Name: 유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 배우세요 유동세포계측법을 이용하여 고정 및 살아있는 세포에서 칼페인 활성을 측정하는 방법을. 형광 기질 BUC, LMC MAC을 사용하여 백혈병 및 림프종 연구에 활용할 수 있습니다.

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건강 연구, 백혈병과 림프종 사회 캐나다와 캐나다의 림프종 재단의 캐나다 연구소에서 교부금에 의해 지원됩니다.

시약 준비 참고 : 모든 PBS는 칼슘 2 +와 MG 2가 포함되어 + <ol><li> 탐지 시약 방 온도를 PBS로 20μM 7 - 아미노 - 4 - chloromethyl coumarin, T - BOC - 류신 - 메티오닌 아미드를 (BOC - LM - CMAC) 추가합니다. 각각의 세포 현탁액은 2mL 탐지 시약을 필요로합니다. </li><li> 1 % Paraformaldehyde (고정 세포) 방 온도를 PBS에 4 % paraformaldehyde 주식 솔루션을 희석. 각 외과 튜브로 나누어지는 1mL 1 % paraformaldehyde. 쓰리 외과 튜브 각 실험 조건이 필요합니다 (예 : 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit가 + PD98059 9 외과 튜브가 필요) </li><li> PD150606 (calpain 억제제) 100mM의 최종 농도로 DMSO에 PD150606 Reconstitute. 이 시약이 실험 기간 동안 빛으로부터 그것으로 취급 모든 세포를 보호할 수 있습니다. </li><li> PD98059 (MEK1 억제제) 50mM의 최종 농도로 DMSO에 Reconstitute PD98059. </li></ol> 셀 준비 <ol><li> X 10 Opti - 멤 미디어 ML 당 5-1 X 10 6 세포 5 % 태아 소 혈청, IL - 3의 소스 (또는 IL - 3 등에 대한 다른 소스로 WEHI - 3 뜨는와 보충 5 32Dkit 세포를 성장 재조합 단백질 등), 0.1 % 2 - 메르 캅 토 에탄올 항생제. </li><li> 세 15mL 팰컨 튜브 (튜브 당 4 X 10 6 세포)로 12 X 10 6 32Dkit 세포를 수집합니다. </li><li> 15 5 분 1,000 RPM에서 펠렛은 세포 ° C. </li><li> 뜨는을 대기음. 2mL 방 온도 PBS에 세포를 Resuspend. </li><li> 50μM PD150606 하나의 세포 현탁액을 처리합니다. 샘플이 팰컨 튜브 알루미늄 호일로를 덮고하여 빛으로부터 보호됩니다 확인하십시오. 소용돌이는 간단히 다음 어둠 속에서 실온에서 20~30분위한 부화. </li><li> 20μM PD98059 두 번째 세포 현탁액을 처리합니다. 플레이트 37에서 2 시간 동안 35mm 조직 문화 요리와 부화에있는 세포가 ° C. </li></ol> 고정 전지 Calpain 분석 <ol><li> 샘플 PD150606과 잠복기 있지만, 치료 샘플에 calpain 분석을 시작합니다. 각각의 세포 현탁액에 2mL 검출 시약을 추가하여 시작합니다. 즉시 1 % paraformaldehyde (0 분 시점)로 이전 준비 외과 튜브에 세포 현탁액 / 탐지 시약 혼합물의 1mL를 추가합니다. </li><li> 상온에서 5 분 탐지 시약과 셀 suspensions을 품어. 다음 1mL 1 % paraformaldehyde와 외과 튜브에 세포 현탁액의 1mL를 추가합니다. </li><li> 실온에서 추가로 5 분 검출 혼합물로 세포 suspensions을 잠복기 계속합니다. 다음 1mL 1 % paraformaldehyde와 외과 튜브에 세포 현탁액의 1mL를 추가합니다. </li><li> 억제제로 치료했습니다 32Dkit 세포에 calpain 분석을 반복합니다. </li><li> 4 어둠 속에서 야간 세포를 수정 ° C. </li><li> 다음날 펠릿 15 5 분 1,800 RPM에서 세포 ° C. </li><li> 뜨는을 대기음. 750uL PBS에 세포를 Resuspend. 얼음 세포를 놓고 어둠 속에 보관. </li></ol> 고정 셀에 대한 데이터를 수집 <ol><li> LSR II (BD Bioscience)를 사용하여 세포를 분석할 수 있습니다. 필터는 Lightwave Xcyte (UV) 레이저, 여기 라인 355nm 레이저 전력 25mW, 각각 기판 및 제품에 대한 405 및 450 nm의의 방출에 대해 설정됩니다. 기판 및 제품에 대한 밴드 패스 필터 20분의 405과 50분의 450입니다. 기판 및 제품에 대한 긴 패스 필터는 405 450입니다. PMT 전압은 제품의 기판에 대한 350-375과 325-350에 설정되었습니다. </li><li> ; 사이드 분산, 인도 - 1 블루 (로그), 인도 - 1 바이올렛 (로그) 앞으로 흩어 다음 매개 변수 BD FACSDiva 실험 - 설정합니다. 앞으로 흩어 대 라이브 세포 게이트 (그림 1A), 인도 - 1 블루 히스토그램, 인도 - 1 바이올렛 히스토그램, 인도 - 1 블루 대 인도 - 1 바이올렛과 ​​사이드 분산형 점 줄거리 : 워크시트에 다음과 같은 그래프를 설정 도트 플롯. </li><li> LSR AlignFlow과 AlignFlow와 II 플러스 형광 구슬 (Invitrogen)를 보정합니다. PMT 전압 전에 모든 실험에 동일한 채널에서 비드 형광 히스토그램의 절정을 배치 조정해야합니다. </li><li> 0 분 시점에서 32Dkit 세포를 사용하여 데이터를 수집 시작합니다. 필요에 따라 매개 변수 전압을 조정합니다. 수집 및 샘플 10,000 이벤트를 기록합니다. </li><li> 각 튜브 사이 외과 버퍼와 함께 시스템을 rinsing, 각 샘플에 대한 인수를 반복합니다. </li><li> 데이터를 내보낼 수 있습니다. 확인 LSR II는 기관의 지침에 따라 청소합니다. </li></ol> 라이브 세포 Calpain 분석 <ol><li> 노 PD150606와 위의 세포 suspensions를 준비합니다. LSR II에 샘플을 가지고 이상과 같은 필터와 파라미터를 설정합니다. 위와 같이 워크시트를 설정합니다. 인도 - 1 블루 대 시간을 보여주는 대형 도트 플롯을 포함합니다. 최대 NUM를 얻기위한 프로그램을 설정이벤트 BER (NO 중지 게이트). </li><li> 32Dkit 세포의 50μM PD150606 하나의 세포 현탁액을 추가합니다. 어둠의 샘플 보관 20-30 명의 분 실온에서 품어. </li><li> 노 PD150606과 32Dkit 세포 현탁액에 대한 데이터를 수집 시작합니다. 초당 200-300 이벤트의 낮은 유속을 사용합니다. 30 초 일분 후 시스템에서 튜브를 제거합니다. 세포에 20μM BOC - LM - CMAC을 추가합니다. 소용돌이는 간단히 다음 데이터를 획득 계속합니다. </li><li> 10~20분 또는 calpain 활동 고원까지 데이터를 수집. </li><li> PD150606 취급 32Dkit 세포와 3 단계와 4 단계를 반복합니다. </li><li> 데이터를 내보낼 수 있습니다. 확인 LSR II는 기관의 지침에 따라 청소합니다. </li></ol> 콤플렉스 (혼합) 셀 인구의 Calpain 분석 *이 실험은 마우스 비장에서 수확 세포 현탁액에 32Dkit 세포를 식별합니다. <ol><li> 각 마우스의 비장을 수확. 실온에서 10 분 NH 4 Club 호텔과 적혈구 세포를 Lyse. </li><li> 2mL PBS의 단세포 suspensions를 준비합니다. </li><li> 두 각각의 세포 현탁액을 나눕니다. 어둠 속에서 실온에서 20-30분에 대한 50μM PD150606 1 세포 현탁액을 처리합니다. </li><li> 고정 셀에 Calpain 어세이 (1-6 단계)에 대한 위에서 진행 </li><li> 뜨는을 대기음. 500μL PBS에 세포를 씻으십시오. 뜨는을 대기음. </li><li> 2 % BSA와 200μL 얼룩 버퍼에있는 세포를 Resuspend. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 기본 항체 (FITC 안티 마우스 CD117)를 준비합니다. 항체는 버퍼를 얼룩의 1:200 희석에 사용해야합니다. 항체가 어둠에 갇혀있다 확인하십시오. </li><li> 세포에 200μL 기본 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 유동세포계측법의 볼륨을 증가 400μL PBS를 추가합니다. 얼음에 세포를 놓고 어둠 속에 보관. </li><li> 고정 셀에 대한 데이터를 취득에서 설명한대로 진행합니다. 매개 변수 FITC 추가하고 워크시트에서 FITC에 대한 히스토그램을 포함합니다. </li></ol> 분석 및 대표 결과 <ol><li> FlowJo (Treestar)를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 순방향 및 측면 산란 프로파일 (그림 1A)에 따라 사는 세포 게이트. 가능한 세포 게이트 (그림 1B)에서 인도 블루에 대한 의미 형광을 확인합니다. </li><li> 혼합 셀 인구) <ul><li> 32Dkit 인구를 식별 histograms 및 도트 플롯에 FITC 형광을 사용하여 </li><li> 32Dkit 인구의 인도 블루에 대한 의미 형광을 결정 </li></ul></li><li> 그래프 평균 형광 (그림 2A)을 위해 Microsoft Excel을 사용하십시오. 5 10 분 사이의 라인의 기울기를 계산. 그래프 기울기 (그림 2B) 셀에 calpain 활동을 결정하기 위해 막대 그래프로. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="그림 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1A"> 그림 1A. 순방향 및 측면 산란 프로파일을 기반으로 살 세포를 결정. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="그림 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1B"> 그림 1B는. 10 분 시간 코스 이상의 형광 변화를 의미합니다. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="그림 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2A"> 의미 형광의 그림 2A가. 대표 그래프. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="그림 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2B"> 억제제와 32Dkit 세포 그림 2B. Calpain 활동.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

고정 생활 32Dkit 세포의 calpain 활동이 비디오 프로토콜에서 결정되었습니다. calpain 억제제 PD150606과 세포 라인의 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. 또한, MEK1 억제제 PD98059 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. ERK는 calpain - 2 3의 주요 활성입니다. 이러한 결과는 calpain - 2 활동이 32Dkit 세포의 지배는 것이 좋습니다. 우리 연구실에서 현재 작업 증가 calpain 활동의 결과와 백혈병에 calpain - 1 calpain - 2의 기여를 조사하고있다. 이 프로토콜 세부 고정 및 살아있는 세포에서 calpain 활동 수준을 측정하는 최초의 흐름 cytometric 분석을 기반으로하며 calpain 규정하고 그대로 세포를 사용하여 병적인 과정에서 그 역할의 메커니즘을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이...

<table><tbody><tr><td>PBS
BOC-LM-CMAC
4% 파라포름알데히드</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;4g의 파라포름알데히드를 100mL의 PBS에 녹인다. 흄 후드 내에서 시료가 투명해질 때까지 교반하며 가열한다.&lt;br/&gt;식힌 후 4°C에서 보관하십시오.&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>최대의 칼파인(calpain) 억제 효과를 위해 갓 재구성한 PD150606을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, 형광 비드 포함 AlignFlow plus FACS 튜브</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;본 실험에서는 WEHI-3 세포의 상층액을 IL-3 공급원으로 사용합니다. 32Dkit 세포 성장에 사용될 최적 농도를 결정하기 위해 수집된 각 WEHI-3 상층액의 역가를 측정합니다. </td></tr></tbody></table>

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains는 유비 쿼터스 세포, 칼슘 구분, 중립 시스테인 프로 테아제 아르<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains는 신호, cytoskeletal 리모델링, 유전자 발현, apoptosis의 조절 및 세포주기의 진행 등 많은 생리 과정에서 중요한 역할을<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains는 근육질 dystrophies, 암, 당뇨병, 알츠하이머 질환과 다중 경화증 등 많은 pathologies에 연루되었습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain 규정은 복잡하고 불완전하게 이해된다. mRNA와 단백질 수준 calpain 활동을 측정하는 유전자 또는 단백질 표현 기법의 사용을 제한, 활동이 저조한 상관 관계. 이 비디오 프로토콜 세부 사항은 고정 및 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 우리 연구실에 흐름 cytometric 분석을 개발했습니다. 이 방법은 calpain에 의해 구체적으로 죽습니다 형광 기판 BOC - LM - CMAC은, calpain 활동을 측정합니다.<sup&gt; 2</sup&gt;이 비디오에서는 고정 생활 murine 32Dkit의 백혈병 세포, 혼자 또는 splenocyte 인구의 일부로 calpain 활동 LSRII (BD Bioscience)를 사용하여 측정됩니다. 32Dkit 전지는 고가 활동이 정상 splenocytes에 비해해야 표시됩니다.

이 문서 유동세포계측법를 사용하여 고정하고 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 세부 프로토콜을 것입니다.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

칼파인(Calpain)은 어디에나 존재하는 세포 내 칼슘 민감성 중성 시스테인 프로테아제입니다 1. 칼파인은 많은 생리학적 과정에서 중요한 역할을 하며, ...

Calpain은 도처에 존재하는 세포 내 칼슘 민감성 중성 시스테인 프로테아제(cysteine proteases)로, 신호 전달, 세포골격 재구성, 유전자 발현 조절, 세포 사멸 및 세포 주기 진행을 포함한 많은 생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 고정된 세포 및 살아있는 세포 내의 calpain 활성을 측정하기 위해 형광 기질인 BUC, LMC MAC을 첨가합니다. Buc LMC MAC은 calpain에 의해 특이적으로 분해되어 형광이 증가합니다. 이러한 형광 변화는 유세포 분석법(flow cytometry)으로 모니터링하며, 이를 통해 정상 세포와 비교하여 30 2D kit 세포에서 증가된 calpain 활성을 확인할 수 있습니다.안녕하세요, 토론토 대학교 면역학 및 대학 건강 네트워크(University Health Network)의 Stewart Berger 박사님 연구실의 Christina Farr입니다. 오늘은 유세포 분석 기반 분석법을 사용하여 고정 세포 및 살아있는 세포에서 calpain 활성을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 백혈병 및 림프종 세포의 calpain 활성을 관찰하기 위해 이 분석법을 사용하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 실험을 시작하기 전에 1% 파라포름알데히드(PARA formaldehyde) 검출 시약, 칼파인(calpain) 억제제 PD 150606 및 MEK1 억제제 PD 98059를 포함하여 필요한 시약들을 준비하십시오. 이 시약들의 준비에 관한 자세한 내용은 함께 제공된 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 각 FACS 튜브에 1% 파라포름알데히드 1 mL를 넣으십시오.이 비디오에 제시된 고정 세포의 경우, 각 실험 조건당 3개의 fax tube가 필요합니다. 총 세 가지 조건을 테스트하므로 9개의 fax tube가 필요합니다. 최적 배지에서 배양된 0.5 ~ 1 × 10⁶ cells/mL 농도의 32 dki 세포로 시작하십시오.태아 송아지 혈청, IL-3, tumor capto ethanol 및 항생제를 첨가합니다. 4 × 10⁶개의 세포를 세 개의 15 mL falcon tube에 각각 옮깁니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 15 °C에서 225 G로 5분간 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다.원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포를 2 mL의 상온 PBS에 재현탁합니다. 세포 현탁액 중 하나를 50 µM의 calpain 억제제 PD 1

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체, 미토콘드리아 DNA 관련 단백질 및 미토콘드리아 외막 단백질에 대한 항체로 신경 세포를 라벨링한 후 유세포 분석을 통해 그 수준을 정량화하는 방법을 보여줍니다.

유세포분석을 사용한 뉴런의 다중 미토콘드리아 파라미터 측정

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

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Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

단일 셀 감도 제공, 실시간 cytometry은 유일 하 게 라이브 문화의 복합 수용 체 기능을 계량 적합 합니다. 성숙한 신경 조상 세포를 사용 하 여, P2X7 수용 체 기능 칼슘 유입 칼슘 표시기 염료, ethidium 평범한 사람 통풍 관, 그리고 형광 라텍스 비즈를 사용 하 여 식 균 작용에 의해 막 횡단 기 공 형성에 의해 감지를 통해 평가 했다.

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

본 프로토콜은 유동 세포분석 또는 분광형광계를 사용하여 형광 기질을 통해 카스파아제 활성을 측정하는 두 가지 방법을 설명합니다.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

여기에서는 효모 샘플에서 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 원형질막 무결성을 정량화하기 위해 SYTO 9와 요오드화 프로피듐(PI)이라는 두 가지 형광 염료를 사용합니다. 유세포 분석을 사용하여 산화 후 스트레스 샘플에 대한 살아있는 세포, 죽은 세포 및 손상된 세포 분획에 대한 정량적이고 재현 가능한 추정치를 제공합니다.

효모 세포의 스트레스 후 생존을 정량화하기 위한 유세포 분석법과 결합된 최적화된 LIVE/DEAD 분석

배우세요 유동세포계측법을 이용하여 고정 및 살아있는 세포에서 칼페인 활성을 측정하는 방법을. 형광 기질 BUC, LMC MAC을 사용하여 백혈병 및 림프종 연구에 활용할 수 있습니다.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

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