Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 tRNA 충전 수준의 상대적 변화를 결정하는 것입니다. 이는 충전 수준이 유지된 tRNA를 분리하기 위해 처리 전후에 낮은 pH에서 RNA를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, RNA에 과요오드산 산화 처리를 수행하여 상대적인 충전 수준을 결정합니다.

다음으로 샘플을 형광 올리고뉴클레오타이드에 연결(ligate)하고 마이크로어레이에서 혼성화(hybridize)하여 A-T-R-N-A 충전 결과에 따른 연결 수준의 변화를 측정합니다. 이는 TRNA 마이크로어레이 기술을 기반으로 한 CHO 게놈 수준의 TRNA 충전 변화입니다. 안녕하세요, 저는 시카고 대학교 생화학 및 분자생물학과의 DRT Pan 교수님 연구실 소속 John Zai입니다.

오늘은 게놈 수준에서 충전된 tRNA를 분리하고 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 스트레스 요인 노출 중 tRNA 충전 상태의 변화를 측정하기 위해 이 방법을 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

총 전하를 TRNA로 분리하려면, 먼저 30 OD 600에 해당하는 최소량의 효모 세포를 배양하며, 이는 30 µg의 총 RNA를 생성해야 합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 세포를 펠렛화합니다. 용해 버퍼 용액에 세포를 재부유시킵니다. 동일한 부피의 아세트산 나트륨과 포화 페놀 클로로포름을 첨가하고 30초 동안 볼텍싱한 후, 최소 30초 동안 얼음에 보관합니다.

볼텍싱과 파이펫팅을 두 번 더 반복합니다. 시료를 4°C에서 18,600 RFC로 15분 동안 원심분리합니다. 그 다음 수층을 제거하고, 두 번째 추출 이후에 아세테이트 포화 페닐 클로로포름 추출을 한 번 더 수행합니다.

2.7배 부피의 에탄올을 첨가하고 4°C에서 18,600 RFC로 30분간 원심분리하여 RNA를 침전시킵니다. RNA 펠렛을 용해 버퍼 용액에 다시 현탁시킨 후, 에탄올로 두 번째 침전을 수행합니다. 마지막으로, 이후 처리를 위해 10 millimolar 완충 아세테이트와 1 millimolar EDTA가 포함된 용액에 RNA를 다시 현탁시킵니다.

샘플은 -80 °C에서 약 2주 정도 더 안정적으로 보관할 수 있습니다. 일부 충전된 tRNA가 S3 또는 SCI five 형광 올리고뉴클레오타이드 태그로 표지하기 전에 분해되기 시작하므로 장기 보관은 권장되지 않습니다. 전체 tRNA에 대해 pariah day 산화 처리를 수행하여 상대적인 충전 수준을 결정할 수 있습니다. 전체 RNA를 각 eco irna 표준물질 0.066 µM 및 100 mM 아세테이트 완충액과 혼합하며, 이때 50 mM sodium par IID date를 첨가합니다. 산화시키지 않을 대조군 tRNA 샘플의 경우, sodium par IID date 대신 50 mM sodium chloride를 사용하십시오.

실온에서 30분 동안 반응시킨 후, glucose를 첨가하여 최종 농도를 100 millimolar로 맞추어 반응을 중단시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 반응이 중단되면 G 25 spin column을 사용하여 버퍼 교환을 수행함으로써 샘플 내에 남아 있는 sodium prorate를 제거합니다. buffered acetate를 첨가하여 최종 농도를 133 millimolar, sodium chloride를 최종 농도 66 millimolar로 맞추고, 2.7배 부피의 ethanol을 가하여 샘플을 침전시킵니다.

다음으로, Resus를 사용하여 tRNA 샘플을 분리하고, 이를 50 millimolar tris HCL에 현탁한 후 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 동일한 부피의 50 millimolar 완충 아세테이트와 100 millimolar sodium chloride를 첨가하여 반응을 중화시키고, 2.7 x 부피의 ethanol로 침전시킵니다. RNA 펠렛을 마이크로리터당 약 1 microgram의 농도로 물에 다시 현탁합니다.

아가로스 겔 전기영동으로 대조군과 산화된 시료의 RNA 품질을 확인한 후, tRNA에 형광 올리고 태그를 부착하기 위한 형광 표지를 진행할 수 있습니다. 0.1 µg/µL의 de RNA를 4 µM의 SI 3 또는 SI 5 올리고뉴클레오타이드, 라이게이스 버퍼, 15% DMSO, 0.5 units/µL의 T4 DNA ligase 및 yeast exo phosphatase와 혼합하여 16 °C에서 16시간 이상 배양합니다. 결찰 후, 시료를 4배 부피의 potassium acetate 및 potassium chloride와 혼합한 다음, 동일한 부피의 phenyl chloroform으로 추출합니다. 수성층을 추출한 후, 에탄올로 RNA 조제물을 침전시킵니다. 마지막으로, 하이브리다이제이션 전에 RNA 펠릿을 물에 재현탁하여 약 0.1 µg/µL 농도로 맞춥니다. 결합되지 않은 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위해 마이크로어레이 슬라이드를 증류수로 1~2분 동안 세척합니다.

다음으로, S3 또는 SCI 표지 샘플 5개를 최종 농도가 140 µg/mL인 salmon sperm DNA와 최종 농도가 7 µg/mL인 poly A가 포함된 하이브리드화 버퍼 140 µL와 혼합한 후, 자동 어레이 하이브리다이저(automatic array hybridizer)에서 하이브리드화 프로그램을 실행합니다. 수동 하이브리드화는 배경 신호가 높게 나타나므로, tRNA 작업에는 자동 하이브리드화 장치 사용을 강력히 권장합니다. 하이브리드화 프로그램이 완료되면, 슬라이드를 50 mL 원추형 튜브에 넣고 3~5분 동안 부드럽게 흔들어 wash 3 용액으로 수동 세척합니다.

알루미늄 호일로 미리 감싼 튜브에서 슬라이드를 최소 2회 세척하십시오. 최적의 결과를 위해 5~10분 동안 저속으로 원심분리하여 슬라이드를 건조하십시오. 슬라이드는 건조 직후에 스캔해야 합니다.

슬라이드는 이미지 품질의 눈에 띄는 저하 없이 2~3회 스캔할 수 있으며, 적절하게 분리된 총 RNA 샘플과 그 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 이 샘플은 1% agarose gel에서 전기영동했을 때 단백질이나 페놀 오염이 검출되지 않았으며, OD 260/OD 280 비율이 2에 가까운 매우 깨끗한 스펙트럼을 보입니다. 산화된 샘플과 대조군 샘플 모두 강한 RNA 밴드를 보여야 하며, 그 외에 나타날 수 있는 핵산 밴드는 생물체마다 다를 수 있습니다.

샘플이 다른 샘플보다 눈에 띄게 약하거나 스미어링(smearing) 현상이 관찰되는 경우, 해당 샘플은 마이크로어레이에 사용해서는 안 됩니다. 마이크로어레이는 배경 신호가 매우 낮아야 하며, 이는 가장 약한 TRNA 프로브보다 한 자릿수 더 낮아야 합니다. 본 절차를 수행하면서 TRNA를 분리하고 상대적 전하 수준을 결정하는 방법을 방금 보여드렸습니다.

특히 산화 및 희석 단계 동안 시약에 뉴클레아제가 포함되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.