Name: 트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 학습하세요 Xenopus laevis에서 정자 핵 분리 및 제한 효소 중재 통합을 이용한 트랜스제닉 생산 방법을. 이 기술은 배아 발달 중 유전자 발현 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 transgenesis 접근 방식의 수정된 버전은 초기에 1과 2에서 설명한되었습니다. A.의 정자 핵 준비 이 핵 준비 방법은 머레이 3에서 적응이지만, 그들이 정자 핵 이식과 계란의 후속 개발과 방해로 프로 테아제 억제제가 생략되었습니다. Aliquots는 -80 ° C에서 냉동하고 약 6 개월 동안 transplantations 사용할 수 있습니다. 모든 솔루션은 준비 사전 준비를 처음으로 얼음에 배치해야합니다. <ol><li> 1-2 성인 남성이 X를 마취 최소한 20 분 Tricaine의 침수에 의해 laevis는 pithing 다음, testes를 제거합니다. </li><li> , 혈액, 혈관과 지방 시신을 제거 1XMMR를 포함하는 60mm 페트리 접시에 잠시 그​​들을 씻고, 그리고 지방 신체의 추가 조각을 제거하기 위해 종이 타월에 testes를 롤. 이것은 정자를 출시 등 소중히 testes를 안됩니다. </li><li> 눈에 띄는 덩어리가 없을 때까지 건조 60 mm 페트리 접시와 포셉와 더운 물에 담가서 부드럽게 testes에 testes를 전송합니다. 물에 담가서 부드럽게 함은 핵의 높은 수율을 얻을만큼 철저하게 가능한 수행하여야한다. </li><li> 더운 물에 담가서 부드럽게하고 부드럽게 위아래로 피펫하고, 2mLs 차가운 핵 준비 버퍼 (1X 주식에서 NPB) 추가합니다. </li><li> 약 4 물총 더운 물에 담가서 부드럽게은 15 ML 튜브 (예 : 팔콘 2059)에 수집, 퍼널에 대한 일종의 투박한 무명의 두께, NPB의 8mLs와 접시를 씻어 이것은 튜브에 수집, 일종의 투박한 무명을 통해 씻어 넣어. 장갑 낀 손이 튜브에 남은 액체를 수집하는 일종의 투박한 무명을 쥐어 짜기로. </li><li> 펠렛 10 분 위해 3000 RPM의 정자. 4 ° 적절한 튜브 어댑터 스윙 버킷 회전자 (Sorvall HB - 4 로터 또는 동급의 예 1천4백80g)에서 C. 가만히 따르다 뜨는,이 튜브에 추가할 8mL NPB와 resuspend 펠렛에 10 ML의 피펫과 위쪽 및 아래쪽 피펫, 위에 가만히 따르다 뜨는로 다시 스핀 다운. 스핀 동안 실내 온도에 NPB의 1mL를 평형. </li><li> 1 ML pipetteman 팁을 사용하여 1mL 실내 온도 NPB에 Resuspend 펠렛은, 갓 만들어진 10mg/mL lysolecithin의 50μl 추가 부드럽게 믹스, 5 분 알을 품다. 상온에서. </li><li> , lysolecithin 반응을 중지 부드럽게 혼합하고, 스윙 버킷 로터에서 3000 RPM 10 분 스핀 다운로 튜브 10 ML 추운 1XNPB 3%의 BSA를 추가합니다. 가만히 따르다의 뜨는. lysolecithin - 처리 펠렛은 약간 더 반투명 보일 것입니다 (이하 불투명 흰색)은 이전 lysolecithin 치료 한 것보다. </li><li> 가만히 따르다 뜨는 5 ML 차가운 NPB 0.3 % BSA에 resuspend 펠렛은 10 ML의 피펫과 함께 부드럽게 혼합 이상으로 3000rpm에서 10 분 스핀 다운. </li><li> 정자 저장 버퍼와 1.5 ML 튜브로 전송 500μl에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 펠릿. 이것은 지금 핵 재고입니다. 이 핵의 수율을 확인하는 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 장소, 정자 희석 버퍼 (SDB), 원자력 주식과 1.5mL Eppendorf 튜브에 Hoechst 주식의 1:100 희석의 1μl 1 μl의 98 μl를 핵의 수율을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 단지 1 μl를 제거하기 전에 면도기 - 잘린 (또는 큰 오프닝) 피펫 팁을 사용하여 잘 핵 주식을 섞는다. 잘 희석 SDB / Hoechst / 핵 믹스와 모세관 작용에 의해 향상 노이 바 우어의 hemacytometer 상공 회의소에 흐름에 소량을 허용합니다. 복합 현미경 hemacytometer의 광장에서 핵을 계산합니다. 남자 한에서 당신은 1 - 2X10 5 셀 / μl의 undiluted 주식 농도에 대한 주식의 1:100 희석에 대한 최소한의 건의 100-200 (X10 4 셀 / ML)를 취득해야합니다. 당신의 주식이 덜 집중하면, 핵은 몇 시간 동안 정착 뜨는의 일부를 제거하고 재계산 보자. 4 핵 남겨 ° C 글리세롤 잘 cryopreservation에 대한 침투 수 있도록 숙박, 다음, 큰 구멍 피펫 팁 잘 핵 주식을 섞어 20μl aliquots를 준비하고, 액체 질소로 동결. </li></ol> 고속 추출의 B. 준비 이 방법은 머리 3에서 적응하고 추가 정자 핵의 붓기와 일부 염색질의 decondensation을 추진합니다 계면 cytosolic 추출물을 생산하고 있습니다. 추출은 -80 ° C에서 작은 aliquots에 냉동과 해동 사용하기 전에 수 있습니다. <ol><li> HCG 주사, 주요 8-12 성인 여성 X.하기 전에 3-5일 지느러미 임파선 색에 PMSG 50 U를 주사하여 laevis. 추출 준비 전에 저녁 2리터의 1XMMR에 500 단위 HCG 및 장소 2 개구리 / 용기 각 개구리를 삽입. 계란 lysing 또는 활성화 한 개구리는 추출 준비를 손상 수 있기 때문에 배란을위한 쌍에 개구리를 분리하는 것이 좋습니다. </li><li> 다음날 아침, 준비하고 준비를 시작하기 전에 모든 솔루션을 진정. 부드럽게, 수동으로 각각의 개구리에서 큰 B에 달걀을 추방1X MMR을 포함 eakers. 각 컨테이너에서 달걀을 화면과 절차에서 mottling, lysing 또는 활성화의 흔적 (동물 반구에 착색의 수축에 의해 시각)로 달걀의 배치를 생략하면됩니다. 심지어 착색과 끊어지지 않는 계란을 수집합니다. 좋은 계란도 개구리 양동이에 1X MMR에서 수집한 수 있습니다. 계란의 총 볼륨 8-12 여성에서&gt; 100 ML해야합니다. </li><li> 데 - 젤리 계란. 이렇게하려면, 가능한 한 많은 MMR을 제거 시스테인 솔루션의 작은 금액을 추가하고, 소용돌이 계란. 신선한 시스테인 솔루션 드 jellying 동안 여러 번 교체합니다. 데 - 젤리는 각 개별적으로 계란의 배치 및 파손 또는 달걀 활성화와 일괄 폐기하십시오. 계란의 나머지 부분을 결합합니다. </li><li> 단백 분해 효소 억제제와 계란에게 추출 버퍼 (XB)의 ~ 35 ML에 네 번, 그리고 CSF - XB의 25 ML에 두 번 씻으십시오. </li><li> 계란 팩 : 베크맨 ultraclear 튜브에 계란을 전송합니다. 계란 정착하도록 허용합니다. 가능한 CSF - XB만큼을 제거합니다. 4 ~ 60 초 1,000 RPM (150g)에 베크맨 SW 40 티 로터 (또는 유사한 로터)를 사용하여 계란 ° C.를 원심 분리기 포장 계란의 상단에서 여분의 솔루션을 제거합니다. </li><li> 달걀을 호감과 세포질 추출물을 생성하려면 : 4 10 분 10,000 RPM (1만6천g) ° C.에 달걀을 원심 분리기 계란은 세 층으로 분리한다 : 지방질 (위), 세포질 (가운데)과 난황 (아래). 세포질 레이어의 기지에있는 튜브를 통해 바늘을 삽입하여 18 게이지 바늘로 각각의 튜브에서 세포질 레이어를 수집합니다. 얼음에 신선한 ultraclear 베크맨 튜브에 세포질을 전송합니다. </li><li> 1X의 최종 농도에 격리 세포질로 프로 테아제 억제제를 추가합니다. 4 10 분 16,000g에서 세포질을 Recentrifuge ° C. 위에 설명된대로 명확히 세포질를 수집합니다. 0.75-1 ML의 세포질 / 개구리를 얻을 것으로 기대합니다. </li><li> 샘플 에너지 믹스의 추출 볼륨의 20분의 1 추가합니다. 베크맨 TL - 100 초원 심 분리기를위한 두꺼운 벽의 폴리 카보 네이트 튜브에 세포질을 전송합니다. 튜브 3 ML 각에 대한 보유 및 전체 최소 절반해야합니다. </li><li> 0.4 mm의 최종 농도 각 관 1 M CaCl 2를 추가합니다. 실온에서 15 분위한 튜브를 품어. 이것은 CSF를 inactivates 및 계면에 압축을 풉니다들을 못살게 굴지. </li><li> 튜브의 균형 4 1.5 H 위해 70,000 RPM (20만g)에 TLA - 100.3 로터를 사용하여 베크맨 TL - 100 초원 심 분리기 ° C. 그들을 원심 분리기 세포질은 위에서 아래로, 넷 레이어로 분류됩니다 : 지질, cytosol, 멤브레인 / mitochondria 및 글리코겐 / 리보솜. </li><li> 지질 층을 통해 튜브의 상단에 주사기를 삽입하여 각각의 튜브 (~ 1 ML 2-3 ML이 튜브에 로드된 경우)에서 cytosolic 레이어를 제거합니다. 새로운 튜브에 cytosolic 분수를 전송 4 20 분 70,000 RPM (20만그램) ° C.에서 샘플을 recentrifuge </li><li> 0.5 - ML 튜브에 25 μl aliquots에 뜨는 나누어지는. 사용하기 전까지 -80에서 액체 질소 및 저장 ° C에서 aliquots을 급속 냉동하다. 추출물이 효과적인지 여부를 확인하려면, 정자 핵을 추출에 incubated과 핵이 가시 실온에서뿐만 아니라 10 분 이내에 (진하게하고 길이) 팽창 여부를 확인하는 Hoechst 물들일 수 있습니다. </li></ol> C.의 Transgenesis 반응과 핵 전송 중요 : 솔루션, 장비 및 개구리가 반응을 시작하기 전에 모든 준비가되어 있는지 확인합니다. 많은 구성 요소가&gt; 30 분 동안 안정적으로 유지하지 않기 때문에 일단 시작, 당신은 아래에서 설명하는 대략적인 시간표를 사용하여 반응을 진행해야합니다. 정자의 핵 재고가 얼음에 보관하는 동안 transgenesis 반응은 (희석 및 농축 모두) 상온에서 보관해야합니다. <ol><li> 프라임 여성 개구리. transgenesis 전에 저녁, 다음날 처음 갓 낳은 달걀을 얻기 위해 등의 임파선 색의 HCG 800 단위로 몇 가지 (3-5) 성인 여성의 개구리를 삽입. </li><li> transgenesis 절차의 하루, 준비 또는 온도 transgenesis에 필요한 솔루션을 가져다 : <ol class="lalpha"><li> 갓 만들어진 시스테인 (1XMMR, pH8.0에서 2.5 %). 당신이 그날 사용할 수 수백 밀리리터가 필요합니다. </li><li> 이식 요리와 유전자 변형 배아와 0.2XMMR 배아를 양육을위한 100 μg / ML gentamicin (Ficoll 제외)의 복구에 0.2XMMR 6퍼센트의 Ficoll. 솔루션 ° C 높은 온도 때문에 부정적인 transgenesis 및 배아 발달의 두 주파수에 영향을 미칠 ° C와 유전자 변형 배아가 16과 21 사이의 온도에서 초기 cleavages을 통해 제기되어야 18-21보다 따뜻한해서는 안됩니다. </li><li> 해동과 하루 transplantations에 대한 SDB의 실내 온도 냉동 aliquots (정자 희석 버퍼)에 평형, 얼음 고속 추출하고 장소를 해동하고, 100mM MgCl 2 솔루션을 준비합니다. </li><li> 일 나가E 아가로 오스 분사 요리와 MMR / Ficoll 솔루션을 작성하고, 설정하고 흐름을 안정화하기 위해 주입 펌프를 미리 실행합니다. </li><li> 여성 개구리가 누워 있고 계란은 양질의 것을 확인하십시오. 최적 달걀 (드 jellying 후 형태를​​ 잡아) 회사 피질이 있어야합니다. </li></ol></li><li> transgenesis 반응을 설정합니다 : <ol class="lalpha"><li> 아주 부드럽게 (잘린 피펫 팁을 사용하여) 핵의 주식을 혼합하고 1.5mL Eppendorf 튜브에 결합 : 4μl 핵 (~ 4 - 8X10 5 핵) 2μl은 선형 플라스미드 (100ng/μl) 실온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 부화가 진행되는 동안, 4.5μl H 2 O의 제한 효소 0.5μl을 희석하고 SDB의 18μl, MgCl 2 2μl 및 고속 추출물의 2μl에 희석 효소 1μl를 추가합니다. 핵 - 플라스미드 반응이 혼합물을 추가합니다. 핵 팽창 10 분 더 품어. </li><li> 이 부화하는 동안, 시스테인 용액에 2-3 개구리와 드 젤리에서 계란을 짠다. 1XMMR와 함께 (5 배) 잘 씻으십시오, 그리고 0.2X MMR 4%의 Ficoll을 포함하는 각각의 아가로 오스 잘 접시에 400-500 dejellied 달걀을 전송하는 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 이것은 보통 10 분 정도, 그래서 한 계란 요리는 일반적으로 희석 준비가 반응을 준비하고 있습니다 걸립니다. </li><li> 약 15-20분 단계를 시작 후, 부드럽게 잘린 팁과 반응 (핵 / 추출 / DNA)를 혼합하고 실온에서 150 5μl에 대한 μl SDB를 추가합니다. 농축 혼합물에 남아있는 때 그들이 한 이식 용량을 유지하지 반해이 희석 혼합의 핵은 1 시간에 대해서.위한 안정됩니다. </li></ol></li><li> 바늘로드 : 다양한 오리피스 피펫 팁 매우 부드럽게 위에서 준비한 희석 반응을 혼합 후 핵이 튜브에 빠르게 정착하므로 즉시 바늘을로드합니다. backload 바늘하려면, 잘린 200μl 피펫 팁의 끝 부분에 미세 Tygon 튜빙의 한 조각을 넣으십시오. 피펫 팁에 솔루션을 그려 후 바늘에 튜브를 장착하고 솔루션은 중력에 의해 바늘을 입력 허용하거나 부드럽게 피펫 플런저를 우울. </li><li> 튜빙을 펌프와 핵의 transplantations를 시작 바늘을 연결합니다. 주사 피해 일을 피하기 위해 계란의 플라즈마 막 약 수직 빠른 얕은하고 있어야합니다. 흐름 추천 (10nl/sec)의 속도로 ~ 0.5 초 동안 계란에서 바늘을 유지. 당신은 20~30분 이내 transplantations 1-2 요리를 완료해야합니다. </li></ol> 배아는 세포 4-8 단계에 도달하기 전까지 주사 후 16-20 ° C에서 요리를 두십시오. 0.2XMMR 4%의 Ficoll의 새로운 큰 접시에 (팁 달걀로 거의 동일한 직경을 가진 유리 파스퇴르 피펫)를 전송하여 거리에 자신의 비 - cleaving 이웃에서 cleaving 배아를 정렬하십시오. 작은 단체 (/ 물론 6 자 접시의 10-15 배아)과 0.2XMMR 문화 (NO Ficoll) 조기 개발을 통해 100 μg / ML의 gentamicin에 cleaving 배아를 분할. 모든 죽어가는 태아가 신속하게 제거하고 변경된 미디어가 필요에 따라 함께 태아도 gastrulation 동안 확인하​​여야한다. 문제 해결 : <ol><li> 니들이 차단됩니다 바늘에서 솔루션 흐름 transplantations 동안 분명해야합니다. 바늘이 보이는 미립 물질에 의해 차단되면, 바늘을 변경하거나 포셉와 팁을 클리핑하고 바늘을 통해 솔루션을 추진하여 파편을 제거하려고합니다. </li><li> 아무 cleaving 계란도 얻을 수있다 : 정자의 핵 및 사출 량의 dilutions 적절하고 바늘이 이식하는 동안 차단되지 않았음을 확인하십시오. 사출 볼륨이 너무 높은 경우에는, 계란은 변색 착색이나 손상을 표시하는 대신 분열도하지 않을 수 있으며. </li><li> 많은 배아는 gastrulation 동안 죽어. 여러 가지 요인이 배아의 생존을 향상시킬 수 있습니다 : <ol><li> 준비하는 동안 핵 및 효소 반응과 함께 돌봐. Decondensed 핵이되기 쉽고 위의 시간표를 사용하여 이식해야합니다. 얼음에 그들을 올려 놓지 마십시오. </li><li> 효소 반응과 핵 전송하는 동안 정자의 핵에 의해 지속적인 염색체 손상이 transgenesis의 빈도와 태아의 정상적인 발달을 모두 영향을 미칩니다. 핵에 염색체 손상 transgenesis의 효율성을 향상하지만, 부정적인 생존 / 정상 발달에 영향을 미칩니다. 감소 또는 효소 배양하는 동안 제한 효소를 생략하는 것은 정상적인 발전의 속도를 향상시킬 수 있지만 transgenesis 또는 배아의 게놈에 도입 플라스미드 사본 번호 빈도를 감소 수 있습니다. </li><li> gastrula의 배아를 통해 후반 blastula이 변색 또는 세포 사망의 징후를 보여주면 그것은 transplantations에 사용되는 시약은 계란에 독성 것을 수도 있습니다. 또한, 경우 계란S는 회사의 피질이없는 그들은 exogastrulation를 받아야하고 정상 사후 gastrula의 배아를 생성하지 못할 수 있습니다. </li></ol></li><li> transgene을 표현하는 배아의 수는 적습니다. 제한 효소의 양을 늘립니다. </li></ol> 대표 트렌스 제닉 엠브료 결과 <img src="/files/ftp_upload/2010/2010fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 관심의 발기인의 표현을 볼 때까지 핵 전송으로 인한 유전자 변형 배아가 제기되어야합니다. 위의 그림 1에서 근육 굴지업자는이 유전자 변형 올챙이의 somites에 녹색 형광 단백질의 표현을시킵니다.

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동물 실험 동물 관리에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행과 의과 워싱턴 대학 학교위원회를 사용했다.

각 형질 구성을 테스트하기 위해서, 우리는 일반적으로 500-1000 계란으로 핵 이식,이 규모에서, 우리는 알을 낳기 위해 유도 얼마나 많은 암컷에 따라 하루에 10 가지 다른 구조까지 표현 형질 배아를 생성할 수 있습니다. 이러한 transplantations의 계란 클리브 중 하나에 대한 세 번째이 cleaving 배아의 60~80%가 정상적으로 gastrulation을 통해 진행합니다. 이 배아의 10-50% 사이에 사용하는 반응 조건에 따라하는 것이 관심의 transgene을 표현. 한 노동자가 하루에 여러 plasmids의 숫자를 표현하는 유전자 변형 배아의 인구를 만들 수 있도록 그러므로, 일단이 절차가 실험실에서 설립, 그것이 가능합니다. Transgenes가 concatemer (5-35 부)으로 게놈에 통합이 방법은 또한 높은 주파수 (80~90%) 4에서 단일 배아의 게놈에 하나 이상의 다른 transgene을 cointegrate하는 데 사용할 수 있도록. <p class="jo...

A.의 정자 핵 준비 시약 : <ol><li> 1X MMR (2mM CaCl 2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl 2, 100mM NaCl). </li><li> 0.1 % Tricaine Methanesulfonate (MS222, 아미노 벤 초산 에틸 에스테르, 시그마 A - 5040), 0.1 %의 나트륨 중탄산염. 물에 용해. </li><li> 2X 원자력 준비 버터 (NPB). 정자의 핵 준비 당일, 냉동 보관 주식 솔루션 aliquots에서 2X NPB 30 ML을 만들어 : 500 MM의 자당 (1.5 M 재고), 30 MM HEPES (1M 주식, 코로 적정하다 그 산도 7.7이있는 그래서 15 ㎜), 1 ㎜의 spermidine의 trihydrochloride (시그마 S - 2501, 10 MM 재고), 0.4 MM spermine의 tetrahydrochloride (시그마 S - 1141, 10 MM 재고), 2 MM dithiothreitol (시그마 D - 0632, 100 MM 재고), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0). </li><li> A. 만드는 2XNPB를 사용하여 30ml 1X NPB, B. 10ml 1XNPB 3퍼센트 BSA (분수 V, 시그마 A - 7906), C. 5ml 1XNPB 0.3 %의 BSA. </li><li> Lysolecithin : 10 MG / ML L - α - 리소 - 레시틴, 계란 노른자 (Calbiochem, 440,154) 100 μl은, 그냥 사용하기 전에 실온에서 디졸브. 20 스토어 확실한 재고 ° C. 그것이 끈적이된다면 주식 가루를 폐기하십시오. </li><li> 소 혈청 알부민 (BSA) : 10 % (W / V) BSA는 (분수 V, 시그마 A - 7906) 정자의 핵 준비 당일 물 5 ML을 확인합니다. </li><li> 정자 저장 버퍼 (1ml) 1X NPB, 30 % 글리세롤, 0.3 % BSA. </li><li> 정자 희석 버퍼 : 250 MM의 자당 75 MM KCl, 0.5 당연 spermidine의 trihydrochloride 0.2 MM spermine의 tetrahydrochloride. 20 산도 7.3-7.5하고 저장 0.5-1 ML의 aliquots로 적정하다 ° C. </li><li> Hoechst 번호 33342 (시그마 B - 2261) : DH 2 O 10 MG / ML 주식, 20 가벼운 꽉 용기에 저장 ° C. </li></ol> 장비 : <ul><li> 스윙잉 버킷 로터와 원심 분리기 </li><li> 일종의 투박한 무명 </li><li> 해부 도구 (집게와 가위) </li><li> 형광 현미경 </li><li> 깔때기 </li><li> 장갑 </li><li> hemocytometer </li><li> 바늘 (26 게이지) </li><li> 종이 타올 </li><li> 배양 접시 (60 ㎜) </li><li> pipettes </li><li> 플라스틱 (5 및 10 ML) </li><li> Pipetman 팁 (1 ML 및 200μl) </li><li> 주사기 (1 ML) </li><li> 튜브 (14 ML, 팔콘, 2059) </li><li> 튜브 </li><li> microcentrifuge (1.5 ML) </li></ul> 고속 추출의 B. 준비 시약 : <ol><li> 1X 마크의 수정 링어 (MMR) : 100 MM NaCl, 2 MM KCl, 1 MgCl MM 2, 2 MM CaCl 2, 5 MM HEPES, pH를 7.5. 10X 재고를 준비하고, NaOH와 7.5 산도를 조정합니다. </li><li> 20X 추출 버퍼 (XB) 소금 재고 : 2 M KCl, 20 MM MgCl 2, 2 MM CaCl 2, 필터 소독 4 및 저장 ° C. </li><li> 필터 소독하고, aliquots에 저장, 15 mm까지 희석하면 있도록 산도는 7.7이다 코와 titrated 1X XB 소금, 50 MM의 자당, 10mM의 HEPES (1 M 재고,; 버퍼를 (신선한 얼음에 저장된 XB) 추출 20 ° C). 100 ML에 대한 준비. </li><li> 2퍼센트 (W / V) 1 - L - 시스테인 수화물 하이드로 클로라이드는 사용하기 전에 1X XB 소금에 만들어 NaOH로 pH의 7.8에 titrated. 300 ML에 대한 준비. </li><li> CSF - XB : 1X XB 소금, 1 MM MgCl 2 (XB 소금 2 선물을 MgCl 이외에, 최종 농도 2 ㎜), 10 MM의 HEPES, 산도 7.7, 50 MM의 자당, 5 MM EGTA, pH를 7.7. 50 ML을 준비합니다. </li><li> 단백 분해 효소 억제제 : 류펩틴, chymostatin 및 pepstatin, 10 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 MG / ML의 최종 농도로 녹아 각각의 혼합. 20 작은 aliquots에 저장 ° C. </li><li> 1 M CaCl 2. </li><li> 에너지 믹스 : 150 MM의 크레아틴 인산, 20 MM ATP, 20 MM MgCl 2. </li><li> 임산부 마레 세럼 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG) : 100 U / ML PMSG (PG600 ®, 인터 ​​베트 (주), 021825). 물에 용해하고 20 ° C.에 저장된 </li><li> 인간 Chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (HCG) : (CHORULON ®, 인터 ​​베트 (주), 057,176) 1,000 U / ML HCG. 물에 용해 4 ° C.에 저장된 </li></ol> 장비 : <ul><li> Xenopus laevis 여성 </li><li> 바늘 (18, 26 게이지) </li><li> 파스퇴르 피펫 </li><li> 넓은 구멍 </li><li> 주사기 (1 ML) </li><li> 튜브, microcentrifuge (0.5 ML) </li><li> 튜브, 두꺼운 벽 폴리 카보 네이트 (베크 349622) </li><li> 튜브, ultraclear (14 X 95mm, 베크만, 344,060) </li><li> 초원 심 분리기 및 로터 (예, 로터 SW 40 티 및 TLA - 100.3로 베크맨 TL - 100) </li><li> 계란 수집 비커 </li><li> 버킷 또는 여성 개구리 (예 : 메쉬 뚜껑 4 개, L, 플라스틱 비커) 개최를위한 용기. </li></ul> C. 핵 이식. 시약 : <ol><li> 0.1XMMR에서 2.5 % 아가로 오스 (사출 요리를 만들기위한) </li><li> 1XMMR에서 2.5 %의 시스테인사용 당일 준비 pH8.0, </li><li> Ficoll </li><li> 10 MG / ML gentamycin (1000X 주식) </li><li> 고속 계란 추출물 (위 참조) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> 10X MMR (위 참조) </li><li> 제한 효소 (뉴잉글랜드 Biolabs에서 예 노티) </li><li> 정자 희석 버퍼 (SDB, 위 참조)와 정자의 핵은 (위 참조) </li><li> 인간 Chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (HCG) 위와 같이 </li><li> 미네랄 오일 (시그마, M8410) </li><li> transgene로 소개하는 플라스미드 선형 :의 농도에 선형 플라스미드 준비 약 100 무균의 NG / μl, nuclease없는 물 (우리가 트리스와 태아에게 어느 정도 독성이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) -이 포함된 버퍼를 피하기). 플라스미드를 linearize하는 데 사용되는 제한 효소는 핵 이동 반응에 사용되는 것과 동일하게 할 필요는 없습니다. 우리는 보통 관계로 선형이다 플라스미드 무엇, 모든 반응에 대한 노티를 사용합니다. 반응에 사용되는 효소 희석의 일부 교정이 필요할 수 있습니다 같은 너무 많은 효소가 이후 gastrula 개발에 악영향을 일으킬 수 있습니다. 플라스미드는 여러 가지 방법으로 정화 수있다 : 우리는 일반적으로 제조 업체의 지시에 따라 Qiagen PCR Qiaquick 정화 키트를 사용하여, 젤에서 단일 밴드의 정화가 필요하지 않습니다. 플라스미드면하는 것은 페놀 / 클로로포름 extractions 및 에탄올 석출, 유기물 및 에탄올의 모든 흔적을 제거하는 특정 수를 사용하여 정화됩니다. </li></ol> 장비 : 주사 아가로 오스 요리 : 60mm 플라스틱 배양 접시에있는, 작은 35mmX35mm은 달걀로 작성을위한 아가로 오스 - 코팅 바닥과 우울증을 만드는 물 0.1XMMR에서 용융 2.5 % 아가로 오스에 보트를 무게하다. 4 일단 아가로 오스가 가득 찼어, parafilm에 싸서 보관 ° C까지 사용. 당신이 할 계획이 각 유전자 변형 반응에 대해 사전에 2-3 요리를합니다. 주입 펌프 : 우리는 미네랄 오일로 가득 3 CC 주사기 / 바늘을 갖춘 하버드 장치에서 하나의 주사기 주입 펌프를, (시그마 M - 8410)을 사용합니다. 주사기 바늘 팁 (튜빙을 perforating에서 계속) 블런트와 미세 tygon 튜빙을 연결합니다. ~ 10nl/sec에서 펌프를 실행, 이것은 바늘 각 계란에 시간이 더 이상 1 초 수 없습니다 것으로 가정합니다. 펌프 전에 주사기를위한 플런저는 튜브가 발생 밖으로 피스톤과 오일의 지속적인 긍정적인 흐름을 잔뜩 것을 보증하기 위해 하루 시작 transgenesis 몇 분 동안 미리 실행되어야합니다. 핵 전송을위한 바늘. micropipette의 풀러를 사용하여 길이, 경사 도움말 바늘을 생성합니다. beveled 모양 ~ 80 미크론의 열기를 얻기 위해 눈 마이크로 미터가 장착된 해부 현미경 forcep과 함께 이것을 클립. 기타 설비 : Xenopus laevis 여성, stereomicroscope, 보육, micromanipulator, microinjection 니들 풀러 (예 : 모델 P - 87, 셔터), 주사기 바늘 (26 게이지), 유리 microinjection의 바늘, 80μm 직경 microinjection 니들 팁 보정 클리핑을위한 눈의 마이크로 미터, 배양 접시는 보트 35mm, Tygon 튜빙을 (ID = 32분의 1 최후 통첩 OD = 3 / 32인치) 무게

트렌스 제닉 생산 xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Xenopus 게놈에 복제된 유전자 제품의 안정적인 통합은 배아 발달의 나중 단계에서 유전자를 표현하고, 그때와 발기인은 배아 내에서 유전자 발현을 조절하는 방법 정의, 표현의 시간과 장소를 제어하는 것이 필요합니다. 프로토콜 여기서 보여주는 효율적으로 유전자 변형 Xenopus laevis의 배아를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 1 :이 transgenesis 방식은 세 부분을 포함한다. 정자의 핵은 성인 X.으로부터 격리 아르 정자 플라즈마 막을 permeabilizes lysolecithin와 치료에 의해 ​​laevis의 testis. 2. 에그 추출물은 저속 원심 분리, 세포주기의 계면으로 진행하기 위해 추출을 일으킬뿐만 아니라 칼슘과 계면 cytosol를 분리하기 위해 고속 원심 분리에 의해 준비가되어 있습니다. 3. 핵 이식 : 핵 및 추출물은 transgene 및 제한 효소의 작은 금액으로 소개하는 선형 플라스미드 DNA와 결합하고 있습니다. 짧은 반응 동안, 달걀 추출물은 부분적으로 정자 염색질을 decondenses하고 제한 효소는 게놈에 transgene의 재조합을 촉진 염색체 휴식을 생성합니다. 취급 정자 핵은 다음 unfertilized 계란으로 이식하고 있습니다. transgene의 통합은 일반적으로 이전 결과 배아는 키메라하지 않는 등 처음 배아 절단을 발생합니다. 이 배아는 발기인 및 유전자 기능 분석을위한 유전자 변형 배아의 효과적이고 신속한 세대 수 있도록, 다음 세대 번식을 필요로하지 않고 분석할 수 있습니다. 성인 X. 이 절차로 인한 laevis 또한 germline 통해 transgene을 전파하고 여러 목적을 위해 유전자 변형 동물의 라인을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비디오 프로토콜은 유전자 변형을 생성하는 방법을 보여줍니다<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; unfertilized 계란으로 핵 이식 뒤에 정자 핵에 transgenes의 소개로.

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

클론된 유전자 생성물을 Xenopus 게놈에 안정적으로 통합하는 것은 발현 시점과 위치를 제어하고, 배아 발달 후기 단계에서 유전자를 발현시키며, 인핸서와 프로모터가 배아 내 유전자 발현을 조절하는 방식을 정의하는 데 필요합니다. 본 프로토콜은 형질전환 Xenopus laevis 배아를 효율적으로 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 형질전환 접근 방식은 세 단계로 구성됩니다. 1. 정자 세포막을 투과성으로 만드는 lysolecithin 처리를 통해 성체 X. laevis 정소에서 정자 핵을 분리합니다. 2. 저속 원심분리를 통해 난자 추출물을 준비하고, 칼슘을 첨가하여 추출물이 세포 주기 간기로 진입하게 한 뒤, 고속 원심분리를 통해 간기 세포질을 분리합니다. 3. 핵 이식: 분리된 핵과 추출물을 형질전환 유전자로 도입될 선형화된 플라스미드 DNA 및 소량의 제한 효소와 혼합합니다. 짧은 반응 시간 동안 난자 추출물은 정자 염색질을 부분적으로 탈응축시키고, 제한 효소는 게놈 내로의 형질전환 유전자 재조합을 촉진하는 염색체 절단을 생성합니다. 처리된 정자 핵은 이후 미수정 난자에 이식됩니다. 형질전환 유전자의 통합은 보통 배아의 첫 번째 난할 이전에 일어나므로, 결과물인 배아는 키메라가 아닙니다. 이 배아들은 다음 세대로 교배할 필요 없이 분석할 수 있어, 프로모터 및 유전자 기능 분석을 위한 형질전환 배아를 효율적이고 빠르게 생성할 수 있습니다. 이 과정을 통해 생성된 성체 X. laevis 또한 생식선을 통해 형질전환 유전자를 전달하므로, 다양한 목적의 형질전환 동물 라인을 구축하는 데 사용할 수 있습니다.

Xenopus 배아 발달 과정 중의 유전자 발현을 연구하기 위해서는 클로닝된 유전자 산물이 게놈 내에 안정적으로 통합되어야 합니다. 먼저 성체 개구리 고환에서 정자 핵을 분리하고 투과화합니다. 그다음 Xenopus 난자로부터 간기 세포질 추출물을 준비합니다.정자 핵과 난자 추출물을 선형화된 트랜스제닉 DNA 및 제한 효소와 혼합합니다. 이 단계에서 난자 추출물은 정자 염색질의 응축을 해제하며, 동시에 제한 효소는 트랜스진의 통합을 촉진합니다. 마지막으로, 처리된 핵을 미수정란으로 이식합니다.결과물인 배아의 각 세포는 형질전환 유전자를 보유하게 되며, 프로모터 의존적인 형질전환 유전자의 발현은 면역형광현미경 또는 다른 방법으로 검출됩니다. DNA 주입과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은, 결과물인 배아가 첫 번째 난할 전에 형질전환 유전자의 통합을 거친다는 점입니다. 이는 결과물인 배아가 키메라가 아님을 의미하며, 따라서 별도의 교배 과정이 필요하지 않습니다.본 프로토콜을 사용하면 단 몇 시간 만에 다수의 형질전환 배아를 빠르고 효율적으로 생성할 수 있습니다. 이러한 형질전환 배아는 프로모터나 유전자 기능을 분석하는 데 사용하거나, 교배를 통해 형질전환 라인을 구축하는 데 사용할 수 있습니다. 이 과정의 첫 단계로, 희생시킨 개구리 한두 마리의 정소를 건조한 60 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 눈에 보이는 덩어리가 없을 때까지 정소를 으깹니다.2 mL의 차가운 핵 준비 버퍼(nuclear preparation buffer, NPB)를 분쇄물에 첨가하고 피펫으로 부드럽게 섞어준 뒤, 분쇄물을 약 4겹의 치즈클로스로 거름망에 걸러 깔때기를 통해 15 mL 튜브에 여과액을 수집합니다. 그다음 접시를 8 mL의 NPB로 헹구고 치즈클로스를 통해 튜브로 여과합니다. 이 용액에는 장갑을 낀 손으로 다룬 정자가 포함되어 있습니다.치즈클로스를 짜서 남은 액체를 모은 다음, 4°C에서 10분 동안 튜브를 원심분리하여 정자를 침전시키고, 원심분리 후 상층액을 따라냅니다. 그런 다음 8 mL의 NPB를 첨가하고 피펫팅하여 펠렛을 재현탁합니다. 다시 원심분리하며, 원심분리하는 동안 1 mL의 NPB를 실온으로 맞춥니다.원심분리 후, 펠렛을 1 mL의 NPB에 다시 현탁하고 10 mg/mL 농도의 갓 제조된 lysolecithin 50 µL를 첨가하여 정자 세포막을 투과성으로 만듭니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

핵 막 어셈블리는 세포 분열주기에서 중요한 단계이며이 과정은 Xenopus의 정자 염색질, cytosol, 가벼운 멤브레인 분수를 결합하여 시험관에서 복제하실 수 있습니다. 완료 핵은 기공 단지와 함께 핵 세포막을 포함하여 형성하고, 이러한 재구성 핵 정상 핵 프로세스의 수입니다.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

Xenopus의 사이에 얼굴 조직을 "극단적 인 전방 도메인"이식에 대한 기술은 배아가 개발 한 laevis의. 조직은 두개 안면 개발 및 얼굴 영역 사이의 상호 작용을 신호에 대한 지역의 요구 사항의 연구를 허용, 또 다른 한개로 1 유전자 발현 배경에서 이동할 수 있습니다.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

세포의 해출 및 이식과 같은 배아 조작은 초기 발달을 연구하기 위한 중요한 도구입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 이러한 조작을 수행하기 위해 간단하고 효과적인 이식 장치를 설명합니다.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

학습하세요 Xenopus laevis에서 정자 핵 분리 및 제한 효소 중재 통합을 이용한 트랜스제닉 생산 방법을. 이 기술은 배아 발달 중 유전자 발현 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

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