망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

이 프로시저의 전반적인 목표는 모델로 사용할 수 있는 인간 태아 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE) 배양물을 생성하는 것입니다. 인간 안과 질환 연구에서는 기증자로부터 온전한 안구 형태로 조직을 제공받습니다. 프로시저의 첫 번째 단계는 과도한 근육과 결합 조직을 제거한 후, 각막과 수정체를 제거하여 안구를 여는 것입니다.

안구를 디스파(dispa)로 처리하여 평평하게 만든 후, 망막색소상피(RPE) 단층을 맥락막에서 박리하여 분리합니다. 분리된 RPE를 플라스크에 접종하고, 세포가 합류 단층(confluent monolayers)을 형성하고 색소를 발달시킬 때까지 수주 동안 배양합니다. 이렇게 배양된 세포는 인 비트로(in vitro) 기능 실험에 사용됩니다.

성공적인 in vitro 실험은 더 복잡한 신호 전달 환경에서 RPE 반응을 더 효과적으로 평가할 수 있는 전임상 시험 동물 모델에서 반복됩니다. 본 영상에서 제시하는 모델은 RPE 생리학에 대한 이해를 높이고 안과 질환을 치료하기 위한 새로운 치료적 개입으로 이어질 것입니다. 안녕하세요, 저는 Sheldon Miller입니다.

저희 연구실은 메릴랜드주 베데스다 캠퍼스에 위치한 국립보건원(NIH) 산하 국립안과연구소(NEI)에 있습니다. 안녕하세요, Miller Lab의 Arki입니다. 오늘은 인간 태아 망막 색소 상피 세포의 일차 배양물을 준비하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 세포들은 변형된 싱 챔버(sing chambers)에 장착할 수 있도록 컨플루언트 단층(confluent monolayers)으로 준비됩니다. 또한, 이렇게 분리된 인간 RPE 세포를 생화학 및 유전학 연구에 사용할 것입니다. 본 실험실에서는 생리적 및 병리생리학적 과정의 기능과 조절을 연구하고 질환의 임상 동물 모델을 개발하기 위해 상피 세포의 일차 배양을 확립하는 이 절차를 사용합니다.

우리는 안구 뒷면에 위치하여 신경 망막과 맥락막 혈류를 분리하는 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE)에 집중합니다. 이 안구 도식도는 광수용체 바로 옆인 안구 뒷면에 위치한 RPE 층의 위치를 보여줍니다. 삽입도는 오른쪽에 광수용체가 있고 왼쪽에 신경절 세포가 있는 망막 세포들을 보여줍니다.

이 상피는 대사적으로 매우 활발합니다. 이 상피는 매일 지속적으로 광수용체를 식세포 작용으로 제거하며, 시각 색소인 vitamin A를 저장, 조절 및 광수용체로 수송합니다. 시각 주기에서 이 상피는 주변 세포외 공간의 화학적 조성과 부피를 유지하기 위해 항상성 역할을 수행합니다.

상피세포의 중요한 특성은 극성입니다. 단백질이 apical 막과 basal lateral 막으로 지속적으로 비대칭하게 전달되는 것은 조절된 과정이며, 이를 통해 상피세포는 대사물질, 이온 및 액체를 한 세포 외 공간에서 다른 공간으로 벡터 방식으로 수송할 수 있습니다. 이러한 활성은 상피세포가 신경 망막의 건강과 무결성을 유지하는 데 도움을 줍니다.

본 문서에서 설명하는 in vitro 준비법을 통해 박리를 시작하기 전, 상피 세포의 극성과 기능을 결정하는 수송 단백질, 수용체 및 신호 전달 경로를 분석할 수 있습니다. 층류 후드 내에서 상온 용액을 사용하여 12웰 플레이트를 준비하십시오. 안구 하나당 10x 항생제-항진균제 용액 1웰, 1x PBS 2웰, 그리고 혈청이 포함된 5% RPE 배지에 2 units/mL로 희석된 disc space 용액 1웰이 필요합니다. 실리콘 패드가 깔린 박리 접시에 1x HBSS를 채운 뒤 액체를 따라내고, 각 안구를 항생제-항진균제 용액이 담긴 웰로 옮기십시오.

실온에서 3~5분 동안 배양합니다. 안구에 과도한 압력을 가하지 않도록 주의하십시오. 과량의 항생제를 제거하기 위해 XPBS가 담긴 두 개의 웰에서 순차적으로 눈을 헹굽니다.

그 후 핀셋을 사용하여 해부 현미경 하에서 1X-H-B-S-S가 채워진 해부 접시에 옮깁니다. 홍채 가위를 사용하여 안구 주변의 과도한 근육과 결합 조직을 제거합니다. 각막이 위를 향하도록 안구를 정렬합니다.

두 개의 멸균 27 gauge 바늘을 사용하여 공막이 손상되지 않도록 결합 조직을 통해 안구를 실리콘 패드에 고정합니다. 이 상태에서 사이드 포트 나이프(side port knife)를 사용하여 공막에 절개를 가합니다. 절개 부위는 안구 적도에서 전면까지 거리의 3분의 1 지점이 되어야 합니다.

망막 색소 상피(RPE)가 유리체 망막 견인으로 인해 손상되는 것을 방지하기 위해, 아이리스 가위를 사용하여 눈 주변을 원형으로 계속 절개합니다. 동일한 가위로 유리체를 절단하여 전안판(front eye flap)을 안컵(eye cup)으로부터 분리합니다.

IOA의 앞부분을 들어 올려 제거합니다. 포셉을 사용하여 개안된 눈을 dys 웰로 옮깁니다. 눈 내부에 기포가 없는지 확인하십시오.Cup.

37°C, 5% CO₂ 환경에서 40~60분 동안 배양합니다. 안구를 디스크 공간에서 신선한 상온의 1X HBSS가 채워진 해부 접시로 다시 옮깁니다. 컵 부분이 위를 향하도록 안구를 배치하고 27게이지 바늘 2개로 고정합니다.

해부 현미경 하에서, 미세 핀셋을 사용하여 부분적으로 분리된 망막을 망막 가위로 조심스럽게 들어 올립니다. 시신경으로부터 망막을 절단하여 분리합니다. 분리한 망막은 홍채 가위를 사용하여 제거합니다.

안구 주변부에서 시신경까지 절개합니다. 27게이지 바늘 5개를 사용하여 안구를 고정합니다. RPE 층을 확장하기 위해 망막 가위를 사용하여 시신경 주위를 원형으로 절개합니다.

250배 이상의 배율로 전환하여 RPE 층을 분리합니다. 홍채 가위로 절개한 부위를 따라 시신경 근처에 있는 RPE 시트의 가장자리를 찾습니다. 두 쌍의 핀셋을 사용하여 RPE 및 브루크 막을 맥락막 조직층에서 분리합니다.

절단면을 따라 여러 부위를 시도하여 RPE와 맥락막 사이의 연결이 가장 약한 지점을 찾으십시오. 막을 조심스럽게 벗겨내어 완전히 제거합니다. RPE 시트를 실온의 trips in EDTA가 채워진 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣으십시오.

모든 시트를 수집하면 튜브의 캡을 닫고, 37 °C의 항온 수조에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 강하게 흔들어 RPE를 작은 클러스터로 분리합니다. 어두운 색의 세포 덩어리가 보이지 않으면 분리가 완료된 것입니다.

튜브를 항온수조에 넣고 5분 동안 더 유지합니다. 파스퇴르 피펫과 가벼운 흡입을 이용하여 소화되지 않은 나머지 조직 잔해물을 제거합니다. 원심분리기를 사용하여 세포를 280 5G에서 4분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거합니다. 15% RPE 배지를 사용하여 최종 부피를 9 mL로 맞추고 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액 3 mL를 25 cm² 플라스크에 분주합니다.

실온의 신선한 15% RPE 배양액 2 mL를 추가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 진행됨에 따라 3~4주 후에 색소 침착이 증가합니다.

성공적으로 배양된 세포는 합류 상태(confluent)가 되며, 균일하고 강하게 착색됩니다. 지금까지 인간 태아 망막색소상피(RP) 일차 배양물을 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.