Name: 세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 식물 세포벽 다당류의 OLIMP 분석법으로 MALDI-TOF 질량분석을 활용한 글리코구조 프로파일링 기술을. 이 방법은 고감도 고속 분석이 가능하여 바이오연료 생산 등 생명공학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 에너지 Biosciences 연구소 부여 OO0G01에 의해 투자되었다.

OLIMP 방법은 glycosylhydrolase으로 endoglucanase를 사용하여 dicot 식물, xyloglucan의 세포 벽에있는 주요 hemicellulose에 exemplified입니다. 방법은 식물 조직 소스로 전체 Arabidopsis 모종로 증명됩니다. 효소와 세포외 매트릭스 물질은 동일한 절차를 사용하여 원하는 분석에 따라 대체하실 수 있습니다. 1. 세포 벽 절연 <ol><li> 하베스트 오 5 일 이전 전체 Arabidopsis 모종이나 원하는 자료의 상당 금액 및 1.5mL 반응 관에 그들을 전송합니다. 자료가 튜브의 아래쪽에 배치되었는지 확인합니다. </li><li> 액체 질소의 샘플 및 스냅인 동결 위에 반응 관에 두 3mm 금속 공을 추가합니다. </li><li> 볼 - 밀 (2시 반 분, 25Hz)를 사용하여 냉동 샘플을 분쇄. </li><li> 샘플에 1mL 70% 수성 에탄올을 추가합니다. 자석을 사용하여 금속 공을 제거합니다. 철저히 와동. </li><li> 펠렛에 10 분 세포 벽 재료가 들어있는 알코올 불용성 잔류물을 위해 14,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거하십시오. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1mL를 추가합니다. 펠렛을 resuspend에 철저 와동. </li><li> 10 분 14,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거하십시오. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 농축기를 사용하여 샘​​플을 건조시킵니다. </li></ol> 2. oligosaccharides의 Solubilization <ol><li> solubilization에 대한 oligosaccharides의 형태로 특정 다당류는 적절한 버퍼 25μl의 건조 펠렛을 resuspend. endoglucanase 50mM 질산 편대, pH4.5을 ​​위해 사용됩니다. endoglucanase의 0.2U를 추가합니다. 아래 소용돌이 서스펜션과 스핀 액체. </li><li> 37 16h에 대한 샘플을 품어 ° C를 인큐베이터에서 300rpm에서 떨고. </li><li> 농축기를 사용하여 소화 (물)의 용매를 제거합니다. </li></ol> 3. 출시 oligosaccharides의 든 - TOF 분석 <ol><li> BioRex MSZ 501의 양이온 교환 수지 비즈는 소화 샘플에서 소금과 효소를 제거하는 데 사용됩니다. 빈 열에 나누어지는을 배치하고 물을 풍부한 양의으로 구슬을 씻는하여 조건 비즈 있습니다. </li><li> 소화와 말린 예제 5-10 BioRex 비즈를 추가합니다. 그런 다음 물 재료 5μl 작은 양의 사용할 수 있습니다위한 물 10μl를 추가합니다. 간단히 튜브를 회전하여 솔루션 비즈 젖어. 상온에서 적어도 10 분에 대해 품어. </li><li> 든 대상 플레​​이트에 자리 2μl 매트릭스 (2,5 - dihydroxybenzoic 산성 (DHB), 물에 10mg/ml). 동질 매트릭스 화학 크리스탈로 이어지는 진공 하에서 용매 매트릭스를 증발. </li><li> 대상 접시 매트릭스 결정 위에 desalted 샘플 솔루션의 스팟 2μl. 이 샘플의 많은 지점하려는 경우에만 3min의 최대 야생 계속. 이 시간 프레임은 최초의 발견 샘플 아직 건조되지 않도록합니다. 마지막으로 발견 샘플에서 다시 용해 매트릭스와 샘플 올리 고당 분자의 철저한 혼합을 보장하기 위해 추가 2min 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 다음 진공에서 대상 번호판을 건조. 샘플 / 매트릭스 믹스는 동질적인 결정을 활성화 1min 이하에서 구체화한다. </li><li> 든 - TOF 질량 분석기로 대상 플레​​이트 플레이스. 기계 20000V의 가속 전압과 350 nm의의 지연 긍정 reflectron 모드로 설정되어야하며 선택된 질량 범위 (수가 예상 oligomers에 따라 변경) 500-3000 다해야합니다. 레이저를 쏘면서 시작하고 대표적인 평균 스펙트럼 (그림 2A)를 생성하는 컴파일 샘플 당 100-200 스펙트럼을 수집합니다. 특정 oligosaccharides를 나타내는 이온은 요금 (M / Z) 비율을 통해 그들의 질량에 의해 확인할 수 있습니다. 관심의 이온의 이온 농도 (최대 높이)는 샘플의 각 올리 고당의 상대적인 풍부 (그림 2B)로 인해 100 %까지 추가되어야합니다. </li></ol> 4. 원위치 OLIMP 분석 OLIMP는 모든 벽 준비 단계를 생략 조직에 직접 사용될 수 있습니다. 식물 조직 소스가 사용하는 같은 예제는 Arabidopsis의 hypocotyls을 etiolated으로. 다시 endoglucanase는 hemicelluloses의 xyloglucan의 구조를 결정하는 데 사용됩니다. 효소 및 조직 재료는 동일한 절차를 사용하여 원하는 분석에 따라 대체하실 수 있습니다. <ol><li> etiolated 묘목을 수확하고 비어 든 대상 플레​​이트에 그것을 장소와 묘목이 건조하게. </li><li> 원하는 위치에 말린 세들링에 0.5μl endoglucanase을 (50mM 질산 편대에 녹아있는 0.4U/μl, pH4.5)을 추가합니다. 효소 드롭 타겟 플레이트 부분적으로 접촉되었는지 확인합니다. </li><li> 피하기 위해 포화 습도와 닫힌 용기에 든 대상 플레​​이트를 삽입하는 효소 드롭 마른 아웃. 1 챔버에서 번호판을 품어37 6h가 ° C. </li><li> 식물 조직과 진공에서 효소 드롭으로 든 대상 플레​​이트를 건조시킵니다. </li><li> 각 건조 효소 자리 위에, 0.5μl 매트릭스 (10mg / L DHB) 추가합니다. 그것이 2min에 대한있게 해줘요. </li><li> 진공에서 든 대상 플레​​이트를 건조시킵니다. </li><li> 든 - TOF와 샘플을 분석할 수 있습니다. 든 - TOF 질량 분석기로 조직과 효소 / 매트릭스 지점 (S)와 타겟 플레이트 플레이스. 기계 20000V의 가속 전압과 350 nm의의 지연 긍정 reflectron 모드로 설정되어야하며 선택된 질량 범위 (수가 예상 oligomers에 따라 변경) 500-3000 다해야합니다. </li><li> 조직 옆에 매트릭스 / 샘플 결정에 레이저를 발사 시작합니다. 이 같은 분자의 비행 -의 시간이 끝날거야 이런 경우에, 조직 자체에 충돌하지 않도록합니다. 대표 평균 스펙트럼 (그림 3)을 생성하는 컴파일 장소, 당 20-50 주위 스펙트럼를 수집합니다. 특정 oligosaccharides를 나타내는 이온은 요금 (M / Z) 비율을 통해 그들의 질량에 의해 확인할 수 있습니다. 이온 농도 (이온 높이)를보고 수 있으며, 관심있는 모든 이온이 예제에서 각 oligosaccharides의 상대적인 풍부 결과 100 %까지 추가되어야합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 Arabidopsis 모종에있는 hemicelluloses의 xyloglucan의 OLIMP 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이온의 질량 차이 및 알려진 잘 특징 효소로 인해 (endoglucanase) 특이성은 이온은 특정 올리 고당 구조 (그림 2A)에 할당할 수 있습니다. 분명히, 구조 isomers는 구별되지 않습니다. 다양한 oligosaccharides의 상대적인 풍요의 결정에 대한 기본 가정은 (그림 2B)은 질량 분석기를 응답 계수 이러한 oligosaccharides 매우 비슷하다고합니다. 여기에 그림과 같이, OLIMP 부량는 매우 재현할 수 있습니다. 그러나, 방법의 견고는 각종 올리 고당 이온의 잡음 비율로 신호에 크게 의존된다는 점에 유의하시기 바랍니다. 예를 들면 소금이나 oligosaccharides의 낮은 금액과 오염은 비율을 줄일 수 있습니다. 조직 자체 (현장 분석)에 OLIMP 분석은 매우 작고 정의된 영역의 연구를 가능하게하고 아주 작은 샘플 준비 포함됩니다. 예제에 정성 (동일 이온)는 (그림 3) 여기에 제시 아니지만 양적 차이는 (이온 농도의 변화) Arabidopsis 묘목의 촬영 및 루트 - 조직 사이에 관찰되었다. OLIMP - 방법 Permutations 따라서 조직 "이미지"가 발생할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 플랜트 원본으로 전체 Arabidopsis의 모종을 사용하여 OLIMP 절차의 플로우 차트. 첫째, 조직이 분해되고 세포 벽 재료 (사진 후지노 외에서 수정되었습니다. 10) 준비가되어 있습니다. 그런 다음 특정 벽면 다당류의 oligosaccharides은 특정 하이드롤라제를 사용하여 발표하고 있습니다. 마지막으로, 가용성 oligosaccharides의 상대 abundances이 든 - TOF 질량 분광법을 사용하여 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. OLIMP에 의해 결정으로 Arabidopsis에서 etiolated 모종의 xyloglucan의 oligosaccharides의 상대 풍부. A) 대표 xyloglucan 올리 고당 질량 스펙트럼, 각 이온이 특정 올리 고당 구조를 나타내고, 구조 isomers는 구별되지 않습니다. 상대 올리 고당 풍요의 결정에 대해 B) 해당 막대 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 예로 Arabidopsis의 etiolated 모종을 사용하여 현장 OLIMP 분석. 각 효소 / 소화 소적 (유색 원)는 독립적으로 분석할 수 있으며 해당 질량 스펙트럼을 얻을하고 분석할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. xylanase (Megazyme)와 Miscanthus 리프 자료를 소화하여 얻은 hemicellulose의 크실란의 OLIMP 스펙트럼.

<ol><li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li>
<li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li>
<li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xyloglucan-specific+endo-beta-1%2C4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus%3A+expression+cloning+in+yeast%2C+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li>
<li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa%3A+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation%3A+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+%22%5BJournal%5D)">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1%2C2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li>
<li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li>
<li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils%2C+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li>
<li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li>
<li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan%2C+a+major+primary+cell+wall+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li>
<li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+liquid+chromatography%2C+capillary+electrophoresis%2C+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 OLIMP 메서드는 세포외 매트릭스에 존재 폴리머 매우 민감하고 신속한 분석이 가능합니다. OLIMP는 이후 든 - TOF 분석 oligomers의 효소 릴리스를 결합한 제품입니다. 든 - TOF 스펙트럼의 세대 미만 분 소요, 따라서 OLIMP는 돌연변이 스크린으로 높은 처리량 연구를 포함한 어플 리케이션의 광범위한 적합합니다. OLIMP는 식물의 다당류에 제한된 것은 아니지만 잠재적으로 특정 가수 분해 효소의 가용성에 의해 제한 고분자의 다양한 적용할 수 있습니다. 그러나, OLIMP의 제한은 폴리머의 절대 풍부를 얻을 수 없다는 것입니다. OLIMP가 종 다양성의 세포외 기질에 존재 다당류의 다양한 구조를 연구하는 데 사용할 수있는 이전처럼 언급했다. 예를 들어, 그림 4는 잔디 종의 주요 hemicellulose, 크실란의 OLIMP 스펙트럼을 나타냅니다. 여기, 온대 잔디 Miscanthus에서 파생된 세포 벽 재료는 xylanase를 사용하여 소화했다.

<table><tbody><tr><td>2,5-디하이드록시벤조산(2,5-dihydroxybenzoic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>water 내 10mg/mL</td></tr><tr><td>BioRex MSZ 501(D) 수지(Resin)</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>엔도글루카나제(Endoglucanase)</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Xylanase M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>3mm 금속 볼</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>비트 밀(Beat mill)</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>MALDI 타겟 플레이트</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>진공 매니폴드</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

세포외 다당류의 oligo 질량 프로파일 (olimp)

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

환경에 세포의 직접 접촉은 세포외 기질로 많은 생물의 중재입니다. 세포외 매트릭스 중 하나는 일반적인 측면들은 복잡한 설탕 glycoproteins 형태의 moieties, proteoglycans, 및 / 또는 다당류를 포함한다는 것입니다. 예 원섬유의 단백질과 proteoglycans 또는 식물과 곰팡이의 다당류 기반의 세포 벽 주로 구성된 인간과 동물 세포의 세포외 기질과 proteoglycan / 박테리아의 glycolipid 기반의 세포 벽을 포함합니다. 이러한 모든 glycostructures는 휴대 전화 및 휴대 환경 통신 및 신호에서 중요한 역할을 재생합니다. 세포외 기질의 특별한 복잡한 예제는 높은 식물 세포의 벽에 속해 있습니다. 그들의 벽이 최대 75% 건조 중량, 당분의 거의 전적으로 만들어진,이 지구상에서 존재하는 가장 풍부한 biopolymers 구성되어 있습니다. 따라서, 연구는 화석 연료에서 파생 석유를 대체할 수있는 탄소 중립 재생 자원으로 최고 이러한 자료를 활용하는 방법을 실시합니다. 연료 전환의 주요 과제는이 독특한 biocomposite에있는 독특한 glycostructures에 의한 효소 또는 화학적 열화에 벽의 말을 안들음 남아 있습니다. 여기, 우리는 식물 세포 벽의 glycostructures의 신속하고 민감한 분석을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)은 (MALDI-TOF/MS 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 시간의 기내 질량 분석법을 사용하여 특정 glycosylhydrolases 및 solubilized 올리 고당 혼합물의 후속 분석을 촉진 벽 자료에서 oligosaccharides의 효소 릴리스를 기반으로합니다 1) (그림 1). OLIMP은 전체 분석에 대해서만 5,000 세포의 벽이, 조직 자체 2 수행할 수 있어야하고, 높은 처리량 분석 3 의무가 있습니다. solubilized oligosaccharides의 절대 금액이 OLIMP에 의해 결정되지 않을 수 있지만 각종 올리 고당 이온의 상대적인 풍부가 벽에 현재 기본 다당류의 대체 패턴에 대한 통찰력을주는 질량 스펙트럼에서 delineated 수 있습니다. OLIMP은 특정 효소 4의 가용성에 의해 제한 벽 폴리머의 다양한 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 식물 세포 벽의 효소에있는 폴리머의 분석을 위해 엔도 - β - (1-4) - xylanase 6,7을 사용하여 xyloglucanase 5, 11, 12, 13, 크실란를 사용하여 hemicelluloses의 xyloglucan을 분석하실 수 있습니다 또는 polygalacturonase와 methylesterase 8 조합을 사용하여 pectic 다당류하십시오. 또한, OLIMP glycosylhydrolase 심지어 glycosyltransferase 활동의 동일한 원리를 사용하는 것은 감시하고 9 결정하실 수 있습니다.

빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

많은 생물체에서 세포와 환경의 직접적인 접촉은 세포외 기질에 의해 매개됩니다. 세포외 기질의 한 가지 공통적인 특징은 ...

여기서 보여주는 올리고 당량 프로파일링(oligo mass profiling) 또는 Olympic 실험을 통해 생물체 세포벽이나 세포외 기질 내 폴리머의 구조에 대한 빠른 통찰을 얻을 수 있습니다. 본 사례에서는 먼저 70% ethanol로 세포 성분을 제거하여 식물 묘종으로부터 세포벽을 준비합니다. 그다음 표적 벽 폴리머를 특정 하이드롤라제(hydrolase)로 소화시켜 특정 벽 성분을 올리고머 형태로 가용화합니다.대안적인 접근법은 조직 상에서 직접 C two의 효소로 세포벽을 소화시키는 것입니다. 방출된 리간드의 상대적 풍부도는 MALDI 질량 분석법과 통계 분석을 통해 결정됩니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 버클리의 에너지 생명과학 연구소(Energy Biosciences Institute) 소속 Marcus Polly입니다.안녕하세요, 저는 Marcus Re입니다. 그리고 저는 Energy Biosciences Institute 소속인 Asha Giller입니다. 생물체는 생물 종에 따라 복잡한 폴리머 네트워크로 구성된 세포외 기질로 둘러싸여 있습니다.세포외 기질을 빠르고 민감하게 평가하는 방법으로, 오늘은 저희가 oli mass profiling(oleum의 약칭)이라고 부르는 방법을 보여드리겠습니다. 이 절차는 식물 조직에서 직접 수행할 수도 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.식물 조직의 세포외 기질 또는 세포벽을 분리하여 이 절차를 시작하십시오. 애기장대 묘 5개 또는 그에 상응하는 양의 다른 식물 재료를 수확하여 1.5 milliliter 반응 튜브에 옮깁니다. 재료가 튜브 바닥에 위치하도록 하십시오.반응 튜브에 3mm 금속 볼 2개를 넣고 액체 질소에서 급속 냉동합니다. 그 다음 볼 밀을 사용하여 냉동된 샘플을 25Hz에서 2.5분 동안 분쇄합니다. 재료를 분쇄한 후, 샘플에 70% 수성 에탄올 1mL를 첨가합니다.자석을 사용하여 금속 구슬을 제거하고 충분히 볼텍싱합니다. 이 처리를 통해 대부분의 단백질과 세포 소기관이 가용화됩니다. 샘플을 14,000 RPM에서 10분 동안 원심 분리하여 세포벽 물질을 나타내는 알코올 불용성 잔해를 펠렛으로 침전시킵니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.튜브에 남아 있는 펠릿에 1 mL의 클로로포름 메탄올 용액을 첨가하고 볼텍스로 충분히 혼합합니다. 펠릿을 재현탁한 후 원심분리하면 클로로포름 메탄올이 지질과 같은 소수성 화합물을 추출합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고 진공 원심분리기를 사용하여 펠릿을 완전히 건조시킵니다. 이로써 세포벽 물질의 분리가 완료되며, 이제 이를 처리하여 특정 리간드를 얻을 수 있습니다.여기서 시연하는 예시는 Arabidopsis와 같은 쌍떡잎식물의 세포벽에 존재하는 주요 헤미셀룰로오스인 Xlo glucan의 가용화입니다. Xlo glucan은 다른 당 잔기가 다량 치환된 글루칸 백본으로 구성된 폴리머입니다. 이 폴리머를 가용화하기 위해 곰팡이 유래 endo glucan을 사용하여 해당 헤미셀룰로오스를 가용화합니다. 건조된 분리 세포벽 펠렛을 25 µL의 50 mM ammonium formate (pH 4.5)에 재현탁하고 0.2 units의 endo gluconate를 첨가합니다. 현탁액을 볼텍싱한 후 원심분리하여 액체를 가라앉힙니다.튜브를 믹서에 넣고 37 °C에서 300 RPM으로 흔들어주며 16시간 동안 세포벽을 소화시킵니다. 분리된 세포벽의 소화가 완료되면, 진공 원심분리기를 사용하여 용매를 제거하고 질량 분석법으로 방출된 올리고당을 분석합니다. 소화된 시료 내의 염과 효소는 Biox MSD 5 0 1의 양이온 교환 수지 비드를 사용하여 제거합니다.먼저 필요한 양의 비즈를 빈 컬럼에 넣고 다량의 물로 세척하여 컨디셔닝합니다. 소화 및 건조된 샘플에 컨디셔닝된 biox cation 비즈 5~10개를 추가합니다. 그 다음, 시료의 양이 적은 경우에는 물 10 µL를 추가합니다.5 µL의 물을 사용할 수 있습니다. 튜브를 짧게 원심 분리하여 비드를 용액에 담근 후, 소화 과정이 비드와 함께 진행되는 동안 실온에서 최소 10분 동안 배양합니다. MALDI 타겟 플레이트에 2 µL의 DHB 매트릭스를 점적합니다.진공 상태에서 매트릭스 용매를 증발시켜 매트릭스 화학 결정을 형성한 후, 탈염된 소화액 2 µL를 타겟 플레이트의 매트릭스 결정 위에 점적합니다. 샘플 매트릭스 점적물의 용매를 다시 진공 상태에서 증발시킵니다.함께 제공된 서면 프로토콜에 자세히 설명된 대로, 결정화 전 샘플 매트릭스 액체를 혼합하는 적절한 시간을 유지하는 것이 중요합니다. 샘플이 건조되면 타겟 플레이트를 MALDI 질량 분석계에 넣으십시오. 기기를 양이온 모드로 설정하고, 가속 전압은 20,000 volts, 지연 시간은 350 nanometers로 설정하십시오.이 헤미셀룰로오스 리간드의 선택된 질량 범위는 500에서 3000 Dalton입니다. 질량 범위는 예상되는 리간드의 크기에 따라 수정해야 합니다. 레이저 조사를 시작하여 샘플당 100에서 200개의 스펙트럼을 수집하며, 이를 취합하여 대표 평균 스펙트럼을 생성합니다.이것은 헤미셀룰로오스(Hemi cellulose)의 oly 스펙트럼입니다. 본 영상에서 시연하는 oly 방법은 세포벽 준비 단계를 생략하고 식물 조직에 직접 적용할 수도 있습니다. 이러한 in situ 분석 절차를 암조건에서 성장시킨 애기장대(arabidopsis) 유묘를 통해 시연합니다.검체를 타겟 플레이트 위에 직접 올려놓고, 플레이트 위의 묘목이 건조될 때까지 공기 중에서 건조시킵니다. 원하는 위치에 적절한 효소 버퍼 믹스 0.5 µL를 첨가합니다. 이때 효소 방울이 조직과 타겟 플레이트에 부분적으로 접촉하도록 하십시오.효소 방울이 마르는 것을 방지하기 위해 MALDI 타겟 플레이트를 포화 습도가 유지되는 밀폐 용기에 넣습니다. 플레이트를 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 진공 상태에서 효소 반점을 건조시키고, 건조된 각 효소 반점 위에 0.5 µL의 액체 DHB 매트릭스를 첨가합니다.그 다음 MALDI 타겟 플레이트를 진공 상태에서 건조합니다. NC의 두 샘플을 분석하기 위해, 조직 표본 효소 매트릭스 스팟이 포함된 타겟 플레이트를 MALDI 질량 분석기에 넣고, 분리된 세포벽 샘플과 동일한 설정을 사용하여 질량 스펙트럼을 기록합니다.매트릭스에 레이저 조사를 시작하십시오. 조직 옆의 샘플 결정을 측정하십시오. 조직 자체를 직접 조사하지 않도록 주의하십시오. 조직에 레이저가 닿을 경우 분자의 비행 시간(time of flight)에 오차가 발생할 수 있습니다.지점당 약 20~50개의 스펙트럼을 수집하고 이를 취합하여 대표 평균 스펙트럼을 생성합니다. 이것은 AOPs에 존재하는 HemosIL 글루칸 유래 올리고당의 대표 평균 스펙트럼입니다. 관심 있는 모든 이온의 이온 강도 또는 이온 높이를 합산하여 100%로 환산함으로써 다양한 올리고당의 상대적 함량을 산출합니다.NC two OMP 방법의 결과 역시 유사하게 나타납니다. 색깔 있는 원으로 표시된 각 효소 소화 드롭렛은 독립적으로 분석할 수 있으며, 그에 상응하는 질량 분석 스펙트럼을 얻어 분석할 수 있습니다. 적절한 가수분해 효소가 있다면 세포외 기질의 다른 폴리머에 대해서도 Oola를 수행할 수 있습니다.예를 들어, 이것은 바이오 에너지 작물에 존재하는 hemo cellulose cylin의 oola 스펙트럼입니다. mecampus 잎에서 얻은 시료를 xin으로 소화시켜 제시된 데이터를 얻었습니다. 이온의 구조 할당에 대해서는 첨부된 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.지금까지 exo cellular metrics의 올리고머 질량 프로파일링 절차를 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, OV MS 분석을 위해 균질한 매트릭스 결과가 얻어졌을 때 최상의 결과를 얻을 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

출처: Hu, Y. 외. 시험관 욕조 발효 시스템을 이용한 내생제와 인간 장내 미생물 간 상호작용 분석. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 인간 대변 미생물군에 의한 외계다당류(EPS) 분해를 평가하기 위해 얇은 층 크로마토그래피(TLC)를 사용하는 방법을 시연합니다. 발효 상청액의 EPS 조각은 크기와 극성에 따라 TLC를 사용해 분리한 후, 탄수화물 특이적 염색 후 색이 있는 띠로 시각화됩니다.

박테리아 외계다당류 분해를 평가하기 위한 얇은 층 크로마토그래피 수행

O-결합 글라이칸의 다양성을 종합적으로 탐구하기 위해 과메틸화 및 신속한 상 분할 방법과 결합된 겔 내 환원적 β-제거를 위한 새로운 절차를 SDS-PAGE에 의해 분해되고 질량 분석법에 의한 후속 글리코마이크 분석이 가능한 당단백질에서 직접 방출되는 O-결합 글라이칸의 분석에 적용됩니다.

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

우리는 소규모로 미생물 외다당류의 식별 및 특성화를 위한 자동화된 모듈식 고처리량 방법을 제시합니다. 이 방법은 빠른 사전 선택을 결합하여 분비된 다당류의 총량을 상세한 탄수화물 지문과 결합하여 새로 분리된 박테리아 균주 또는 전체 균주 수집을 빠르게 스크리닝할 수 있습니다.

자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

이 프로토콜은 효소(엔톡실라나아제) 가수분해 전에 RE에 2개의 아미노벤즈아미드를 태그한 다음 질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 결과 올리고당을 분석함으로써 헤테록실란의 말단(RE) 및 내부 영역 글리코실 서열의 구조적 특성화에 사용되는 특정 기술을 설명합니다.

효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속

이 논문은 ECM 단백질 조성물 (1) 분석, 글리코 실화 부위 (2)의 식별 및 당쇄 형태 (3)의 조성 특성을 허용 MS 분석 심혈관 조직 샘플을 제조하는 방법을 설명한다. 이 방법은 다른 조직의 ECM의 연구에, 약간의 수정으로 적용 할 수 있습니다.

세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

여기에서는 뮤신에서 O-글리칸을 방출하고 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용한 후속 탈염, 과메틸화 및 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight 질량 분석기

배우세요 식물 세포벽 다당류의 OLIMP 분석법으로 MALDI-TOF 질량분석을 활용한 글리코구조 프로파일링 기술을. 이 방법은 고감도 고속 분석이 가능하여 바이오연료 생산 등 생명공학 연구에 활용됩니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

더 많은 동영상 탐색