JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 5:00 분 • April 30th, 2023
- 활성화된 T 세포는 췌장 종양 미세환경으로 이동하여 인터페론-감마 또는 IFN 감마와 같은 사이토카인과 종양괴사 인자-알파 또는 TNF 알파를 방출하여 효과적인 항종양 반응을 매개하는 데 도움이 됩니다. 사이토카인이 T 세포 밖으로 빠르게 이동함에 따라 세포 내 수치는 감지되지 않을 수 있습니다. 따라서 T 세포는 종양에서 치료 역할을 연구하기 위해 기저 사이토카인 생산을 증가시키기 위해 자극이 필요합니다.
쥐의 췌장에서 종양 세포를 현탁액으로 채취하는 것으로 시작합니다. 이제 세포 현탁액에 존재하는 T 세포를 사이토카인 자극 칵테일로 처리하고 원하는 시간 동안 혼합물을 배양합니다. 이 칵테일은 소포체에서 세포질로 칼슘 이온의 방출을 촉진합니다. 높은 칼슘 수치는 차례로 특정 핵 전사 인자를 활성화하여 T 세포의 사이토카인 생산을 증가시킵니다.
다음으로, 단백질 수송 억제제 칵테일로 세포를 치료하고 튜브를 배양합니다. 이 칵테일은 소포체에서 골지 복합체로의 사이토카인 수송을 차단하여 세포 내에 사이토카인이 축적되도록 합니다. 마지막으로, 유세포 분석을 위해 적절한 세포 내 마커를 사용하여 세포를 염색합니다. 다음 프로토콜에서는 사이토카인의 세포 내 농도를 증가시키기 위해 T 세포 자극을 수행합니다.
- 시작하려면 집게를 사용하여 종양을 페트리 접시에 옮깁니다. 효소 활성이 시작되는 것을 방지하기 위해 얼음 위에 50ml 튜브에 50ml의 소화 매체를 보관하십시오. 페트리 접시의 종양을 덮기 위해 이 용액의 작은 부분 표본을 취하십시오. 멸균 메스와 집게를 사용하여 종양을 대략 3mm 미만의 작은 조각으로 자릅니다. 종양 조각을 튜브에 긁어내고 모든 조각이 소화 매체에 잠길 때까지 튜브를 부드럽게 뒤집습니다. 튜브를 진탕 장치에 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 가열하여 소화시킵니다. 모든 종양 조각이 물에 잠겨 있고 튜브 가장자리에 달라붙지 않았는지 확인하십시오.
분해 단계 직후 튜브를 얼음 위에 올려 효소 활동을 늦춥니다. EDTA를 첨가하여 20 밀리몰의 최종 농도를 달성하고 효소 활성을 더욱 늦추기 위해 샘플을 잠시 소용돌이치게 합니다. 튜브를 열고 새 RPMI 배지로 튜브 뚜껑에서 종양 소화물을 헹굽니다. 그런 다음 70미크론 스트레이너를 준비합니다. 얼음 위에 50ml의 열린 튜브에 놓습니다. 필터를 매체로 미리 적십니다. 소화된 세포를 재현탁시키고 25ml 이상의 스트라이프를 사용하여 튜브의 측면을 세척합니다. 스트라이프의 개구부가 넓기 때문에 두꺼운 다이제스트가 쉽게 통과할 수 있습니다.
25ml 스트라이프를 사용하여 모든 다이제스트를 스트레이너로 옮깁니다. 1ml 주사기 플런저를 사용하여 필터 상단의 종양을 위아래로 으깨십시오. RPMI로 스트레이너를 통해 세포를 지속적으로 세척합니다. 세포가 통과할 수 있을 만큼 충분한 힘으로 씻으십시오. 모든 세포가 스트레이너를 통과할 때까지 계속 세척하십시오. 튜브를 300회 g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.
세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁하고 RPMI를 완성하고 다른 필터를 직접 통과시켜 적절하게 재현할 수 없는 세포 외 기질 또는 큰 세포 덩어리를 제거합니다. 자극이 필요하지 않은 경우, 유세포 분석을 위해 분리된 세포를 즉시 염색하거나 FBS에서 10% DMSO의 동결 매체에 재현탁하고 영하 80도에서 보관하십시오.
자극을 수행하려면 먼저 세포를 세십시오. 세포를 완전한 배지로 희석하여 100 마이크로 리터당 6의 2 배 농도를 달성하십시오. U-바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 셀을 플레이트합니다. PMA 및 ionomycin의 2X 제제를 포함하는 완전한 배지 100마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 이산화탄소 5%와 함께 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 Brefeldin-A 및 Monensin의 10X 제제 20마이크로리터를 추가하고 배지를 완성하여 각각 1.06마이크로몰 및 2.0마이크로몰의 최종 농도를 얻습니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 4시간 더 넣습니다.