li><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨). </li></ul> 10. 아데노신 5' - 삼인산 -, ATP (100mM MgCl 2 100 ㎜) <ul><li> DD 물 100 MM MgCl 2 주식 솔루션을 준비합니다. 건조 분말을 무게와 100mM의 최종 농도를 달성하기위한이 주식 솔루션 디졸브. </li><li> 260 nm의 UV 흡광도에서 측정하여 농도를 확인합니다. (15.4 × 10 3 M -1 cm -1의 흡광 계수를 사용하여). </li><li> 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨). </li></ul> 11. 카제인 용액 (BRB80 20 MG / ML 카제인) <ul><li> 50 ML 팔콘 튜브 30 ML의 DD 물을 약 3g 카제인을 추가합니다. 약 1 시간 동안 소용돌이 솔루션까지 두꺼운 일관성을 개발하고 있습니다. </li><li> 30 분 정도 1만5천그램에서 원심 분리기. 0.5 μm의 및 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 뜨는을 필터링합니다. </li><li> 280 NM (0.67 ML MG -1 cm -1의 흡광 계수를 사용)에서 UV 흡광도를 측정하여 표면에 뜨는의 농도를 결정합니다. 20 BRB80의 MG / ML로 희석. </li><li> 나누어지는 (20 μL 볼륨)에0.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장하는. </li></ul> 2.) 표준 솔루션 이들은 실험 당일 준비하고 실험이 끝난 후 폐기하여야한다. 각 1 ML을 준비합니다. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> BRB80 얼음 이상 0.5 MG / ML 및 저장소의 최종 농도 카제인 솔루션을 희석. 이 솔루션은 이전 kinesin에 흐름 세포에 도입하여 표면에 흡착 후 kinesin 활동을 유지하는 데 도움이됩니다. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> BRB80 얼음 이상의 저장소에있는 0.2 MG / ML 카제인 1 MM ATP를 준비합니다. Kinesin은 더욱 흐름 세포에 도입하기 전에이 솔루션을 사용하여 희석합니다. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> BRB80에 상온에서 10 μm의 및 저장소의 최종 농도 taxol 솔루션을 희석. 이 솔루션은 microtubules을 안정화하는 데 사용됩니다. </li></ul> 4. BRB80CT <ul><li> 10 μm의의 taxol과 BRB80 0.2 MG / ML 카제인과 실온에서 저장을 준비합니다. 이것은 더욱 antifade와 미세 소관 솔루션을 준비하는 데 사용됩니다. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> 20 MM D - 글루코오스, 20 μg / ML 포도당 산화 효소, 카탈 라 아제 8 μg / ML, 10 MM의 DTT, 그리고 BRB80CT 20 μm의 ATP와 실온에서 저장을 준비합니다. 이 솔루션은 streptavidin과 nanospheres을 희석하기 위해 사용되며 흐름 세포에있는 여분의 streptavidin "를 씻어"입니다. kinesin 속도는이 솔루션의 ATP 농도를 조절하여 제어할 수 있습니다. </li></ul> 3.) Kinesin 준비 <ul><li> 익스프레스 kinesin는 야생 형, 전체 길이 Drosophila melanogaster kinesin 중쇄 및 C - 터미널 대장균에서 그의 태그 구성된를 구축 6에서 설명한 니켈 NTA 칼럼을 사용하여 정화. </li><li> -80에서 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 aliquots (10 μL 각)를 확인하면 ° C 나중에 사용하기 위해. 이러한 aliquots에 적극적으로 kinesin의 농도는 약 200 nm의 수 있습니다. 7 </li><li> 전형적인 실험은 kinesin 솔루션에게 BRB80CA 20 배 희석. 얼음을 통해 솔루션 KIN20하고 저장을 라벨. </li></ul> 4.) 미세 소관 준비 <ul><li> 0.5 ML의 microcentrifuge 관에서 성장 솔루션을 25 μL를 준비 : 4 MM에게 MgCl 2, 1 MM GTP와 5% DMSO (V / V)를 BRB80 버퍼 인치 </li><li> 동결 건조된 biotinylated tubulin의 20 μg의 나누어지는이 솔루션의 6.25 μL를 추가합니다. </li><li> 37 열 욕탕에 소용돌이 다음 장소 ° 중합 30 분 C. 부드럽게 BRB80T과 와동 100 배 희석. 상온에서 솔루션 MT100하고 저장을 라벨. </li><li> BRB80AF에 MT100의 10 배 희석하십시오. 솔루션 MT1000을 라벨. </li></ul> 5.) Streptavidin 및 Nanosphere 솔루션 BRB80AF 100 NM의 농도에 AlexaFluor568 - 라벨 streptavidin을 준비합니다. 얼음 위에는 STV100 및 저장 라벨. 마찬가지로, BRB80AF 솔루션 nanospheres 5,000 배 희석. 얼음 통해 NS5000하고 저장을 라벨. 6.) 플로우 셀 건설 양면 테이프로 분리된 두개의 유리 coverslips를 사용하여 flowcell을 구성. 이 흐름 세포는 1cm 폭 및 100 μm의 높이 약 2cm 길이이며, 약 20 μL의 볼륨을했다. 솔루션은 종이 필터를 사용하여 다른에서 피펫과 악한 아웃를 사용하여 한쪽의 흐름 세포에 도입하고 있습니다. 7.) 인버티드 분석 어셈블리 유리 표면 처음 kinesin가 흡착시 그 기능을 유지할 수 카제인과 코팅입니다. kinesin가 adsorbed되면 microtubules은 kinesin에 의해 개최되는, 소개하고 있습니다. Microtubules 그때 형광 streptavidin과 함께 코팅하고 있습니다. 초과 streptavidin을 세척 후 biotinylated 폴리스티렌 플루오레신 nanospheres (40 나노미터 직경)을 소개합니다. 표면 adsorbed 고정 nanospheres은 이동 microtubules과 충돌하고 (그림 1)에로드하십시오. 다음 솔루션의 도입 전에 허용되는 솔루션과 시간의 흐름의 순서는 다음과 같습니다. <ul><li> BRB80CS0.5 5 분 </li><li> KIN20 5 분 </li><li> MT1000 5 분 </li><li> STV100 5 분 </li><li> BRB80AF, 배 </li><li> NS5000 </li></ul> 8.) 현미경 즉시 nanosphere 소개 후 현미경 단계에있는 흐름 전지를 탑재합니다. 본 실험에서는 이클립스 TE2000 - U 형광 현미경 (니콘, 멜빌, NY) 100X 오일 목표 (NA 1.45), X - 인용 120 램프 (EXFO, 온타리오, 캐나다)과 iXon EMCCD 카메라 (ANDOR을 갖춘 사우스 윈저, CT)가 사용되었다. FITC 필터 큐브 (# 48001)과 TRITC 필터 큐브는 (# 48002, 채도 테크놀로지, 로킹엄, VT) 이미지 nanospheres와 microtubules respecti하는 데 사용되었다vely 흐름 세포의 바닥 표면에. 노출 사이의 시간 2 S. 동안 노출 시간, 0.2s되었습니다 <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 분자 셔틀의 개략도 그림.

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

사소한 수정이 프로토콜은 성공적으로 kinesin - 미세 소관 운동성 기반의 assays를 조립하는 그룹의 다양한 의해 사용되고 있습니다. 최종 운동성 솔루션 10 MM의 DTT는 0.5 % β - 메르 캅 토 에탄올로 대체 수 있습니다. 2 시간 이상 된 표준 솔루션 (BRB80AF, KIN20 및 MT1000) 사용해서는 안됩니다. 특히 taxol과 microtubules를 포함한 모든 솔루션은 얼음에 배치해서는 안됩니다. 기능 구성 요소 photodamage의 UV 여기 광 결과에 흐름 세포의 과도한 노출 :. 흐름 세포 이러한 폴리스티렌 nanospheres로 높은 산소 확산과 폴리머를 포함하는 경우 microtubules와 kinesin 8이 효과는 더욱 발음 9.

<table><tbody><tr><td>Adenosine-5&amp;rsquo;-triphosphate (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>비오틴 튜불린 (Biotin tubulin)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>카제인 (Casein)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제 (Catalase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도당 (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide, DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (Dithiotreitol, DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-amin&amp;#8211;thylether)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 비오틴화 미세구체, 40 nm, 황록색 형광 (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>포도당 산화효소 (Glucose oxidase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine-5&amp;rsquo;-triphosphate (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘 (Magnesium Chloride, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>파클리탁셀 (Paclitaxel, Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&amp;#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼륨 (Potassium hydroxide, KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨 (Sodium hydroxide, NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 568 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

세포는화물의 적극적인 세포내 수송을 지원하기 위해, 이러한 kinesin 모터 단백질 및 미세 소관의 필라멘트로 복잡한 분자 기계를 발전시켜 왔습니다. kinesins 꼬리 도메인화물의 다양한 바인딩 있지만, kinesins 머리 도메인은 미세 소관을 따라 격자 단계로 ATP 분자에 저장된 화학 에너지를 활용. 길고 뻣뻣한 microtubules는 장거리 세포내 전송을위한 트랙으로 제공하고 있습니다. 이러한 모터 및 필라멘트는 분자 셔틀 하나의 구성 요소로서 microfabricated 합성 환경에서 근무하실 수 있습니다. 자주 사용되는 디자인, kinesin 모터 자신의 꼬리를 통해 트랙 표면에 고정하고, 기능화 microtubules이 모터에 의해 추진 아르화물 운송 요소로 제공하고 있습니다. 이 셔틀은 비오틴과 streptavidin 사이의 강력하고 선택 바인딩을 이용하여화물로 로드할 수 있습니다. 주요 구성 요소 (biotinylated tubulin, streptavidin과 biotinylated화물) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 고전 거꾸로 운동성 분석 2 빌딩 분자 셔틀 건설 여기서 자세한 내용입니다. Kinesin 모터 단백질은 카제인과 precoated 표면에 adsorbed되며 microtubules는 biotinylated tubulin에서 polymerized kinesin을 준수하고 이후 rhodamine - 라벨 streptavidin과 함께 코팅하고 있습니다. ATP 농도는화물 3 로딩을위한 최적의 미세 소관 글라이딩 속도를 달성하는 subsaturating 농도에서 관리하고 있습니다. 마지막으로, 플루오레신 - 표시 nanospheres은화물로 추가됩니다 biotinylated. Nanospheres은 표면에 준수 글라이딩 microtubules와 nanospheres 사이의 충돌의 결과로 microtubules을 첨부합니다. 프로토콜은 쉽게 이러한 biotinylated DNA 4, 양자 점 5 biotinylated 항체 4-6 통해 항원의 다양한으로화물의 다양한 로드할 수 수정할 수 있습니다.

표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.

Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

세포는 능동적인 세포 내 수송을 지원하기 위해 키네신(kinesin) 모터 단백질과 미세소관 필라멘트와 같은 정교한 분자 기계를 진화시켜 왔습니다...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 키네신(kinesin) 모터 단백질이 코팅된 표면 위에서 활주하는 미세소관(microtubule)에 나노구체(nanosphere)를 결합시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 유리 유동 셀(flow cell) 표면을 카제인(casein) 용액으로 코팅합니다. 그다음 단계로 키네신 모터 단백질을 유동 셀 표면에 흡착시킵니다.절차의 세 번째 단계는 미세소관을 추가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 미세소관에 결합하는 strept haver in 분자를 추가한 후 나노구체를 추가하는 것입니다. 나노구체는 유동 세포 표면에 결합하며, 여기서 미세소관에 의해 포집될 수 있습니다.최종적으로, 형광 현미경을 통해 나노구체가 미세소관에 의해 포착되어 표면을 가로질러 운송되는 과정을 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 플로리다 대학교 재료과학 및 공학과의 Henry Hess 박사 연구실 소속 Elaine Jen Smith입니다. 오늘은 역전된 운동성 분석법(inverted motility assay)의 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 마이크로튜블로의 화물 적재와 분자 셔틀의 이동을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 본 영상의 서면 설명에 기술된 대로 모든 스톡 용액을 새로 준비하십시오.스톡 용액을 조제한 후, 0.65 mL 마이크로 원심분리 튜브에 성장 용액 25 µL를 피펫팅하여 마이크로 튜불 준비를 시작합니다. 그다음, 동결건조된 비오틴화 튜불린 20 µg에 성장 용액 6.25 µL를 첨가합니다. 용액을 볼텍싱하고 37 °C 항온수조에서 30분 동안 정치하여 중합시킨 후, Taxol 버퍼로 용액을 100배 희석하고 가볍게 볼텍싱합니다.이 용액은 미세소관을 안정화하는 역할을 합니다. 해당 용액에 MT 100라고 표시하고 실온에서 보관하십시오. 다음으로, anti fade 버퍼를 사용하여 MT 100을 10배 희석하고 이 용액에 MT 1000라고 표시하십시오.그런 다음, kinesin 용액을 TP 버퍼로 20배 희석하여 Kinesin 모터를 준비합니다. 해당 용액에 kinase in 20라고 표시하고 얼음 위에 보관하십시오. 마지막으로, streptavidin 및 nanosphere 용액을 제조합니다.먼저, Antifa Buffer에 Alexa Fluor 568이 표지된 streptavidin을 100 nM 농도가 되도록 첨가합니다. 이 용액을 STV 100으로 표시한 후, nanospheres를 Antifa Buffer로 5,000배 희석하고 이 혼합물을 NS 5,000으로 표시합니다. 이 두 용액을 모두 얼음 위에 보관하십시오.화물 적재 분석을 위한 용액 준비 후, 커버 슬라이드와 유리 커버 슬립을 양면테이프로 분리하여 플로우 셀을 제작합니다. 먼저 커버 슬라이드의 가장자리에 두 개의 양면테이프 조각을 붙이되, 테이프 사이의 간격을 약 1cm로 둡니다. 그다음 테이프 위에 커버 슬립을 덮습니다.핀셋의 평평한 면을 사용하여 커버슬립에 압력을 가해 밀봉합니다. 제작된 플로우 셀의 크기는 길이 약 2cm, 너비 1cm, 높이 100µm이며, 부피는 약 20µL입니다. 이제 도립 어세이 조립을 시작합니다.피펫 팁을 커버 슬립과 슬라이드 사이에 위치시킵니다. 그런 다음 flow cell에 0.5 mg/mL casein 용액을 주입합니다. flow cell의 이러한 코팅은 kinesin이 흡착된 후에도 기능성을 유지할 수 있게 합니다.카제인 용액이 코팅될 때까지 5분 동안 기다립니다. 다음으로, 파이펫 팁을 커버 슬립과 슬라이드 사이에 배치하여 키네아제 20 용액을 유동 셀에 주입함으로써 Kinesin을 흡착시킵니다. 그런 다음 용액을 유동 셀의 한쪽으로 주입하는 동시에 반대쪽으로 흡수시켜 배출합니다.거름종이를 사용하여 키나신(kinase in)이 흡수될 때까지 5분 동안 기다립니다. 다음으로, MT 1000 용액을 플로우 셀에 피펫팅하여 미세소관을 플로우 셀 내부로 도입합니다. 미세소관이 키나신 모터에 부착된 후, 미세소관이 가라앉아 키나신 모터에 완전히 결합할 수 있도록 5분 동안 둡니다.STV 100 용액을 플로우 셀에 주입하여 미세소관을 형광 strep TTR로 코팅합니다. strep TTR 분자가 미세소관에 결합할 수 있도록 5분 동안 기다립니다. Antifa 용액 30 µL를 세 번 플로우 셀에 주입하여 과잉의 strep TTR을 씻어냅니다.마지막으로, NS 5, 000 용액을 플로우 셀에 피펫팅하여 비오틴화 폴리스티렌 플루오레세인 나노구체를 도입합니다. 표면은 정지 상태로 흡수됩니다. 나노구체는 이동하는 미세소관과 충돌하여 그 위에 부착됩니다.본 실험에서는 100 x 오일 대물렌즈와 X site, 20 램프 하나, 그리고 exon E-M-C-C-D 카메라가 장착된 eclipse TE 2000 U 형광 현미경이 사용됩니다. 먼저, 대물렌즈 위에 이머전 오일을 한 방울 도포합니다. 그 다음, trixy 필터 큐브를 사용하여 플로우 셀을 현미경 스테이지에 장착합니다.미세소관의 초점을 맞춘 다음, 나노구체를 관찰하기 위해 fitzy 필터 큐브로 전환합니다. 다음으로 and or I exon 프로그램을 실행하고 획득 모드를 kinetic으로 설정합니다. 노출 시간은 0.5 seconds, kinetic 시리즈 길이는 20, kinetic 사이클 시간은 6 seconds로 설정하여 사용합니다.현미경의 설정을 접안렌즈에서 카메라로 전환하고 이미지 획득을 시작합니다. 처음 4장의 이미지의 경우, trixi 큐브를 사용하여 미세소관을 촬영합니다. 이어지는 12장의 이미지의 경우, Fitz 필터 큐브로 전환하여 나노구체의 이미지를 획득합니다.그런 다음 다시 trixi 필터 큐브로 전환합니다. 미세소관을 촬영하기 위한 마지막 4장의 이미지에서, 미세소관은 Trissy 필터 큐브를 사용하여 관찰하며, 필터 큐브는 fite로 전환됩니다. 여기서 나노구체를 시각화하면, 미세소관에 의해 운반되는 나노구체들이 화살표로 표시되어 있습니다. 모든 나노구체가 미세소관에 의해 포집된 것은 아닙니다.이제 36초 후 나노구체의 위치를 보여주면 나노구체들이 이동했음을 알 수 있습니다. 미세소관을 다시 촬영하면 미세소관 또한 시야를 가로질러 이동했음이 분명해집니다. 이러한 이미지들은 미세소관의 셔틀링(shuttling)으로 인해 나노구체들이 변위되었음을 입증합니다.지금까지 역방향 운동성 분석(inverted motility assay)을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 이미지 획득 중에 필터 큐브를 교체하여 미세소관(microtubules)과 나노구체(nanospheres)가 모두 보이도록 하는 것이 중요합니다. 이상으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

소포 또는 세포 소기관과 같은 화물의 세포 내 수송은 편광된 미세소관을 추적하는 분자 운동 단백질에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 뉴런 내부로 이동하는 개별 화물 입자의 수송 방향성과 관련 운동 단백질의 상대적 양 및 유형의 상관관계를 설명합니다.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

여기에서, 프로토콜은 키네신 -1-화물을 식별하기 위해 제시된다. 키네신-1 중쇄 (KIF5B)의 모터리스 돌연변이는 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 모두 집계는 형광 현미경에서 검출된다. 유사한 전략이 다른 모터 단백질화물을 식별하기 위해 사용될 수있다.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

동시에 문화 네 개의 힘줄을 로딩에 대한 체외 시스템에 새로운가 설명되어 있습니다.

텐든의 전 생체내 기계 중

칼슘은 시냅스 강도 신경 전달 물질 릴리스 및 변경 실행을위한 필수적인 신경 시스템에 유비 쿼터스 메신저입니다. 여기 + - 지표 Drosophila 신경 터미널에 칼슘이 로딩을위한 기술을 보여줍니다. 우리는 또한 필요한 장치의 제조를 설명하고 기술의 성공을위한 중요한 포인트를 강조.

칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

여기 우리는 감독, 분자 진화를 통해 트레 recombinase의 생성을보고. 트레 recombinase는 감염된 인간의 세포에서 provirus의 절단 및 박멸 그 결과, HIV - 1 provirus의 LTR 시퀀스 내에서 미리 정의된 대상 시퀀스를 인식합니다. 아직 초기에있는 동안, 감독 분자 진화는 분자 수술과 분자 의학의 도구가 될 것입니다 정의 효소의 생성을 허용합니다.

트레 Recombinase의 분자 진화

배우세요 키네신 모터 단백질 위에서 활주하는 미세소관을 이용한 나노입자 화물 적재 방법을. 이 기술은 나노스케일 수송 시스템 개발에 활용됩니다.

Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

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