유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Cal pain은 어디에나 존재하며, 세포 내 칼슘에 민감하고, 중성 시스테인 프로테아제는 신호전달, 세포골격 리모델링, 유전자 발현 조절, 세포사멸 및 세포주기 진행을 포함한 많은 생리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 고정되어 있고 살아있는 세포에서 calpain 활성을 측정하기 위해 형광 기질 BUC, LMC MAC이 추가됩니다. Buc LMC MAC은 칼파인에 의해 특이적으로 절단되어 형광이 증가합니다. 형광의 변화는 유세포 분석법으로 모니터링되며, 이를 통해 정상 cyte와 비교하여 30개의 2D kit 세포에서 cal pain activity가 증가한 것으로 나타났습니다.

안녕하세요, 저는 토론토 대학의 면역학과 및 대학 보건 네트워크의 스튜어트 버거 박사 실험실의 크리스티나 파(Christina Farr)입니다. 오늘은 유세포 분석 기반 분석을 사용하여 고정 세포와 살아있는 세포에서 cal pain activity를 측정하는 방법을 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 분석을 사용하여 백혈병과 림프종 세포의 cal pain activity를 조사합니다.

시작하겠습니다. 실험을 시작하기 전에 검출 시약 1%PARAFORM 알데히드 cal 통증 억제제 PD 1 50 0 6 0 6 및 MEC 1 억제제 PD 9 8 0 5 9를 포함하여 필요한 시약을 준비합니다. 이러한 시약의 준비에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 서면 프로토콜 Eloqua 1ml의 1%파라 포름알데히드를 각 팩스 튜브에 참조하십시오.

이 비디오에 표시된 고정 셀에 대한 각 실험 조건에 대해 3개의 팩스 튜브가 필요합니다. 세 가지 조건을 테스트하므로 9개의 팩스 튜브가 필요합니다. 최적 배지에서 성장한 밀리리터당 6개의 세포 중 10개의 0.5에서 10을 곱한 32개의 dki 세포로 시작합니다.

소 태아 혈청, IL, 3종양 캡토, 에탄올 및 항생제가 보충되었습니다. 6개의 셀에 10을 곱하여 4번 3개의 15밀리리터 팔콘 튜브 각각으로 이동합니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 섭씨 15도에서 225Gs로 5분 동안 회전하여 펠릿화합니다.

원심분리기제 흡입 후, snat은 실온 2ml에서 세포를 재현탁시키고, PBS는 50마이크로몰 cal 통증 억제제 PD 1, 50, 0, 6, 0, 6으로 하나의 세포 현탁액을 처리합니다. 샘플이 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오.amp튜브를 알루미늄 호일로 덮어 보호하십시오. Vortex: Briefly: 그런 다음 어두운 곳에서 실온에서 20-30분 동안 배양합니다.

두 번째 세포 현탁액을 20 마이크로몰 me 1 억제제 PD 9 0 5 9로 처리합니다. 35mm 조직 배양 접시에 세포를 플레이트화하고 샘플이 배양되는 동안 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 처리되지 않은 샘플에 대해 cal Calpain 분석을 시작합니다.

세포 현탁액에 2ml의 검출 시약을 추가하는 것으로 시작합니다. 즉시 1ml의 세포 현탁액 검출 시약 혼합물을 이전에 준비된 팩스 튜브에 추가하여 T equals zero 샘플을 생성합니다. 검출 시약으로 세포 현탁액을 5분 동안 배양합니다.

실온에서 1ml의 세포 현탁액 검출 시약 혼합물을 이전에 준비된 팩스 튜브에 1%파라폼 알데히드 1ml와 함께 추가하여 T가 5개의 샘플과 같아 생성합니다. 검출 혼합물이 있는 나머지 세포 현탁액을 실온에서 추가로 5분 동안 계속 배양합니다. 5분 후 또 다른 1ml의 세포 현탁액을 1mL의 1% Paraform aldehyde가 있는 준비된 팩스 튜브로 옮깁니다.

이것은 T가 10분 시간 지점과 같습니다. 다음으로, 억제제로 처리된 30개의 2D 키트 세포에 대해 cal pain assay를 반복합니다. 알루미늄 호일로 랙을 덮습니다.

다음날 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 세포를 고정합니다. 세포를 섭씨 15도에서 5분 동안 725Gs로 원심분리하여 펠릿화합니다. 스핀 후 상등액을 흡인하고 750 마이크로 리터의 PBS에 세포를 재현탁시킵니다.

세포를 얼음 위에 놓고 유세포 분석을 수행할 때까지 어두운 곳에 보관합니다. 여기. 고정 셀에 대한 데이터 수집이 시연됩니다. LSR 2를 사용하여 유세포 분석을 수행합니다.

기판 및 제품에 대해 각각 405 및 450 나노미터의 방출로 광파 ex excite 또는 UV 레이저 excitation line의 필터를 355 나노미터로, 레이저 출력을 25 milliwatts로 설정합니다. 기판 및 제품에 사용되는 BAM 패스 필터는 405 이상 20 및 450이어야 합니다. substrate 및 product에 대한 50개 이상의 longpass filter는 405 및 450이어야 합니다.

PMT 전압을 기판의 경우 350에서 375로, 제품의 경우 325에서 350으로 설정합니다. 다음 매개 변수를 사용하여 BD 팩스 diva 실험을 설정합니다. 전방 산란 측면 산란 인도 : 로그 스케일을 사용하는 파란색 하나와 보라색 하나.

또한 워크시트에서 로그 척도를 사용합니다. 다음 그래프를 설정합니다. 살아있는 세포에 게이트가 있는 전방 산란 대 측면 산점도 그래프.

Indo one blue 히스토그램, Indo 1 violet 히스토그램 및 Indo one blue 대 Indo one Violet dot plot은 line flow 및 line flow plus fluorescent beads로 LSR two를 보정합니다. PMT 전압은 모든 실험 전에 비드 형광 히스토그램의 피크를 동일한 채널에 배치하도록 조정해야 합니다. 0분 시점에서 30개의 2D 키트 셀을 사용하여 데이터 수집을 시작합니다.

매개변수 볼륨을 조정하십시오.tages 필요에 따라. A는 샘플당 10, 000개의 이벤트를 획득하고 기록합니다. 팩스 버퍼로 기기를 헹구고 각 샘플에 대해 수집을 반복합니다.

데이터 수집 후 데이터를 내보냅니다. LSR 2가 연구소 지침에 따라 청소되었는지 확인하십시오. 검출 시약 또는 cal 통증 억제제를 첨가하지 않고 이전과 같이 세포 현탁액을 준비합니다.

샘플을 LSR 2로 가져오고 이전과 같이 필터와 매개변수를 설정합니다. 이전과 같이 워크시트를 설정합니다. 인도 하나의 파란색 대 시간을 보여주는 큰 점 그림을 포함합니다.

최대 이벤트 수를 획득하도록 프로그램을 설정합니다. 정지 게이트가 없습니다. 32G 키트 세포의 한 세포 현탁액에 50마이크로몰의 cal pain inhibitor를 추가합니다.

검체를 어두운 곳에 보관하고 세포가 배양하는 동안 20-30분 동안 실온에서 배양합니다. cal 통증 억제제가 없는 30 2D 키트 세포 현탁액에 대한 데이터 수집을 시작합니다. 초당 200-300개의 이벤트의 낮은 유속을 사용합니다.

30초에서 1분 후에 기계에서 튜브를 제거합니다. Bach LMC mac 20마이크로몰을 세포에 추가합니다. 이것이 검출 시약입니다.

그것은 calpain에 의해 특이적으로 절단되며 그 분열은 기질 형광 소용돌이의 증가를 초래합니다. 간단히 그런 다음 데이터 수집을 계속합니다. 10-20분 동안 또는 통증 활동이 안정될 때까지 데이터를 수집합니다.

다음으로, cal pain inhibitor로 처리된 32개의 gki 세포로 획득을 반복합니다. 완료되면 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 마우스 비장에서 생성된 세포 현탁액으로 혼합 세포 분석을 시작합니다.

각 세포 현탁액을 둘로 나눕니다. 하나의 세포 현탁액을 50마이크로몰의 cal pain inhibitor로 치료하고 호일로 덮고 어두운 곳에서 실온에서 20-30분 동안 배양합니다. 고정 세포에 대해 앞서 설명한 대로 calpain 분석을 수행한 후 튜브를 호일로 덮고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날, 섭씨 15도에서 5분 동안 725Gs로 원심분리기합니다. 상층액을 흡인하고 500 μl의 PBS로 세포를 세척하고 상등액을 다시 흡인하고 200 μl의 염색 완충액에 세포를 2% BSA로 재현탁시켜 실온에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 여기에 1차 항체인 ZI anti-US를 준비합니다.

CD one 17은 최종 희석액이 1 대 200이 되도록 염색 완충액에서 제조된다. 항체가 어두운 곳에 보관되어 있는지 확인하십시오. 200마이크로리터의 1차 항체를 세포에 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 400마이크로리터의 PBS를 첨가하여 유세포 분석의 부피를 증가시킵니다. 세포를 얼음 위에 놓고 어두운 곳에 보관하십시오. 고정 세포에 대해 표시된 것과 동일한 유세포 분석 절차를 사용하여 데이터를 수집합니다.

매개변수에 ZI를 추가하고 유세포분석기에서 데이터를 수집한 후 워크시트에 ZI에 대한 히스토그램을 포함합니다. 전방 및 내부 산란 프로파일을 기반으로 살아 있는 세포에서 FlowJo 보행을 사용하여 분석합니다. 생존 가능한 세포 게이트에서 Indo Blue의 평균 형광을 측정합니다.

이 플롯에서 빨간색 선은 0분 시점의 평균 기질 형광을 나타내고 파란색 및 녹색 선은 5분 및 10분의 평균 기질 형광을 나타냅니다. 혼합 세포 집단의 경우 히스토그램 및 점도표에서 FXI 형광을 사용하여 30개의 2D kip 집단을 식별합니다. 30개의 2D kip 모집단의 엔도 블루에 대한 평균 형광을 결정합니다.

마지막으로 Microsoft Excel을 사용하여 평균 형광을 그래프로 표시합니다. 5분에서 10분 사이의 선 기울기를 계산합니다. 기울기를 막대 그래프로 표시하여 세포의 cal pain activity를 확인합니다.

여기에 표시된 데이터는 30개의 2D 세포가 높은 수준의 cal pain activity를 가지고 있으며 cal pain activity가 MEK 억제제에 의해 억제될 수 있음을 나타냅니다. 우리는 방금 고정된 세포와 살아있는 세포에서 cal pain 활동을 측정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 기술을 수행할 때 LSR two를 올바르게 설정하고 형광 비드를 사용하여 기계를 보정하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.