Name: 기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 인간 배아 줄기 세포의 체내 분화 및 조직 특이적 운명 결정 방법을. 신장 캡슐 이식을 통해 기형 종을 형성하고 면역조직화학으로 세포 운명을 분석하는 이 기술은 재생의학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (RC1 - 00104), NHLBI에서 보건 서비스 그랜트 (HL085377)와 HSB로 Pollin 재단에서 선물에서 종합적인 연구 부여에 의해 지원되었다

아래 서면 프로토콜은 일부 수정, 저자에 의해보고되는 출판 매개 변수를 기반으로합니다. 프로토콜은 UCSF 기관 애니멀 케어 및 사용 (IACUC)와 줄기 세포 연구 감독 (SCRO)위원회의 승인과 함께 수행됩니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 I. 문화 <ol><li> 표준 6 자 (3.5 cm 직경 웰스) 접시에 hESCs 성장. </li><li> 접시에 피더 세포 1퍼센트 젤라틴 (6,7)로 코팅, 최소한 12 시간 전에 세포, 종자 마우스 배아 fibroblast (CF1 일 ~ 1000 CI에서 조사 e12.5 초과 - 성관계를 마우스를 얻은 MEF)은 passaging 수 있습니다. MEFs는 50-60%의 합류, 또는 4 도금되어야 물론 3.5 ㎝ 직경 당 X 10 5 세포 (그림 1). </li><li> 패시지 식민지 ~ 70 %의 합류 (그림 2)에 도달했습니다 세포. </li><li> 통과하려면 전지, 기음 KSR 성장 우물에서 매체 (6) 1 MG / ML의 농도에 KSR에서 Collagenase IV를 포함하는 0.5 ML 매체로 바꿉니다. </li><li> 37 Collagenase IV와 접시를 품어 ° C / 5 %는 5 분 동안이나 식민지의 가장자리까지 CO 2 판에서 리프트로 시작합니다. </li><li> 접시에서 Collagenase IV를 제거, 각 잘하는 KSR 0.5 ML를 추가하고, 수동으로 완전히 판에서 제거하는 세포를 다쳤어요. </li><li> 15 ML 원뿔 관에서 각 물론, 장소의 세포 현탁액을 수집하고, 세포가 5 분 중력에 의해 해결하실 수 있습니다. </li><li> ~ 300μl의 총 볼륨의 세포와 매체를 떠나, 튜브의 표면에 뜨는를 제거합니다. </li><li> 전체 볼륨에 200 μl 마이크로 pipettor 집합을 사용하여 부드럽게 식민지를 깰 수있는 세포 현탁액에게 5-6 번 피펫. </li><li> KSR 미디어를 (즉, 하나가 잘 수확 경우, 튜브 9 ML을 포함한다)를 사용하여 세포의 원래 잘 당 9 ML 총 볼륨에 세포 현탁액을 가져와. 12.5 NG / ML의 농도로 재조합 인간의 기본적인 fibroblast의 성장 인자 (bFGF)와 매체를 보완. </li><li> Dulbecco의 인산염과 MEF 세포를 (단계 2 참조)이있는 새 우물을 세척 후, 모든 혈청을 제거 각각 잘 수있는 세포 현탁액 3 ML을 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 접시를 부화 (DPBS) 살린 버퍼. </li><li> 세포가 다시 passaged 준비되기 전까지는 bFGF 통과 후 24 시간, 모든 24-48시간과 KSR 매체를 변경합니다. </li></ol> II. 접목에 대한 hESC 펠릿의 준비 <ol><li> 접목 전에 24 시간, 세포 생존 (8)을 높이기 위해 10μM의 최종 농도 KSR 매체에 바위 억제제를 추가합니다. 잘 ~ 70 % 합류 (5 X 10 5 세포)에서 세포 중 하나가 신장 캡슐 당 삽입이 알약과 함께 두 개의 알약을 만들어 낼 것입니다. </li><li> (9)를 접목에 대한 세포 알약을 준비하려면 37에서 5 분 Collagenase IV와 바위 억제제 - 처리 문화를 품어 ° C / 5 % CO 2. </li><li> 우물에서 Collagenase IV를 대기음와 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / strep) 1 ML의 DPBS로 바꿉니다. </li><li> 수동 접시에서 식민지를 밀고, 펜 / strep와 함께 추가 1 ML DPBS로 잘 씻어하고, 1.5 ML의 microfuge 튜브에 세포 현탁액의 각 1ml 나누어지는를 전송. </li><li> 8,000 X g에서 간략하게 microfuge 튜브를 스핀, 뜨는을 기음, 그리고 볼펜 / strep와 500μl DPBS에서 알약을 resuspend. </li><li> 이식을 위해 함께 세포를 바인딩할 수 있도록, 각각의 튜브에 DPBS에 100μl 1 MG / ML Phaseolus vulgaris의의 렉틴 (PHA)를 추가합니다. </li><li> 5 분 실온에서 셀 / PHA 서스펜션을 품어 후 8,000 X g에서 2 분간 돌린다. 자신의 로터 웰스 이내 튜브 180 ° 회전하고 8,000 X g에서 2 분간 다시 스핀. </li><li> 조심스럽게 펠렛은 그대로두고 표면에 뜨는를 대기음. </li><li> 그것이 서서히 리프트 때까지 부드럽게 펠렛의 가장자리 옆에 200μl KSR를 pipetting하여 튜브에서 세포 알약을 이동시키다. </li><li> 일단 dislodged 즉시 3 ML의 KSR를 포함하는 3.5 ㎝의 직경 우물에 위치 0.4μm MILLICELL 삽입에 알약을 전송하고, 37 ° C / 5% CO 2에서 하루 2 시간 동안 부화. </li></ol> III. 접목 신장 캡슐 <ol><li> 적절한 무균 기술을 사용하는 기관 지침에 따라 모든 동물 절차를 수행합니다. </li><li> 흡입 3퍼센트 isoflurane/0.5 %의 O2와 intraperitoneal tribromoethanol (; 25 MG / 신선한 kg Avertin)의 조합을 사용하여 8-12주 세 SCID 마우스 베이지 (CB17.Cg - Prkdc scid Lyst BG / CRL)을, 마취. 마우스마다 두 개의 세포 펠렛은 설명 기술 (10)를 사용 engrafted 것입니다. </li><li> 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에서 마우스를 배치 후, 절개의 영역을 면도 후, chlorhexidine로 소독. 단지 중심에서 피부지만 척추에 평행으로 2.5 cm의 절개를합니다. </li><li> 무균 살랑로 절개 영역 습기를 유지E, 그냥 척추에서 갈비와 ~ 1cm 아래의 근육을 통해 작은 절개를합니다. 절개는 통해 신장시킬만큼 큰 단지지만, 신장이 강제없이 복강에 다시 슬립하지 않을 정도로 작은되어야합니다. </li><li> 무딘, 약간 굽은 갈고리 모양으로 뽑아왔다 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 근육 절개를 통해 부드럽게 신장을 당겨. </li><li> 밖으로 건조에서 캡슐을 방지하기 위해 무균 DPBS과 신장 젖었어. 이것은 캡슐이 매우 불안정으로 절차 전반에 걸쳐 반복해야 할 수도 있습니다. </li><li> 더몬트 # 5 포셉를 사용하면 부드럽게 신장에서 캡슐을 끌어와 Vannas 스프링 가위를 사용하여 2mm 절개를합니다. </li><li> 아주 좋아, 무딘 프로브로 뽑아왔다 다른 유리 피펫으로 캡슐과 신장 사이에 작은 주머니합니다. </li><li> 일회용 전송 피펫에 배치 큰 구멍 피펫 팁을 사용 MILLICELL 삽입에서 단일 세포 펠렛을. 초과 미디어 펠렛 전송을 방해할 수 있으므로, 가능한 한 함께 약간의 여분의 미디어가 소요될해야합니다. </li><li> 주머니를 만들 절개의 가장자리를 잡고 있지만, 부드럽게 열고 옆에있는 펠렛을 배치하고 뽑아 피펫으로 신장 중 하나 극쪽으로 주머니에 밀어. </li><li> 두 번째 펠렛으로 과정을 반복합니다. 같은 신장의 캡슐에 따라이 곳에 있지만, 반대 극쪽으로. </li><li> 알약에 다시 아래로 캡슐을 조심스럽게 넣습니다. 산탄은 주머니 안에 있어야하고, 더 봉합은 캡슐을 닫을 필요가 없습니다. </li><li> 부드럽게 복강에 다시 신장을 눌러 및 첨부 리버스 절삭 바늘로 4-0 실크 봉합 (이하)를 사용하여 근육 벽을 닫습니다. 절개는 하나의 치료가 필요하다고 정도로 작은되어야합니다. </li><li> 같은 봉합사 재료를 사용하여 4-5 중단 바늘의 일련의 피부를 닫습니다. </li><li> 의 케이지에 다시 마우스를 배치하기 전에, 각각, 단기 및 장기 진통제로 0.05 밀리그램 / kg buprenorphine (11,12) 5 밀리그램 / kg 케토프로펜 (12,13)​​를 관리할 수 있습니다. 제어 물질은 기관 지침에 따라 사용해야합니다. </li><li> 그 케이지 다시 동물을 전송하고 가열 패드에 마취에서 회복 수 있습니다. 이 20-30분 정도 걸릴 것입니다. </li><li> 마우스 완전히 외래되면, 그것은 동물의 주거 시설로 제공될 수 있습니다. </li></ol> IV. 기형 종의 수확, 고정 및 sectioning <ol><li> 8~12주 수술에서 신장 근처에 거의 만져서 알 수있는 기형 종이 있어야합니다. 대형, 유체 - 채워진 cysts 종종 6~8주에서 시작뿐만 아니라 개발합니다. 그들은 동물에게 고통을 일으킬 경우 이들은 이전 수확 할거 수 있습니다. 기형종가 cysts보다 느린 속도로 성장 때문에, 그러나, 당신은 분석을 위해 충분한 크기 (즉, 최소한 8 주)의 기형 종을 얻기 위해 가능한 한 오랫동안 기다리는 것이 좋습니다. </li><li> 신장, 기형 종, 그리고 신장이 원래 액세스할되었던하여 동일한 수술 방법을 사용하여 복강에서 조직의 블록 같은 주변 cysts를 제거합니다 (제 III를 참조하십시오, 위의 1-4 단계). </li><li> 10 % 포르말린 버퍼가 들어있는 튜브에 excised 조직의 전체 블록을 배치합니다. </li><li> 기형 종은 4 밤새 수정을 허용 ° C.를 </li><li> 다음날, 튜브에서 기형 종을 제거하십시오. 기형 종 자체 (그림 3)을 손상하지 않고 가능한 모든 cysts과 많은 신장 멀리 해부하다. 큰 기형종은 절개와 삽입을 촉진하기 반으로 수 있습니다. </li><li> 표준 파라핀 - 고정 기법을 사용하여 기형 종을 처리합니다. 자동 단위 (예 : 쉔던 Hypercenter)을 사용할 수 있습니다 <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% 플렉스 알콜 </td><td> 이시간 </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% 플렉스 알콜 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% 플렉스 알콜 </td><td> 1.5 시간 </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% 플렉스 알콜 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> V. </td><td> 백퍼센트 플렉스 알콜 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 백퍼센트 플렉스 알콜 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 백퍼센트 플렉스 알콜 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> 클리어 라이트 3 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> IX. </td><td> 클리어 라이트 3 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> X. </td><td> 클리어 라이트 3 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> XI. </td><td> 파라핀 (TissuePrep) </td><td> 이시간 </td></tr><tr><td> XII. </td><td> 파라핀 (TissuePrep) </td><td> 이시간 </td></tr></tbody></table></li></ol> V. Immunohistochemistry 및 분석 <ol><li> 일단 슬라이드에 파라핀 섹션 로타리 마이크로톰를 사용하여 5μm 시리얼 조각의 기형 종과 부동 섹션에 포함된. </li><li> 얼룩 전에 적어도 한 시간 동안 슬라이드를 구워. </li><li> 삼배 배아 레이어 (그림 4)의 각각의 대표적인 조직 구조를 식별하는 표준 방법을 사용하여 hematoxylin과 eosin으로 슬라이드를 얼룩 : <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 크실렌 세척 </td><td> 3~5분 </td></tr><tr><td> II. </td><td> 크실렌 </td><td> 3~5분 </td></tr><tr><td> III. </td><td> 100 % 알코올 </td><td> 3~5분 </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 100 % 알코올 </td><td> 3~5분 </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95 % 알콜 </td><td> 3~5분 </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80 % 알콜 </td><td> 3~5분 </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 물 세척 (몇 가지 변화) </td><td> 이분 </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> 길스 Hematoxylin # 3 </td><td> 2~5분 </td></tr><tr><td> IX. </td><td> 물 세척 (몇 가지 변화) </td><td> 물이 맑은 실행까지 </td></tr><tr><td> X. </td><td> 스콧 물 (블루 핵까지) </td><td> 삼분 이상 </td></tr><tr><td> XI. </td><td> 물 세척 (몇 가지 변화) </td><td> 1~2분 </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosin Y </td><td> 일분 </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> 물 세척 (몇 가지 변화) </td><td> 30초 </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80 % 알콜 </td><td> 일분 </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95 % 알콜 </td><td> 이분 </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95 % 알콜 </td><td> 이분 </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> 100 % 알코올 </td><td> 삼분 </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100 % 알코올 (청소) </td><td> 삼분 </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> 크실렌 </td><td> 이분 이상 </td></tr><tr><td> XX. </td><td> 크실렌 </td><td> 이분 이상 </td></tr></tbody></table></li><li> Permount 각 슬라이드에 coverslip를 탑재합니다. </li></ol> VI. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. culturing undifferentiated hESCs위한 피더 레이어 조사 CF1 마우스 배아 섬유아 세포의 도금. MEFs가 ~ 50 %의 합류에 도금 아르가 여기에 표시, 또는 6 자 문화 요리에 잘 3.5 ㎝ 직경 당 4 X 10 5 세포. 바, 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. MEF 피더 레이어에 undifferentiated hESCs의 subconfluent 문화 예. hESCs 그 다음 passaged으로 설명 여기 같이, ~ 70 %까지 합류 MEF 피더 레이어에 재배하고 있습니다. 바, 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. explanted 기형종의 예가. explantation 다음, 기형 종, 신장, 및 액세서리 조직은 포르말린에 블록으로 고정되어 있습니다 다음, 신장 및 액세서리 조직은 신중하게 파라핀에 삽입하기 전에 거리에 손질하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. undifferentiated hESCs에서 파생된 기형종는 생체내의 세 세균 레이어의 조직의 대표가 포함되어 있습니다. 같은 그림 3에 묘사된 것과 기형 종은, 배아 조직을 식별하는 sectioned하고 hematoxylin 및 eosin 물들일했다. hESCs는 삼배 배아 레이어 (ectoderm (A, B), mesoderm (C), endoderm에서 파생된 조직을 일으키다 (D). (A) 초기 신경 튜브 구조. (B) 프리미티브 편평 상피. (C) 연골이 응축 mesenchyme의 캡슐로 둘러싸여. (D) 선의 장의 구조. 바, 100 μm의. 이미지가 저자의 허가 reprinted. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 기형 종 분석은 태그, undifferentiated hESCs의 운명을지도하는 데 사용할 수 있습니다. 이전에 게시된으로 (9), 태그가 지정되지 않은 hESCs과 함께 구체적으로 태그 hESCs의 혼합물이 기형 종의 형성 분석에 태그 세포의 운명을지도하는 데 사용할 수 있습니다. 여기로 같이 표면 마커, CD133, 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)와 태그를 표현 undifferentiated hESCs은 태그가 지정되지 않은, undifferentiated hESCs과 함께 혼합했다. 이들은 신장 이식 캡슐의 기형종 형성하는 데 사용되었습니다. 안티 eGFP 항체와 hematoxylin 및 eosin - 스테인드 기형 종 섹션의 Immunohistochemical 분석 CD133 +의 hESCs의 neuroectodermal의 운명을 보여줍니다. 기형종는 그림 4와 같이 처리 및 조직 내에서 CD133 + GFP + 세포의 파생 상품을 집중하기 위해 안티 - eGFP 항체 (갈색)과 counterstained되었습니다. CD133 + 파생 세포 (화살표) 배아 ectoderm, 특별히 신경 상피 (왼쪽)와 초기 신경 튜브와 같은 구조 (오른쪽)에서 발생하는 조직에서 관찰되었다. 바, 100 μm의. 이미지가 저자의 허가 reprinted. 젤라틴 <ul><li> 0.1 % 돼지의 젤라틴 </li><li> 99.9 % DPBS <ul><li> ° C (0.22μm) 1 시간 또는 모든 젤라틴이 솔루션으로 될 때까지, 그리고 필터는 소독 사용하기 전에 37 품어 DPBS에 젤라틴 추가합니다. </li></ul></li></ul> MEF 매체 <ul><li> 10% 태아 소 혈청 (공인) </li><li> 90 % Dulbecco는 (D - 멤) 필수 중간 수정된의 </li><li> 1X L - 글루타민 </li><li> 1X 펜 / Strep <ul><li> 사용하기 전에 소독을 필터링합니다. </li></ul></li></ul> KSR (마네 세럼 교환) 매체 <ul><li> 20 % 마네 혈청 교환 </li><li> 80 % 마네 D - 멤 </li><li> 1X L - 글루타민 </li><li> 1X 불필요한 아미노산 </li><li> 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 / </li><li> 12.5 NG / ML bFGF <ul><li> 소독 필터. </li><li> 37 ° C,하지만 따뜻한 ° C 세포에 추가하기 전에 4 보관하십시오. </li><li> 바로 사용하기 전에 bFGF를 추가합니다. </li></ul></li></ul> Collagenase IV <ul><li> 모든 가루는 솔루션으로 될 때까지 1-2시간 또는 37 ° C를 배치하여 KSR 매체 1 MG / ML을 디졸브. </li><li> 소독 필터. </li></ul> Avertin <ul><li> 0.25 g 2,2,2 - tribromoethanol </li><li> 0.25 ML 2 - 메틸 - 2 - butanol <ul><li> 37 품어 ° C 100 % 솔루션을 형성 하룻밤. </li><li> 수술 전에 몇 시간, 37 DPBS과 부화를 사용하여 희석하기 위해 2.5 % 작업 솔루션 ° 최소한 1 시간 동안 C. </li><li> 소독 및 나누어지는 필터. </li><li> Tribromoethanol 매우 가벼운 구분하므로 준비 및 사용의 모든 단계에서 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 사용하기 전에 더 이상 12-24 이상의 시간을 준비합니다. </li></ul></li></ul> Buprenorphine <ul><li> 메탄올 1 MG / ML 주식 솔루션 <ul><li> 0.015 MG / 살균 H 2 O.을 사용 ML 작업 솔루션에 희석 </li><li> 최대 1 개월에 대해 -20 ° C에 보관하십시오. </li></ul></li></ul> 케토프로펜 <ul><li> DPBS 0.5 MG / ML 작업 솔루션 <ul><li> , DPBS 추가 37 밤새 품어 ° C 1-2시간 또는 모든 가루가 솔루션으로 될 때까지. </li><li> 소독 필터와 4 저장 ° C. </li></ul></li></ul>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 생체내 환경에서 hESCs을 차별의 운명을 매핑하기위한 목적으로 고효율 기형 종 형성 분석을 적응있다. 특별히 선택된 hESCs의 소수가 undifferentiated 야생 유형 hESCs과 세포 펠렛을 형성 Phaseolus vulgaris의 렉틴와 혼합됩니다. 이것은 immunodeficient 마우스에서 신장 캡슐 아래 이식할 수 있습니다. 원래 선택한 hESCs의 운명은 다음 immunohistochemistry (그림 5)에 의해 결정 수로 이전 (9) 보도했다. 이 방법은 세포 기반 치료를위한 조직 특정 시약을 식별 및 생성을위한 유용한 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>4-0 실크 봉합사</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dupont #5 포셉</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>신장 캡슐</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (Qualified)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Flex alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Gill&amp;rsquo;s Hematoxylin #3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>지혈鉗, 직선형</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>일반 외과 수술</td></tr><tr><td>Iris 포셉</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>일반 외과 수술</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 혈청 대체제</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>MILLICELL 인서트</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>일반 외과 수술</td></tr><tr><td>파라핀 (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>돼지 젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>SCID beige 마우스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Wash</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>신장 캡슐</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)은 자기 갱신에 대한 무제한 용량, 삼배 배아 레이어 (1)에서 파생된 세포로 차별화할 수있는 능력이 있습니다. 특정 세포 유형으로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학의 분야 (예, (2-5))에 많은 관심을 생성하고,을 결정하는 방법이<em&gt; 생체내에</em선택하거나 조작 hESCs의&gt; 운명이 노력에 필수적입니다. 우리는이 목적을 위해 매우 효율적인 기형 종 형성 분석을 적응있다. 특별히 선택된 hESCs의 소수가 undifferentiated 야생 유형 hESCs과 세포 펠렛을 형성 Phaseolus vulgaris의 렉틴와 혼합됩니다. 이것은 immunodeficient 마우스에서 신장 캡슐 아래 이식할 수 있습니다. 2.5 X 10처럼 몇 가지<sup&gt; 5</sup&gt; hESCs는 16cm를 형성하는 데 필요한<sup&gt; 3</sup8~12주 이내&gt; 기형 종. 원래 선택한 hESCs의 운명은 다음 immunohistochemistry에 의해 결정하실 수 있습니다. 이 방법은 세포 기반 치료를위한 조직 특정 시약을 특성화를위한 유용한 도구를 제공합니다.

특정 세포로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학에 많은 관심을 생성했다. 우리는 결정을위한 간결하고 단계별 절차를 제공합니다<em&gt; 생체내에</em세포 기반 치료를위한 조직 특정 시약을 특성화를위한 유용한 도구를 제공합니다 선택된 hESCs의&gt; 운명.

인간 배아줄기세포(hESCs)는 무한한 자가 재생 능력을 갖추고 있으며, 세 가지 모든 배엽에서 유래하는 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.

본 절차의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기세포를 체내(in vivo)에서 분화시키고 이들의 조직 특이적 운명을 결정하는 것입니다. 이는 우선 관심 대상인 유전적으로 표지된 세포들로 펠렛을 형성함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 수술을 통해 이 펠렛을 면역결핍 마우스의 신장 피막 아래에 배치하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 세포 펠릿이 마우스 신장 캡슐 아래에서 8~12주 동안 분화하도록 두는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 생성된 테라토마를 수확하여 포르말린으로 고정하고, 면역조직화학법을 통해 표지된 세포의 운명을 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 생성된 테라토마의 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 통해 표지된 세포가 세 가지 배엽 중 하나 이상의 층으로 발달했음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 심혈관 연구소의 Harold Bernstein 박사님 연구실 소속 Carissa Ritner입니다. 오늘은 신장 캡슐 이식을 통해 테라토마를 형성하는 과정을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 배아줄기세포의 분화를 연구하기 위해 이 절차를 사용하며, 이를 통해 작업하는 각 세포주가 세 가지 배엽 모두로 분화할 수 있는지 확인하고, 유전적으로 표지된 줄기세포의 체내 운명을 추적합니다.저희가 보여드릴 모든 절차는 UCSF 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 또한, 인간 배아줄기세포와 관련된 모든 작업은 UCSF 줄기세포 연구 감독 위원회(Stem Cell Research Oversight Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 그럼 시작하겠습니다.인간 배아 줄기세포 배양 준비는 본 프로토콜의 텍스트 부분을 참조하십시오. 층류 후드(lamina flow hood) 내 작업 시, ROCK 억제제로 처리한 인간 배아 줄기세포 배양물에 1 mg/mL의 collagenase four를 처리하여 37 °C, 5% CO2 조건에서 5분 동안 배양한 후, 웰에서 collagenase four를 흡입하여 제거합니다. 이를 10% penicillin streptomycin이 첨가된 상온의 DPBS 1 mL로 교체합니다.플랫헤드 세포 리프터를 사용하여 플레이트에서 콜로니를 긁어내고, 세포 현탁액 0.5 milliliters를 두 개의 마이크로 원심분리 튜브에 각각 옮깁니다. 웰을 1 milliliter의 DPBS로 헹구고, 헹굼액 0.5 milliliters를 각 튜브에 옮깁니다. 튜브를 8,000 ×g에서 20초 동안 원심분리한 후 상층액을 흡입 제거하고, 각 펠릿을 500 µL의 신선한 DPBS와 100 µL의 1 mg/mL 용액에 재현탁합니다.세포들이 이식 시 서로 잘 결합할 수 있도록 각 튜브에 DPBS에 희석한 Fasi vulgaris lectin을 첨가합니다. 세포 현탁액을 상온에서 5분 동안 배양합니다. 8,000 ×g에서 2분 동안 원심 분리하여 펠릿을 고르게 만듭니다.로터 웰 내에서 튜브를 180도 회전시킵니다. 그 다음 8,000 ×g에서 2분 동안 다시 원심분리합니다.튜브에서 펠릿을 분리하기 위해 펠릿이 손상되지 않도록 SUP 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 펠릿이 천천히 떠오를 때까지 펠릿의 가장자리 옆에 KSR 배지 200 µL를 부드럽게 피펫팅합니다. 펠릿이 분리되면 즉시 배지를 0.4 µm 밀리셀(milli cell)로 빨아들입니다.KSR.Medium 3 mL이 들어 있는 웰에 삽입합니다. 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 2시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 저체온증을 방지하기 위해 마취된 면역결핍 마우스를 가열 패드 위에 놓습니다.수술용 가위와 아이리스 포셉(iris forceps)을 사용하여 척추와 평행하게 피부를 2.5 centimeter 절개합니다. 이때 중심에서 약간 벗어나게 절개하십시오. 갈비뼈 바로 아래, 척추에서 약 1 centimeter 떨어진 지점에서 근육을 더 작게 절개합니다.절개 부위는 신장을 끌어낼 수 있을 만큼 충분히 커야 하지만, 힘을 가하지 않고는 신장이 복강 내로 다시 미끄러져 들어가지 않을 정도로 작게 만들어야 합니다. 뭉툭한 갈고리 모양으로 늘린 파스타 피펫을 사용하여, 근육 절개창을 통해 신장을 조심스럽게 끌어냅니다. 미세 핀셋을 사용하여 신장을 주기적으로 멸균 DPBS로 적셔 취약한 피막이 건조해지는 것을 방지하십시오.신장으로부터 캡슐을 조심스럽게 당깁니다. Venice Spring Scissors를 사용하여 캡슐에 2 mm 절개창을 냅니다. 신장의 중앙 부위에서, 끝을 매우 가늘고 뭉툭하게 늘린 파스타 피펫을 캡슐과 신장 사이에 삽입하고 부드럽게 움직여 작은 포켓을 만듭니다. 신장의 반대편에도 동일하게 반복하여 총 두 개의 포켓을 만듭니다.신장의 각 극에 하나씩 배치합니다. 일회용 전송 피펫에 구경이 큰 피펫 팁을 장착하여 사용합니다. 밀리셀 인서트에서 펠릿 하나를 피펫으로 들어 올립니다.과잉 배지는 펠릿 이동을 방해할 수 있으므로 배지를 가능한 한 적게 취하십시오. 핀셋을 사용하여 신장 포켓의 가장자리를 들어 올립니다. 펠릿을 입구 옆에 조심스럽게 놓은 다음, 끝을 가늘게 만든 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 신장의 한쪽 극 방향으로 포켓 안으로 밀어 넣으십시오.반대쪽 극 방향의 포켓에 두 번째 펠렛을 넣습니다. 캡슐을 펠렛 위에 조심스럽게 다시 덮습니다. 캡슐을 닫기 위한 봉합은 필요하지 않습니다.갈고리 모양의 피펫을 사용하여 신장을 복강 내로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 근육 절개 부위는 단일 실크 봉합사로 밀봉할 수 있을 정도로 작아야 합니다. 피부를 4~5회의 단속 봉합으로 닫고, 동물이 수술로부터 회복될 수 있도록 한 뒤 수술 8~12주 후에 동물 시설로 돌려보냅니다.신장 기형종과 주변의 모든 낭종을 조직 블록 형태로 복강에서 제거하십시오. 적출된 조직 블록 전체를 10% 완충 포르말린이 담긴 50 milliliter 폴리프로필렌 튜브에 넣으십시오. 기형종을 4 °C에서 하룻밤 동안 고정하십시오.튜브에서 기형종을 꺼내 매트 위에 놓습니다. 메스를 사용하여 기형종 자체에 손상을 주지 않으면서 낭종과 가능한 한 많은 신장 조직을 절제합니다. 크기가 큰 기형종은 절제 및 포매를 용이하게 하기 위해 절반으로 자를 수 있습니다.표준 파라핀 고정법을 사용하여 기형종을 처리하고, 분석 및 이미징을 위해 슬라이드에 절편을 염색 및 마운팅합니다. 자세한 내용은 프로토콜의 텍스트 부분에 있는 노트를 참조하십시오. 여기서는 전형적인 기형종의 조직 절편을 보여드리겠습니다.이 기형종은 배아 조직을 식별하기 위해 hematoxylin과 eosin으로 염색되었으며, 세 가지 배엽 모두를 대표하는 조직과 vector derm을 대표하는 초기 신경관 구조를 보여줍니다. 이 절편은 또 다른 vector derm의 예인 원시 편평 상피를 보여줍니다. 여기에서 응축된 중간엽 캡슐로 둘러싸인 연골은 배아 중간엽에서 유래한 조직을 나타냅니다.마지막으로, 선성 장 구조를 보여주는 이 섹션은 테라토마 내의 내배엽 조직을 나타냅니다. 유전적으로 표지된 줄기세포의 운명을 파악하기 위해, 야생형과 CD 1 33 양성 인간 배아줄기세포 혼합물을 테라토마에 접종했습니다. 화살표로 표시된 CD 1 33 양성 유래 세포들은 배아 외배엽에서 유래한 조직, 특히 신경 상피와 초기 신경관 유사 구조에서 관찰되었습니다. 저는 Harold Bernstein 박사입니다.Carissa가 인 비보(in vivo) 발달 분석을 위해 인간 배아 줄기 세포 배양물로부터 테라토마를 형성하는 방법을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때는 세포를 주의 깊게 다루고 무균 조작법을 준수하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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