마이크로 스케일 영양소 레이어에 해양 미생물의 Chemotactic 응답

안녕하세요, 제 이름은 Marcos입니다. 저는 MIT 토목환경공학과의 Roman Stalker 교수님과 함께 연구하고 있으며, 자가 사진 촬영 기술을 이용해 마이크로 채널을 만드는 방법을 보여드리겠습니다. 우선, 마스크를 설계해야 합니다.

이것이 마스크이며, 기본적으로 우리가 제작하려는 마이크로채널의 최종 설계도입니다. 이는 인젝터 설계로, 영양분의 얇은 층을 만들어 그 안에 미생물이 헤엄치게 함으로써 화학 주성이 어떻게 일어나는지 관찰할 수 있게 합니다. 또한, 공동 내부에 마이크로 와류를 생성하기 위한 측면 공동 채널이 있으며, 이에 대한 영상은 마스크 제작 후 나중에 보여드리겠습니다. 이제 마스크를 가지고 클린룸으로 가서 웨이퍼를 페트리 접시에 놓을 것입니다. 지금 클린룸으로 이동하겠습니다.

마스크 인쇄가 완료되어 준비되었으므로, 이제 실제 미세 가공을 위해 클린룸으로 이동했습니다. 먼저 새로 구매한 깨끗한 웨이퍼 한 조각을 가져와 다음 세 가지 용매를 사용하여 매우 깨끗한 상태인지 확인하고자 합니다. 첫 번째 단계는 아세톤으로 세척한 후 즉시 메탄올을 사용하는 것입니다.

마지막 단계는 이소프로판올 세척입니다. 코팅 준비가 완료된 웨이퍼의 광택면에서 작업을 진행합니다. 이제 질소 가스를 이용하여 건조하겠습니다.

웨이퍼를 건조한 후, 약 130 °C의 오븐에 넣고 5분에서 10분 동안 베이킹합니다. 웨이퍼가 베이킹되는 동안, 하나는 65 °C, 다른 하나는 95 °C로 설정하여 두 개의 핫플레이트를 준비합니다. 5분간 베이킹한 후, 오븐에서 웨이퍼를 꺼내 실온에서 약 5분 동안 방치합니다.

이제 스핀 코팅 준비가 되었습니다. 포토레지스트를 붓기 전에, 웨이퍼 상단에 먼지 입자가 없는지 확인해야 하며, 이를 위해 질소를 사용하여 웨이퍼 상단을 분사합니다. 분사 방향은 중심에서 바깥쪽으로 향하게 합니다.

이제 웨이퍼 위에 포토레지스트를 부어주겠습니다. 약 3 mL의 양을 붓습니다. 포토레지스트를 웨이퍼 위에 부을 때 기포가 발생하지 않도록 병을 최대한 낮게 유지하십시오.

이제 스핀 코팅을 시작하기 전, 웨이퍼 위에 포토레지스트를 약 1분 동안 그대로 둡니다. 앞서 언급했듯이, 코팅 두께를 100 micron으로 설정하겠습니다. 따라서 총 스핀 시간을 55초로 설정하고 스핀 코팅을 시작합니다.

먼저, 회전 속도를 5초 동안 0에서 500 RPM까지 높인 후 약 10초간 회전시켜 포토레지스트가 웨이퍼 전체에 도포되는 것을 확인하고, 이어서 3000 RPM까지 약 7초 동안 속도를 높인 뒤 30초 동안 회전시킵니다. 웨이퍼에 포토레지스트 도포를 마친 후, 웨이퍼를 핫플레이트 위에 올려놓고 65 °C에서 5분간, 그리고 95 °C에서 20분간 소프트 베이크를 수행합니다. 95 °C에서의 소프트 베이크가 완료되면 실온까지 냉각시키는데, 이때 급격한 온도 하강을 방지하기 위해 먼저 65 °C에서 약 2~3분간 냉각시킨 후 진행합니다.

그런 다음 이를 실온에 두고 약 5분 동안 식힙니다. 이제 UV 광선을 조사하여 노출된 부분은 경화시키고, 노출되지 않은 부분은 나중에 세척하여 제거하겠습니다. 이 단계에서 마스크를 사용하는데, 보시는 바와 같이 마스크는 투명한 부분과 이 설정에서 완전히 불투명하거나 검은색인 부분의 두 부분으로 구성되어 있습니다.

이제 코팅된 웨이퍼 위에 마스크를 올리겠습니다. 인쇄 업체에서 받은 마스크에는 두 면이 있습니다. 한 면은 잉크로 인쇄된 면입니다.

그리고 이곳이 웨이퍼와 접촉시켜야 할 부위입니다. 이제 마스크를 통해 UV 광선으로 웨이퍼를 노광하겠습니다. 안전을 위해 이 보안경을 착용하겠습니다.

노광 시간은 사용하는 SUA의 종류와 달성하고자 하는 두께에 따라 달라집니다. 노광 후, 웨이퍼를 65 °C 핫플레이트에 올려 5분 동안 다시 베이크한 다음, 95 °C에서 20분 동안 베이크합니다. 이 베이크 시간은 원하는 두께와 사용하는 SUA의 종류에 따라 달라질 수 있음을 유의하시기 바랍니다.

이제 웨이퍼를 현상하겠습니다. 현상이란 웨이퍼에 노광된 영역만 남기고 원치 않는 포토레지스트 부분을 제거하는 것을 의미합니다. 웨이퍼를 현상하고 불필요한 포토레지스트 부분을 씻어내기 위해 현상액을 사용합니다.

본 사례에서는 포모날 아세테이트(pomonal acetate)를 현상액으로 사용하며, 이 용매를 비커에 붓고 웨이퍼를 넣어 약 10분 동안 담가둡니다. 이때 시간은 웨이퍼의 두께와 사용하는 용매에 따라 달라질 수 있습니다. 10분 후, 웨이퍼에는 원하는 채널 설계만이 남고 원하지 않는 부분은 모두 씻겨 나간 것을 확인할 수 있으며, 이를 가볍게 헹궈줍니다.

동일한 용매의 새 용액과 동일한 polyon acetate를 사용하며, 웨이퍼 위에 뿌려 헹궈냅니다. 마지막으로, 용매를 씻어내기 위해 iso propanol을 사용하여 헹굽니다. 그런 다음 질소 가스를 사용하여 건조시킵니다.

이제 원하는 패턴이 형성된 깨끗한 웨이퍼가 준비되었습니다. 이를 마스터라고 부릅니다. 이제 실험실로 돌아가 이 마스터 위에 PDMS를 붓고 나머지 절차를 계속 진행하겠습니다.

이제 클린룸에서 돌아와서, 우리가 제작할 몰드의 기본형인 마스터를 확보한 상태입니다. 다음 단계로 폴리머의 일종인 PDMS를 부어 경화시킬 것입니다. 보시는 바와 같이, 이 몰드 위에 폴리머를 부으면 폴리머 표면에 홈이 형성되며, 최종적으로 이를 유리 슬라이드에 접합하면 폴리머 자체가 채널이 됩니다.

이제 PDMS를 준비하겠습니다. 이것이 폴리머인 폴리디메틸실록산(PDMS)이며, 이것은 경화제입니다.

먼저 경화제를 이 컵에 붓고, PDMS를 다른 컵에 부어 1:10 비율로 혼합하겠습니다. 일반적으로 균질하게 섞기 위해 교반기를 사용합니다. 섞는 과정에서 많은 기포가 발생하는데, 이 기포는 혼합 여부를 알려주는 지표가 됩니다.

이제 PDMS와 경화제를 혼합했으므로, 웨이퍼인 마스터 위에 이 혼합물을 부을 준비가 되었습니다. 붓는 동안 웨이퍼가 움직이지 않도록 테이프로 웨이퍼를 고정했습니다. 웨이퍼 위에 PDMS 혼합물을 붓기 전에, 웨이퍼 위에 떨어졌을 수 있는 먼지를 최대한 제거하여 깨끗하게 만들어야 합니다.

이제 웨이퍼의 먼지를 제거하기 위해 컴프레서를 켭니다. 보시는 것처럼 PDMS에 기포가 많이 생겼습니다. 이를 진공 챔버 안에 넣어 기포를 제거하겠습니다.

따라서 모든 기포를 제거하는 데 약 30분 정도의 진공 작업이 소요됩니다. 기포 제거가 완료되면 이를 꺼내 65 °C의 오븐에 넣고 최소 12시간 동안 굽습니다. 12시간이 지나면 절단 준비가 된 웨이퍼를 얻게 됩니다.

이 나이프로 PDMS를 자르고 웨이퍼에서 PDMS를 떼어낸 다음, 홀 펀처를 사용하여 튜빙의 입구와 출구를 위한 구멍을 뚫겠습니다. 자를 때는 나이프가 웨이퍼에 닿을 때까지 누르되, 웨이퍼가 깨지지 않도록 너무 많은 압력을 가하지 않으면서 채널 주변을 따라 자르십시오. 이제 이를 떼어냅니다.

보시는 바와 같이 이것이 웨이퍼의 패턴인 채널입니다. 따라서 두 패턴이 동일하다는 것을 알 수 있습니다. 그리고 이제 이 패턴이 폴리머인 PDMS에 식각되었습니다.

이를 유리 슬라이드 위에 접합시키면 실험을 위한 채널이 됩니다. 다음으로 중요한 단계는 PDMS 내의 마이크로 채널에 구멍을 뚫어 유입구와 유출구를 삽입할 수 있도록 하는 것입니다. 저희는 홈이 있는 채널 쪽에 스카치테이프를 붙여 고정했습니다.

이 채널을 스카치테이프로 붙이는 이유는 모든 먼지 입자를 제거하기 위해서입니다. 다음 단계는 플라스마 본딩입니다. 다른 실험실에서 진행할 플라스마 본딩에 앞서, 테이프를 제거하여 본딩하려는 표면, 즉 이 표면과 유리 슬라이드를 함께 노출시킨 다음 산소 플라스마에 노출시키고, 이후에 두 표면을 맞붙이면 본딩이 됩니다.

안녕하세요, 제 이름은 Justin Seymour이며 MIT의 Roman Stocker 연구실에서 박사후 연구원으로 재직 중입니다. 저는 미생물 생태학, 더 구체적으로는 해양 미생물이 바다 속에서 먹이 조각들을 어떻게 찾아내는지 연구하고 있습니다. 저희는 이러한 패턴을 관찰하기 위해 미세유체 기술을 사용하고 있습니다.

앞서 Marcus가 제작 방법을 시연한 채널을 플라스마 본딩 처리 후 사용하여, 이를 미세유체 실험에 활용하겠습니다. 실험을 시작하기 전에, 실험에 사용할 기판들을 준비해야 합니다.

오늘 실험에서는 해양 식물성 플랑크톤인 donella tur electro가 마이크로 규모의 먹이 패치를 어떻게 찾아내는지 살펴보겠습니다. 여기에서 먹이는 암모늄이며, 100 µM 농도의 암모늄을 제공할 것입니다. 이러한 실험에서 우리는 제공하는 영양분에 형광 염색제를 추가함으로써 먹이 패치를 시각화할 수 있습니다.

따라서 플루오레세인 염료를 사용합니다. 여기서는 영양분으로 사용하는 암모늄에 최종 농도 100 µM의 플루오레세인을 피펫팅하고 있습니다. 이후 형광 현미경으로 해당 영양분을 시각화할 수 있으며, 이를 통해 영양분 패치가 어떻게 확산되는지 확인하고, 그 영양분 패치에 대한 생물체들의 반응을 관찰할 수 있습니다.

미세유체 실험에서는 유리 주사기를 사용합니다. 따라서 가장 먼저 수행해야 할 작업은 사용할 주사기에 기질과 생물을 넣는 것입니다. 다음 단계는 튜빙을 미세유체 장치에 삽입하는 것입니다.

이 과정은 현미경 스테이지 위에서 진행합니다. 마이크로플루이딕 채널을 현미경 스테이지 위에 놓고, 입구와 출구에 튜브를 삽입합니다. 그다음 폐액 저장조를 설치하며, 저장조 내의 튜브가 완전히 잠길 수 있도록 저장조의 절반 정도를 액체로 채웁니다.

이를 통해 채널 내에 일정한 압력을 유지할 수 있습니다. 그런 다음 유기체(이 경우에는 donella, lector)와 영양 기질(이 경우에는 ammonium)이 포함된 미세유체 채널로 연결되는 튜브에 주사기를 연결합니다. 이후 현미경을 설치하고 실험을 시작하기 전 미세유체 채널이 적절한 위치에 있는지 확인합니다.

채널이 위치하면 카메라로 채널을 보도록 전환하여 컴퓨터에서 시각화할 수 있습니다. 이제 초점을 통해 더 미세한 조정을 수행할 수 있으며, 영양분을 주입하는 인젝터를 시각화할 수 있습니다. 이는 마이크로플루이딕스 채널 내에 내장된 100 µm 와이어 바늘 팁으로 구성됩니다.

영양분을 주입하여 영양분 구배를 형성할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전, 이 단계에서 미세유체 시스템 내부에 유입되었을 수 있는 기포를 모두 제거해야 합니다. 이를 위해 이번 사례에서는 인공 해수를 채운 시린지를 사용하며, 밸브를 통해 이를 미세유체 채널에 연결하여 제거합니다.

그 다음, 주사기를 밀어 채널 내부의 기포를 제거합니다. 기포는 두 가지 방법 중 하나로 제거할 수 있는데, 주사기로 가해진 압력을 이용해 유출구 밖으로 밀어내거나, 가스 투과성이 있는 PDMS 소재의 벽면을 통해 기포를 강제로 배출시키는 방법이 있습니다. 기포가 제거되어 실험을 시작할 준비가 되면, 시린지 펌프를 사용하여 채널로 주입할 물질의 적절한 유속을 설정합니다.

이 사례에서는 분당 2 µL의 유속을 사용하며, 이는 채널 내 266 µm/s의 유속과 동일합니다. 적절한 유속을 설정한 후, 유동을 시작하여 실험을 개시하면 영양분의 얇은 띠가 형성됩니다. 영양분에 플루오레세인(fluorescein) 염료를 첨가하고 APF 형광 현미경으로 관찰함으로써, 주입 지점에서 채널로 영양분이 주입되는 모습을 시각화할 수 있습니다. 그 다음, 미세유체 채널의 유동을 중단시키고 원래 위치에서 측면으로 확산되는 영양분 띠를 관찰하여 패치 역학(patch dynamics)을 분석할 수 있습니다.

그런 다음 위상차 현미경으로 전환하여 채널 내에서 헤엄치는 생물들을 시각화하고 영양분 패치와 관련된 이들의 위치를 관찰합니다. 초당 10프레임의 프레임 속도로 연속 프레임을 캡처함으로써 이러한 생물들을 시각화할 수 있는 영상을 제작할 수 있습니다. 이후 두 개별 프레임 사이의 시간 차이를 이용하여 이전 프레임에서 한 프레임을 빼는 방식으로 헤엄치는 생물들을 시각화하면, 움직이는 물체만 시각화됩니다.

이렇게 하면 이미지에서 배경 소음을 제거할 수 있습니다. 그런 다음 영양 패치를 처음 방출한 후 10분에서 20분 동안 정기적인 간격으로 영상을 기록합니다. 그리고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 시퀀스의 한 프레임에서 다른 프레임으로 생물체의 위치를 중첩함으로써, 이러한 생물체의 위치 변화를 살펴보고 유영 궤적에 대한 정보를 얻을 수 있으며, 이를 통해 속도와 방향 변화를 포함한 유영 통계에 대한 더 상세한 정보를 얻을 수 있습니다.

따라서 이러한 실험들을 통해 해양 미생물이 마이크로 스케일의 영양분 패치를 어떻게 찾아내고 활용하는지 최초로 직접 조사할 수 있었습니다. 이는 해양의 영양 단계 역학과 영양분 순환에 중요한 시사점을 줄 수 있습니다. 앞서 Justin이 언급한 바와 같이, 미생물, 특히 박테리아가 해양 내 먹이와 상호작용하는 방식은 생화학적 순환에 많은 영향을 미칠 수 있습니다.

하지만 실제 해양은 매우 정적인 상태가 아니며, 바람이나 해수면 등에 의해 생성되는 난류와 같은 다양한 유동 조건이 존재합니다. 미생물의 규모에서 볼 때, 이들이 실제로 경험하는 것은 거대한 난류가 아니라 전단력이며, 난류의 가장 작은 잔재는 콜모고로프 에디(Kolmogorov eddy)라고 알려져 있습니다. 여기서 우리가 연구하고자 하는 것은 이러한 에디가 미생물의 유영 행동에 어떠한 영향을 미치는가 하는 점입니다.

이를 위해 이전에 보여드린 이 질량을 이용하여 또 다른 채널을 만들고 있습니다. 그리고 중앙에는 공동(cavity)이 있습니다. 다이어그램을 확대하여 그려보겠습니다.

이것이 채널의 모습입니다. 위에서 내려다본 시점이며, 왼쪽에서 오른쪽으로 흐름을 주입합니다. 그러면 전단력으로 인해 이 공동 내부에 재순환 영역이 생성됩니다. 이 공동은 그라프트 어디스(graph Addis)를 나타냅니다. 앞서 저스틴이 설명한 것과 동일한 설정을 사용할 수 있습니다. 시린지 펌프를 끄고 흐름을 생성하지 않았을 때, 박테리아가 이 공동 내부에서 매우 무작위적이고 자유롭게 헤엄치는 것을 볼 수 있습니다.

또한 선호되는 방향은 없습니다. 현재 보고 계신 영상은 시간 차 영상으로, 이는 Justin이 사용하고 있는 것과 정확히 동일한 기술입니다. 보시는 바와 같이 유속이 매우 빠를 때, 박테리아는 와류에 의해 밀려나게 됩니다.

그리고 박테리아 자체의 궤적은 와류의 유선(streamline)을 따릅니다. 더욱 흥미로운 점은 시린지 펌프를 켰을 때 일어나는 다음과 같은 현상입니다. 하지만 속도는 그렇게 빠르지 않습니다.

박테리아가 이에 대항할 수 없을 정도로 너무 빠른 것은 아닙니다. 하지만 어떤 면에서 이 영상 속에서는 여전히 소용돌이와 유사한 모습을 거의 확인할 수 있습니다. 따라서 이 실험을 통해 우리는 매우 강하고 난류인 환경에서는 박테리아가 흐름에 휩쓸리며, 그 흐름에 대항할 수 없다는 점을 배웠습니다.

하지만 약한 난류 영역에서는 여전히 스스로 헤엄칠 수 있습니다.