면역형광 분석법: 의료용 와이어에 포획된 종양 세포를 식별하는 방법

- 관심 항체와 결합 된 하이드로 겔로 코팅 된 작은 금 부분이있는 기능화 된 와이어를 예로 들어 보겠습니다. 와이어의 금 부분을 종양 세포가 들어 있는 바이알에 담그십시오. 와이어 스토퍼로 닫고 튜브 로테이터에서 배양하십시오. 표면 항원을 나타내는 순환 종양 세포 또는 CTC는 와이어의 항체에 결합합니다. 인산염 완충 식염수 또는 PBS가 들어 있는 바이알에 담그고 자연 건조하여 와이어를 헹굽니다. 이제 와이어를 아세톤 용액에 담그면 세포를 탈수하여 고정됩니다.

그런 다음 기능화된 부분이 포함된 P200 팁을 통해 와이어를 부드럽게 삽입합니다. 테이프에 형광 색소와 접합된 항체를 채워 와이어를 잠기게 합니다. 이렇게 표지된 항체는 세포에 존재하는 각각의 항원에 결합합니다. 실험실 필름으로 입구를 밀봉하고 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 배양합니다. 다음으로, PBS로 와이어를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 와이어를 와이어 홀더에 놓고 형광 현미경 아래에서 봅니다. 항체에 의해 결합된 CTC는 와이어에서 형광을 발합니다. 다음 프로토콜에서는 의료 와이어에서 CTC를 캡처하고 면역형광 염색으로 식별합니다.

- 실험을 시작하려면 4ml의 완전한 배지를 사용하여 5ml 바이알에서 80% 합류하는 T75 플라스크의 전체 내용물을 다시 현탁합니다. 그런 다음 유리 포장에서 와이어를 제거합니다. 와이어의 기능화된 금 부분을 바이알에 담그고 와이어 스토퍼가 5ml 바이알에 방수가 되도록 합니다. 실험실 필름으로 와이어를 밀봉하십시오. 그런 다음 실온에서 30분 동안 튜브 로테이터에 와이어를 배양합니다. 회전 후 세 개의 다른 깨끗한 바이알을 사용하여 한 접힌 PBS 용액에 와이어를 세 번 헹구고 와이어가 마를 때까지 기다립니다.

후드에서 와이어를 10분 동안 공기 건조시킨 후 실온에서 5밀리리터 튜브에 100% 아세톤 용액에 와이어를 10분 동안 담가 셀을 고정합니다. 기능화된 팁에 아세톤의 흔적이 없는지 확인하십시오. 실온에서 5분 동안 와이어를 자연 건조시킵니다. 다음으로, 5 밀리리터 튜브에서 와이어를 한 번 접힌 PBS로 두 번 세척합니다. 항체 희석 완충액에서 와이어를 배양합니다.

데이터 시트에 명시된 대로 형광 색소 및 항체 희석 완충액과 결합된 단클론 1차 항체의 희석액과 함께 150마이크로리터의 항체 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 P200 팁을 사용하여 와이어 스토퍼에서 와이어를 추출하고 팁의 더 큰 구멍을 통해 와이어를 부드럽게 삽입합니다. 작동하지 않는 끝을 먼저 삽입하고 금색 부분이 더 큰 구멍 바로 너머에 올 때까지 더 작은 구멍을 통해 와이어를 천천히 당깁니다. 150마이크로리터의 항체 혼합물을 팁에 부드럽게 첨가합니다.

기포 형성의 위험을 방지하려면 기능화된 끝이 완전히 떨어질 때까지 와이어를 부드럽게 돌리십시오. 팁의 구멍을 밀봉하고 구멍 주위에 실험실 필름을 감습니다. 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 와이어를 수직으로 배양합니다. 둘째 날에는 한 겹의 PBS로 와이어를 두 번 세척하여 항체 배양을 차단합니다. 전선 스토퍼에 전선을 다시 삽입합니다.