Name: Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 마이크로어레이 기술을 이용해 tRNA 아미노아실화 수준을 게놈 단위로 분석하는 방법입니다. 이 기법은 스트레스 조건에서 단백질 합성 효율성을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

판 실험실에 효모 작품 아지 노 모토 (주) 일본 건강 교육 그랜트 T32GM007183 - 33 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다. 우리는 효모 프로젝트에 장기 협력에 대한 의학의 인디애나 대학 대학원에서 박사 로널드 Wek 감사합니다. 우리는 또한 microarray 방법을 충전 tRNA 개발을위한 박사 킴벌리 디트마 감사합니다.

1 부 : 총 청구 tRNA의 분리 <ol><li> 오분 2000 RFC에서 탁상 원심 분리기의 펠렛 세포. 세포의 OD 600 1 동등 총 RNA의 적어도 1μg을 생산해야 30 μg 최소가 절차를 권장합니다. </li><li> 0.3 M 구성된 용해 버퍼 용액에 Resuspend 세포가 + - 아세테이트 (산도 4.5) 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나 버퍼. 30 S. 세 번 각 (산도 4.5) 나 + - 아세테이트 - 포화 페놀 / 클로로포름의 동일한 볼륨 소용돌이 항상 vortexing 사이의 얼음에 샘플을 보관해야합니다. 아세트산은 페놀 / 클로로포름은 클로로포름 / 페놀 구 부분 M은 아세테이트를 버퍼 한 부분 5 (산도 4.5) 혼합하여 준비할 수 포화 동안 버퍼 아세테이트는 NaOAC와 HOAc에서 준비하실 수 있습니다. 참고 : 총 RNA의 분리가 부과 tRNA의 deacylation을 피하​​기 위해 약간 산성 조건 하에서 얼음에 수행됩니다. </li><li> 4 15 분 동안 18,600 RFC에서 원심 분리기 ° C. 수성 층을 제거하고 다른 아세테이트 - 포화 페놀 / 클로로포름 추출을 수행합니다. </li><li> 두 번째 추출 에탄올의 2.7x 볼륨을 추가하고 4 30 분 18,600 RFC에 centrifuging ° C.를하여 RNA를 침전 후 </li><li> 용해 버퍼 용액에 다음 Resuspend RNA 알약은 에탄올과 함께 두 번째 시간을 촉진. </li><li> 마지막으로, 10 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5) 및 후속 치료를 위해 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 솔루션에서 RNA를 resuspend. 예제는 안정에 대한 두 주 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 일부 청구 tRNA가 deacylate 시작되므로 더 이상 보관하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol> 2 부 : tRNA 표준의 작성 <ol><li> 히트 E. 10.5 μm의에서 85 대장균 tRNA 표준 ° C 2 분 45 MM 트리스 - CL의 산도 7.5 인치 튜브를 타고 3 분 상온에서 둡니다. </li><li> 37 20 MM과 부화의 최종 농도 ° 5 분 C로 MgCl 2를 추가합니다. </li><li> 최종 반응 5 μm의 tRNA, 60 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 12.5 MM MgCl 2, 10 MM KCl, 3 MM dithiothreitol, 1.5 MM ATP, 1 ㎜ spermine, 각각의 1 ㎜를 포함하므로 synthetase 반응 믹스 추가 아미노산, 그리고 4.2 단위 / μl E. 대장균 aminoacyl - tRNA synthetase의 믹스. 37 품어 ° C를 15 분. </li><li> 0.5 M 버퍼 아세테이트 (산도 4.5)의 동일한 볼륨을 추가하고 산도 4.5에서 아세테이트 - 포화 CHCl / 페놀 3 압축을 풉니다. </li><li> 4 30 분 18,600 RFC ° C.에서 에탄올과 centrifuging의 2.7x 볼륨과 tRNA 기준을 촉진 </li><li> 최대 1 개월에 대해 -80 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 저장 ° C와 50 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5)의 기준에 Resuspend. </li></ol> 파트 3 : tRNA의 Cy3/Cy5 라벨링 <ol><li> 청구 tRNA 샘플 각 E.는 0.066 μm의와 0.1 μg / μl의 농도에서 총 RNA를 품어 대장균 tRNA 기준 (예 : 0.67 pmole μg 총 RNA마다 각각의 표준)과 실온에서 30 분 50 MM NaIO4의 존재 100 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5). 컨트롤 전체 tRNA 샘플 사용 NaIO4 대신에 NaCl 50 MM하십시오. 전용 충전 보존하기 위해 버퍼 솔루션 RNA를 희석 것을 잊지 마십시오. </li><li> 반응을 담금질하기 위해서는 100 mm까지 포도당을 추가하고 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 샘플로부터 남아 NaIO4를 제거 G25의 스핀 컬럼을 사용하여 버퍼 교환을 수행하기 위해서는. 최상의 결과를 귀하의 샘플을 적용하기 전에 그것을 통해 200 MM 버퍼 아세테이트 버퍼 (산도 4.5)를 실행하여 먼저 열을 평형하십시오. </li><li> 66 MM과 에탄올의 2.7x 볼륨의 최종 농도 133 MM과 NaCl의 최종 농도 버퍼 아세테이트 (산도 4.5)을 추가하여 샘플을 촉진. 때때로 두 번째 강수량은 산화 샘플에 필요한 수 있습니다. 펠렛 같은 샘플의 통제 펠렛보다 훨씬 달라 보이는 경우에만이 필요합니다. 예를 들어 훨씬 더 이상의 확산 펠릿하십시오. 두 번째 에탄올 침전은 50 MM 아세테이트 버퍼 산도 4.5과 에탄올의 추가되기 전에 NaCl 200 MM에 resuspend 펠렛을 필요한 경우. </li><li> deacylation에 대한 tRNA 샘플은 50 MM 트리스 - HCL에 resuspended 아르 (산도 9) 30 분 37 ° C에서 incubated. 반응 50 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5) 100 MM NaCl의 동일한 볼륨의 추가에 의해 무력화됩니다. 에탄올의 2.7x 볼륨 침전물. 강수량 후, RNA는 ~ 1 μg / μl에서 물에 resuspended 있습니다. 제어 및 산화 샘플 모두 RNA의 품질을 확인하는 아가로 오스의 젤에서 실행해야합니다. </li><li> tRNA 0.1 μg / μl deacylated RNA에 형광 oligo 태그를 첨부하는 것은 1X ligase 버퍼, 15% DMSO, 4 μm의 Cy3 또는 Cy5 함유 oligonucleotides, 0.5 단위 / μl T4의 DNA ligase에 incubated, 그리고 효모 엑소 - 인산 가수 분해 효소 (5,000 16 단위 / μl) ° C 숙박 (16 이상 H). 엑소 - 인산 가수 분해 효소는 효모에서 얻은 샘플에 필요한이며 omitte 수 있습니다D이 프로토콜은 E. 사용하는 경우 대장균이나 인간의 샘플. </li><li> 내고 샘플 / 페놀 클로로포름의 동일한 볼륨 압축을 푼 다음 50 MM KOAc (산도 7), 200 MM KCl, 그리고 4 권과 혼합 후. 수성 단계의 추출에 따라 RNA 준비는 에탄올로 시켰던하고 약 0.1 μg / μl로 물에 resuspended. </li><li> 결합 효율은 7m 요소를 포함하는 12 % polyacrylamide의 젤의 샘플 5~10%를 실행하여 평가하고 형광 젤 스캐너와 시각하실 수 있습니다. 이 페이지 분석은 산화 및 컨트롤 샘플 microarray의 하이브리드화에 필요한 금액을 결정하는 것도 유용합니다. 좋은 내고 결과 ~ Cy3/Cy5 포함된 oligonucleotide의 10 % 이상이 tRNA에 출혈도 잡았되고 표시됩니다. 좋은 라벨 효율 샘플, 샘플 당 0.1-0.5 μg의 총 RNA는 배열 하이브 리다이 제이션에 사용됩니다. </li></ol> 파트 4 : Microarray의 하이브리드화 분석 <ol><li> 하이브 리다이 제이션 microarray 슬라이드 전에는 언바운드 oligonucleotides를 제​​거하는 1~2분 위해 증류수 삶은 있습니다. </li><li> Cy3/Cy5 라벨 샘플은 140 μg / ML 70 μg / ML의 최종 농도 폴리 (A)의 최종 농도 하이브 리다이 제이션 버퍼와 연어 정자 DNA의 140 μl와 결합됩니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 프로그램 (표 1), 자동 배열 hybridizer에서 실행됩니다. tRNA 작업에, 그것은 매우 수동으로 하이브리드화 높은 배경을 생산하고 이후 자동으로 하이브리드화 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 프로그램이 완료되면 수동으로 부드럽게 3-5분에 대한 50 ML 원뿔 튜브 흔들어하여 적어도 두 번 씻으 3 솔루션과 함께 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드는 50~10분 들어, 저속 200보다 낮고, RFC에서 centrifuging에 의해 건조하실 수 있습니다. 그것은 빛에 노출 표백 fluorophores을하므로 빛의 슬라이드를 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> 슬라이드가 건조되면 그들은 최적의 결과를 즉시 검사해야합니다, 필요한 경우 그들은 상온에서 건조한 어두운 장소에서 몇 일 동안 저장할 수 있습니다. 슬라이드는 이미지 품질을 눈에 띄게 저하없이 2-3 시간을 스캔하실 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 니어 2 OD 280 비율이 적절히 격리하면 총 RNA 샘플은 OD 260로 매우 깨끗한 스펙트럼을 생산해야합니다. 전혀 감지 단백질이나 페놀 오염이 없어야합니다. 1퍼센트 아가로 오스 젤에서 실행하면, 강력한 tRNA 밴드는 생물 사이 변화 다른 가능한 핵산 밴드 관찰해야합니다. 산화 후 깨끗한 tRNA 밴드가 관찰해야합니다. 샘플 다른 샘플이나 번짐을 관찰보다 눈에 띄게 약한 경우, 샘플은 microarrays에 사용해서는 안됩니다. Microarrays 가장 약한 tRNA 프로브보다 낮은 크기의 순서는 매우 낮은 배경이 있어야합니다. 높은 배경은 일반적으로 세척 단계 도중 문제로 인해 발생합니다. 이것은 일반적으로 신선한 씻어 솔루션을 준비하고 철저하게 잔류하고 시켰던 SDS를 제거하기 위해 모든 장비와 튜브를 세척하여 해결하실 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 세부 </td></tr><tr><td> O - 링 에어컨 </td><td> 75 ° C, 2 분 </td></tr><tr><td> 샘플 소개 </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 변성 샘플 </td><td> 90 ° C, 5 분 </td></tr><tr><td> 이종 교잡 </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> 1 와시 </td><td> 50 ° C, 10 초 흐름은 20 대 시절을 보유 </td></tr><tr><td> 2 와시 </td><td> 42 ° C, 10 초 흐름은 20 대 시절을 보유 </td></tr><tr><td> 3 와​​시 </td><td> 42 ° C, 10 초 흐름은 20 대 시절을 보유 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 하이브리드화 프로토콜

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 동시에 게놈 규모의 모든 tRNAs의 상대적 충전 레벨을 결정하기위한 방법을 제시한다. 여기에 제시 프로토콜은 S.에 최적화된되었습니다 cerevisiae가 있으며, 또한 성공적으로 E.에있는 tRNA 충전 프로파일을 측정하는 데 사용되었습니다 대장균과 인간의 세포 문화. 총 청구 tRNA를 얻을 수 있듯이 이것은 알려진 게놈 시퀀스 (모든 tRNA 유전자의 주석에 대한 허용) 한있는 모든 생물을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Microspin G-25 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 아미노아실-tRNA 합성효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 연결효소</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Hyb4 스테이션</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B 스캐너</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microarrays을 사용하여 trna의 aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA의 aminoacylation, 또는 충전, 레벨 빠르게 환경 [1]에 대한 응답으로 세포 내에서 변경할 수 있습니다. prokaryotic와 진핵 세포 모두에서 수준을 충전 tRNA의 변화는 스트레스 반응의 주요 세포 메커니즘입니다 translational 규제로 이어집니다. 친숙한 예제는 엄격한 응답에<em&gt; E. 대장균</em&gt;와 효모의 Gcn2 스트레스 반응 경로 ([2-6]). 최근 작업<em&gt; E. 대장균</em&gt;과<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;는 tRNA 충전 패턴은 매우 역동적인 것을 표시하고 세포 [1, 6, 7]에 의해 경험 스트레스의 종류에 따라 다릅니다있다. tRNA 충전의 고도로 동적인 변수 자연 완벽하게 환경 변화에 세포 응답을 명료하게하다하기 위하여 게놈 규모 tRNA 충전 수준의 변화를 확인하는 것이 중요합니다. 이 리뷰에서 우리는 동시에 모든 tRNAs의 상대 충전 레벨을 측정하는 방법을 제시<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;. 여기에 제시된 프로토콜이 누룩에 대해이지만,이 프로토콜이 성공적으로 포함하여 생물의 다양한 상대 충전 수준을 결정하기위한 적용되었습니다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 인간 세포 문화 [7, 8].

우리는 모든 tRNAs의 상대 aminoacylation 수준을 결정하기 위해 microarray 분석을위한 방법을 설명<em&gt; S. cerivisiae.</em

Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

tRNA 아미노아실화(aminoacylation) 또는 충전(charging) 수준은 환경에 반응하여 세포 내에서 빠르게 변화할 수 있습니다[1]. ...에서의 tRNA 충전 수준 변화는

다음 실험의 전반적인 목표는 tRNA 충전 수준의 상대적 변화를 결정하는 것입니다. 이는 충전 수준이 유지된 tRNA를 분리하기 위해 처리 전후에 낮은 pH에서 RNA를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, RNA에 과요오드산 산화 처리를 수행하여 상대적인 충전 수준을 결정합니다.다음으로 샘플을 형광 올리고뉴클레오타이드에 연결(ligate)하고 마이크로어레이에서 혼성화(hybridize)하여 A-T-R-N-A 충전 결과에 따른 연결 수준의 변화를 측정합니다. 이는 TRNA 마이크로어레이 기술을 기반으로 한 CHO 게놈 수준의 TRNA 충전 변화입니다. 안녕하세요, 저는 시카고 대학교 생화학 및 분자생물학과의 DRT Pan 교수님 연구실 소속 John Zai입니다.오늘은 게놈 수준에서 충전된 tRNA를 분리하고 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 스트레스 요인 노출 중 tRNA 충전 상태의 변화를 측정하기 위해 이 방법을 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.총 전하를 TRNA로 분리하려면, 먼저 30 OD 600에 해당하는 최소량의 효모 세포를 배양하며, 이는 30 µg의 총 RNA를 생성해야 합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 세포를 펠렛화합니다. 용해 버퍼 용액에 세포를 재부유시킵니다. 동일한 부피의 아세트산 나트륨과 포화 페놀 클로로포름을 첨가하고 30초 동안 볼텍싱한 후, 최소 30초 동안 얼음에 보관합니다.볼텍싱과 파이펫팅을 두 번 더 반복합니다. 시료를 4°C에서 18,600 RFC로 15분 동안 원심분리합니다. 그 다음 수층을 제거하고, 두 번째 추출 이후에 아세테이트 포화 페닐 클로로포름 추출을 한 번 더 수행합니다.2.7배 부피의 에탄올을 첨가하고 4°C에서 18,600 RFC로 30분간 원심분리하여 RNA를 침전시킵니다. RNA 펠렛을 용해 버퍼 용액에 다시 현탁시킨 후, 에탄올로 두 번째 침전을 수행합니다. 마지막으로, 이후 처리를 위해 10 millimolar 완충 아세테이트와 1 millimolar EDTA가 포함된 용액에 RNA를 다시 현탁시킵니다.샘플은 -80 °C에서 약 2주 정도 더 안정적으로 보관할 수 있습니다. 일부 충전된 tRNA가 S3 또는 SCI five 형광 올리고뉴클레오타이드 태그로 표지하기 전에 분해되기 시작하므로 장기 보관은 권장되지 않습니다. 전체 tRNA에 대해 pariah day 산화 처리를 수행하여 상대적인 충전 수준을 결정할 수 있습니다. 전체 RNA를 각 eco irna 표준물질 0.066 µM 및 100 mM 아세테이트 완충액과 혼합하며, 이때 50 mM sodium par IID date를 첨가합니다. 산화시키지 않을 대조군 tRNA 샘플의 경우, sodium par IID date 대신 50 mM sodium chloride를 사용하십시오.실온에서 30분 동안 반응시킨 후, glucose를 첨가하여 최종 농도를 100 millimolar로 맞추어 반응을 중단시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 반응이 중단되면 G 25 spin column을 사용하여 버퍼 교환을 수행함으로써 샘플 내에 남아 있는 sodium prorate를 제거합니다. buffered acetate를 첨가하여 최종 농도를 133 millimolar, sodium chloride를 최종 농도 66 millimolar로 맞추고, 2.7배 부피의 ethanol을 가하여 샘플을 침전시킵니다.다음으로, Resus를 사용하여 tRNA 샘플을 분리하고, 이를 50 millimolar tris HCL에 현탁한 후 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 동일한 부피의 50 millimolar 완충 아세테이트와 100 millimolar sodium chloride를 첨가하여 반응을 중화시키고, 2.7 x 부피의 ethanol로 침전시킵니다. RNA 펠렛을 마이크로리터당 약 1 microgram의 농도로 물에 다시 현탁합니다.아가로스 겔 전기영동으로 대조군과 산화된 시료의 RNA 품질을 확인한 후, tRNA에 형광 올리고 태그를 부착하기 위한 형광 표지를 진행할 수 있습니다. 0.1 µg/µL의 de RNA를 4 µM의 SI 3 또는 SI 5 올리고뉴클레오타이드, 라이게이스 버퍼, 15% DMSO, 0.5 units/µL의 T4 DNA ligase 및 yeast exo phosphatase와 혼합하여 16 °C에서 16시간 이상 배양합니다. 결찰 후, 시료를 4배 부피의 potassium acetate 및 potassium chloride와 혼합한 다음, 동일한 부피의 phenyl chloroform으로 추출합니다. 수성층을 추출한 후, 에탄올로 RNA 조제물을 침전시킵니다. 마지막으로, 하이브리다이제이션 전에 RNA 펠릿을 물에 재현탁하여 약 0.1 µg/µL 농도로 맞춥니다. 결합되지 않은 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위해 마이크로어레이 슬라이드를 증류수로 1~2분 동안 세척합니다.다음으로, S3 또는 SCI 표지 샘플 5개를 최종 농도가 140 µg/mL인 salmon sperm DNA와 최종 농도가 7 µg/mL인 poly A가 포함된 하이브리드화 버퍼 140 µL와 혼합한 후, 자동 어레이 하이브리다이저(automatic array hybridizer)에서 하이브리드화 프로그램을 실행합니다. 수동 하이브리드화는 배경 신호가 높게 나타나므로, tRNA 작업에는 자동 하이브리드화 장치 사용을 강력히 권장합니다. 하이브리드화 프로그램이 완료되면, 슬라이드를 50 mL 원추형 튜브에 넣고 3~5분 동안 부드럽게 흔들어 wash 3 용액으로 수동 세척합니다.알루미늄 호일로 미리 감싼 튜브에서 슬라이드를 최소 2회 세척하십시오. 최적의 결과를 위해 5~10분 동안 저속으로 원심분리하여 슬라이드를 건조하십시오. 슬라이드는 건조 직후에 스캔해야 합니다.슬라이드는 이미지 품질의 눈에 띄는 저하 없이 2~3회 스캔할 수 있으며, 적절하게 분리된 총 RNA 샘플과 그 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 이 샘플은 1% agarose gel에서 전기영동했을 때 단백질이나 페놀 오염이 검출되지 않았으며, OD 260/OD 280 비율이 2에 가까운 매우 깨끗한 스펙트럼을 보입니다. 산화된 샘플과 대조군 샘플 모두 강한 RNA 밴드를 보여야 하며, 그 외에 나타날 수 있는 핵산 밴드는 생물체마다 다를 수 있습니다.샘플이 다른 샘플보다 눈에 띄게 약하거나 스미어링(smearing) 현상이 관찰되는 경우, 해당 샘플은 마이크로어레이에 사용해서는 안 됩니다. 마이크로어레이는 배경 신호가 매우 낮아야 하며, 이는 가장 약한 TRNA 프로브보다 한 자릿수 더 낮아야 합니다. 본 절차를 수행하면서 TRNA를 분리하고 상대적 전하 수준을 결정하는 방법을 방금 보여드렸습니다.특히 산화 및 희석 단계 동안 시약에 뉴클레아제가 포함되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

genome-wide-analysis-aminoacylation-charging-levels-trna-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

출처: Stenum, T. S. 외 대장균에서 전이 RNA의 풍부도와 충전 수준 정량화. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 젤 전기영동과 북부 블롯팅을 사용하여 대 장균 내 전이 RNA의 충전 수준을 아미노아실화 및 탈아실화 형태를 분리하여 검출하고 비교하는 방법을 시연합니다.

젤 전기영동과 북부 블롯팅을 통해 대장균에서 tRNA 충전 수준을 검출합니다

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

프로토콜은 tRNA (UUU)의 생산 및 효소 TcdA와 복합체로 된 tRNA (UUU)의 분석을 아가로 오스 겔 지연 분석법을 통해 제시합니다.

단백질 분석을위한 Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA 기능

여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

우리가 효 모 RNA 수정 효소, Mod5, 생 화 확 적인 특성에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 프로토콜 다른 RNA 수정 효소 적용할 수 토론.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

배우세요 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 마이크로어레이 기술을 이용해 tRNA 아미노아실화 수준을 게놈 단위로 분석하는 방법입니다. 이 기법은 스트레스 조건에서 단백질 합성 효율성을 연구하는 데 활용됩니다.

Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

더 많은 동영상 탐색