망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

이 절차의 전반적인 목표는 모델로 사용할 수 있는 인간 태아 망막 색소, 상피 또는 RPE의 배양을 생성하는 것입니다. 인간의 안구 질환에 대한 연구에서, 조직은 기증자로부터 온전한 안구 형태로 이식됩니다. 시술의 첫 번째 단계는 여분의 근육과 결합 조직을 잘라낸 다음 각막과 수정체를 제거하여 눈을 뜨는 것입니다.

눈은 dispa로 치료하고 평평하게 한 다음 맥락막에서 RPE 단층을 벗겨냅니다. 해부. RPE는 플라스크에 파종되고 합류 단층에 도달하고 색소가 발생할 때까지 몇 주 동안 성장합니다. 세포 배양은 체외 기능 실험에 사용됩니다.

성공적인 in vitro 실험은 보다 복잡한 신호 전달 환경에서 RPE 반응을 더 잘 평가할 수 있는 전임상 시험 동물 모델에서 반복됩니다. 여기에서 입증된 모델은 RPE 생리학에 대한 더 나은 이해와 안구 질환 치료를 위한 새로운 치료 개입으로 이어질 것입니다. 안녕하세요, 제 이름은 쉘든 밀러입니다.

제 실험실은 메릴랜드 주 베데스다 캠퍼스에 있는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 산하 국립 안과 연구소(National Eye Institute)에 있습니다. 안녕하세요, 저는 Miller Lab의 Arki입니다. 오늘 우리는 인간 태아 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양을 준비하는 절차를 보여 드리겠습니다.

이러한 세포는 변형된 노래 챔버에 장착할 수 있는 융합 단층으로 준비됩니다. 우리는 또한 생화학 및 유전학 연구를 위해 이러한 분리된 인간 RPE 세포를 사용할 것입니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 생리학적 및 병태생리학적 과정의 기능과 조절을 연구하고 질병의 임상 동물 모델을 개발하기 위해 상피 세포의 1차 배양을 확립합니다.

우리는 눈 뒤쪽에 위치하여 신경 망막과 맥락막의 혈액 공급을 분리하는 망막 색소 상피 또는 RPE에 초점을 맞춥니다. 이 눈의 개략도는 광수용체에 바로 인접한 눈 뒤쪽에 있는 RPE 시트의 위치를 보여줍니다. 삽입물은 망막의 세포를 보여주며, 오른쪽에는 광수용체가 있고 왼쪽에는 신경절 세포가 있습니다.

이 상피는 신진대사적으로 매우 활동적입니다. 그것 phagocytosis 광수용체는 주간에 지속적으로 유지하고, 광수용체에 시각적인 안료 비타민 A를 reis, mizes 및 셔틀합니다. 시각 주기에서 그것은 주변 세포 외 공간의 화학적 조성과 부피를 유지하기 위해 항상성으로 작용합니다.

상피의 중요한 특성은 극성입니다. 정점 및 기저 측막으로의 단백질의 지속적인 비대칭 전달은 상피가 한 세포 외 공간에서 다른 세포 외 공간으로 대사 산물, 이온 및 유체의 벡터 트래픽을 수행할 수 있도록 하는 조절된 과정입니다. 이 활동은 상피가 신경 망막의 건강과 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다.

여기에서 설명하는 체외 제제를 통해 해부를 시작하기 전에 상피 극성과 기능을 결정하는 수송 단백질, 수용체 및 신호 전달 경로를 분석할 수 있습니다. 실온 용액이 있는 층류 후드에 12웰 플레이트를 준비합니다. 각 눈에는 10 x 항생제 항진균 용액 1 웰, 1 XPBS 1 웰 및 5 % RPE 매체에 혈청으로 희석 된 디스크 공간 1 밀리리터 당 2 개의 웰이 필요합니다 실리콘 패딩 해부 접시에 하나의 X-H-B-S-S를 채우고 액체를 배출하고 각 눈을 항생제 항진균 용액 1 웰로 옮깁니다.

실온에서 3-5분 동안 배양합니다. 안구에 과도한 압력을 가하지 마십시오. 과도한 항생제를 제거하기 위해 하나의 XPBS를 두 개의 연속으로 헹굽니다.

그런 다음 집게를 사용하여 해부 실체 현미경으로 X-H-B-S-S 1개로 채워진 해부 접시로 옮깁니다. 홍채 가위를 사용하여 눈 주위의 과도한 근육과 결합 조직을 제거합니다. 각막이 위를 향하도록 눈을 정렬합니다.

두 개의 멸균 27 게이지 바늘을 사용하여 실리콘 패드의 공막을 손상시키지 않고 결합 조직으로 눈을 고정합니다. 이 방향에서 측면 포트 나이프를 사용하여 공막을 절개합니다. 절단은 눈 적도에서 전방 표면까지의 거리의 1/3이어야 합니다.

홍채 가위를 사용하여 눈 주위를 원형으로 계속 자르면 망막 색소가 손상되지 않습니다. 상피(Epithelium), 유리체 망막(vitreous Retina attraction)에 의해 약칭되는 RPE. 같은 가위를 사용하여 유리체를 잘라 앞눈과 아이컵을 분리합니다.

IOA의 앞쪽 부분을 들어 올려 버립니다. 집게를 사용하여 열린 눈을 dys의 우물로 옮깁니다. 눈에 기포가 없는지 확인하십시오. 컵.

섭씨 37도에서 40-60분 동안 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 디스 공간에서 신선한 실내 온도 1 X-H-B-S-S로 채워진 해부 접시로 눈을 다시 옮깁니다. 컵이 위를 향하도록 눈을 놓고 2 27 게이지 바늘로 고정합니다.

해부 현미경 아래에서 미세한 집게를 사용하여 망막 가위로 부분적으로 분리된 망막을 부드럽게 들어 올립니다. 시신경에서 망막을 잘라냅니다. 홍채 가위로 망막을 버립니다.

눈의 주변부에서 시신경까지 절개합니다. 5개의 27 게이지 바늘로 눈을 고정합니다. RPE 층을 늘리려면 망막 가위를 사용하여 시신경 주위를 원형으로 자릅니다.

RPE 계층을 250배 배율 이상으로 분리. 홍채 가위로 자른 부분을 따라 시신경에 가까운 RPE 시트의 가장자리를 찾습니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 맥락막 조직층에서 RPE와 브루스 막을 분리합니다.

절단면을 따라 여러 영역을 시도하여 RPE와 맥락막 사이의 연결이 가장 약한 위치를 찾으십시오. 멤브레인을 부드럽게 다시 벗겨 완전히 제거합니다. RPE 시트를 EDTA에서 실온 트립으로 채워진 15ml 원추형 튜브에 넣습니다.

모든 시트가 모이면 튜브에 뚜껑을 씌우고 섭씨 37도에서 10분 동안 수조에서 튜브를 배양합니다. 튜브를 세게 흔들어 RPE를 작은 클러스터로 분리합니다. 어두운 세포 덩어리가 없다는 것은 분리가 완료되었음을 의미합니다.

튜브를 수조에 다시 5분 더 넣습니다. 페이스트, 피펫 및 부드러운 흡입을 사용하여 소화되지 않은 조직 잔여물을 제거합니다. 280 5G의 원심분리기에서 4분 동안 세포를 스핀다운합니다.

상층액을 제거합니다. 15%RPE 중간 피펫으로 최종 부피를 최대 9ml까지 가져와 재현탁합니다. 세포는 3ml의 세포 현탁액을 25cm 제곱 플라스크에 피펫으로 넣습니다.

2ml의 신선한 실온, 15% RPE 배지 배양을 추가합니다. 세포는 섭씨 37도에서 하룻밤과 5%의 이산화탄소를 닮았습니다. 배양이 성숙함에 따라 3-4주 후에 색소 침착이 증가합니다.

성공적인 문화는 융합되고 균일하고 강렬하게 착색될 것입니다. 우리는 방금 인간 태아 RP 1차 배양을 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.