Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

하드 chorion 부드러운 배아, medaka의 배아의 조작으로 인해 더 zebrafish에 비해 참여합니다. 이 비디오는 chimeras의 생산을위한 이미징 및 세포 이식에 대한 아가로 오스의 장착 dechorionation 포함한 medaka의 배아를 조작하는 방법에 대한 단계별 절차를 나타냅니다. 이러한 절차는 척추 게놈 기능의 유전자 해부 위해 상호 보완적인 기능을 최대한 활용하기 위해 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하는 필수적입니다.

이 절차의 전반적인 목표는 관심 유전자 또는 단백질의 자율성을 검사하기 위해 배아에서 클론을 생산하는 것입니다. 이는 이 비디오의 동반 이미지인 Maka 배아의 미세주입에서 볼 수 있듯이 단일 세포 단계에서 마이크로 주입으로 기증자 배아를 Rod Domine dextran으로 라벨링함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 기증자와 수혜자 배아를 모두 올바른 단계로 발달시키는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 기증자와 수혜자의 배아를 모두 코팅하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 표지된 기증자 배아에서 수혜자의 배아로 세포를 이식하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 형광 또는 계통 추적자에 의해 이식된 세포를 검출하여 이식된 세포의 클론, 이식된 세포의 분포, 증식 및 분화를 분석하여 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 바스 대학교 생물학 및 생화학과 Makoto Fki 박사 연구실의 Sean Brazinski입니다. 저도 제키 연구실 출신입니다. 오늘은 어두운 물고기 배아에 세포를 이식하는 절차를 소개해보려고 한다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 관심 유전자 또는 돌연변이, 세포 또는 비세포 자율 기능을 가진 유전자 또는 돌연변이를 연구합니다. 시작하겠습니다. 마카 알을 코팅할 때 멸균 용액과 도구를 사용하여 장기적인 관찰 및 배양의 성공을 향상시킵니다.

P 2000 그릿 방수 사포 조각을 9cm 비접착성 페트리 접시의 뚜껑에 놓습니다. 넓은 입을 사용하여 광택이 나는 파스타 피펫을 발사하여 계란 접시에서 갓 뭉치지 않고 세척 및 라벨을 붙인 계란을 최대 10개까지 옮깁니다. 사포에 매체.

여분의 매체를 제거하고 계란이 마르지 않도록 접시에 충분히하십시오. 장갑을 낀 손가락 끝을 사용하여 한 번에 10개의 달걀을 사포 위에 45-60초 동안 부드럽게 굴립니다. 외부 표면의 털을 제거하고 코리안 표면에 점수를 매기려면 최소한의 압력을 가하고 손가락 끝을 사포와 평행하게 유지하십시오.

계란을 미디엄의 원래 접시에 옮깁니다. 매체를 제거하고 엎드린 엎드린 1 밀리리터 당 20 밀리그램의 용액으로 계란을 덮으십시오. 접시를 덮고 섭씨 27도에서 60분 동안 배양합니다.

배아가 효소에 충분히 잠길 수 있도록 접시를 비스듬히 놓으십시오. 필요한 효소를 최소화하기 위해 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 재사용을 위해 프로나제를 회수하고 얼음 위에 놓습니다. 배아 배지를 5번 씻어 부화 효소를 소화하는 것을 방지하기 위해 엎드린 모든 흔적을 제거합니다.

씻은 알을 덮을 수 있을 만큼 충분한 부화 효소를 추가합니다. 코리안이 녹을 때 부서지지 않도록 계란이 접시 바닥의 단일 층에 남아 있는지 확인하십시오. 알을 섭씨 27도에서 부화시킵니다.

배아가 효소에 충분히 잠길 수 있도록 접시를 비스듬히 놓으십시오. 해부 실체 현미경으로 필요한 효소 확인 진행 상황을 최소화하기 위해 Corian이 완전히 용해되기 전에 Corian의 내부 층에 유사한 구멍이 나타나도록 합니다. 이 과정은 효소 활성에 따라 최대 60분이 소요될 수 있습니다.

코리안의 작은 부분이 용해되면 즉시 피펫으로 개별 난자를 빨아서 부화 효소에 의한 배아의 소화를 방지합니다. BSS의 깨끗한 접시에 피펫 끝을 부드럽게 만지고 알을 굴려 부화 효소의 전달을 최소화하여 BSS의 깨끗한 접시에 옮깁니다. 부화 효소에서 모든 알이 옮겨졌을 때 집게를 사용하여 나머지 Corian을 제거합니다.

한 번 BBSS의 새 요리로 최종 이동합니다. 배아를 배아 발달의 후기 단계로 가져와야 하는 경우 항생제를 추가하십시오 이 절차를 위한 장식 후 이식 1.5시간 전에 12단계 배아를 코팅하기 시작합니다. 피펫 팁을 사용하여 소량의 3% 메틸 셀룰로오스를 캐비티 현미경 중앙에 추가합니다.

9cm 페트리 접시에 밀어 넣으십시오. 움푹 들어간 곳에 액체를 얇게 펴 바릅니다. 메틸 셀룰로오스를 2분 동안 건조시킵니다.

해부 현미경으로 350마이크로리터의 멸균 1회 BSS로 슬라이드 함몰부를 채웁니다. 입구가 넓은 광택 유리 피펫을 사용하여 한 명의 기증자와 최대 4명의 수혜 배아를 슬라이드로 옮깁니다. 헤어 루프를 사용하여 블래스터 덤이 위쪽을 향하도록 배아의 방향을 지정합니다.

필요한 경우 안정성을 위해 배아를 서로 마주 보고 기울입니다. 마이크로니들을 기증자 블래스터에 부드럽게 삽입합니다. 더름. 10-20개의 세포를 천천히 흡수합니다.

이제 수혜자의 해당 부위에 바늘을 부드럽게 삽입하고 배아 블래스터 덤이 기증자 세포를 천천히 배출합니다. 첼로 주머니 경계를 방해하지 마십시오. 페트리 접시에 약 30ml의 멸균 BSS를 1회 조심스럽게 채워 배아를 담그고 메틸 셀룰로오스에서 배아를 느슨하게 합니다.

배아를 방해하지 않도록 접시 측면에 붓습니다. 페니실린 스트렙토마이신 100마이크로리터를 접시에 넣어 대략 농도 0.3%를 만듭니다.접시를 덮습니다. 필요에 따라 주기적으로 배아를 관찰합니다.

타임 랩스 및 상세 관찰과 같은 더 긴 이미징 연구를 위해 살아있는 코팅된 배아를 아로에 삽입하고, 살아있는 배아를 마취하고, 배아를 포함하는 배지에 적절한 마취제를 추가하여 움직임을 방지하고, 배아를 1회 BSS에서 약 1ml의 낮은 융점이 발생하고, 섭씨 37도로 유지합니다. 필요한 경우 경련을 방지하기 위해 아로스에 적당량의 마취제를 추가하고 응고를 방지하기 위해 빠르게 작동하고 입이 넓은 파스타 피펫을 사용하여 캡을 채웁니다. aros가 있는 마이크로 원심분리기 튜브의 함몰.

넓은 입 피펫을 사용하여 코팅 및 마취된 배아 하나를 캡의 아로스로 이동합니다. 배아와 함께 가능한 한 적은 배지를 이식합니다. 즉시 aros와 배아를 업데이트하고 3.5cm 유리 바닥 페트리 접시에 옮깁니다.

접시를 얼음과 물 혼합물로 3분의 1을 채운 14cm 접시로 옮깁니다. 해부 실체 현미경으로 작은 접시를 큰 접시의 바닥에 단단히 고정합니다. 헤어 루프를 사용하여 원하는 대로 배아의 방향을 빠르게 지정합니다.

어그로가 굳을 때까지 배아를 가만히 두십시오. 이제 배아를 이미지화할 수 있습니다. 이미지 A는 이식 직후 기증자와 수혜자 배아를 보여줍니다.

기증자 배아는 완전히 빨간색으로 표시된 석고 피부와 함께 오른쪽에 표시됩니다. 수혜 배아는 왼쪽에 표시되어 있으며 블래스터 덤에서 볼 수 있는 작은 적색 이식 세포 덩어리로 쉽게 식별할 수 있습니다. 이미지 B는 이식 후 약 7시간 후에 두 개의 수혜 배아를 보여줍니다. 이식된 세포가 이식 부위에서 이동하여 이제 블래스터 전체에 분산되어 있음을 주목하십시오.

Derm image C는 29기에 있는 수혜자의 배아를 보여줍니다. 눈의 색소 침착과 몸통과 뇌 부위에 mefor의 존재를 주목하십시오. 간상 도민 표지 세포는 키메라의 성공적인 생산을 나타내는 많은 배아 구조에 군집하고 있는 것을 볼 수 있습니다.

메카 피쉬의 배아를 먹고 초기 배아 단계에서 세포 이식을 수행하는 방법을 보여드렸다. 이 절차를 수행할 때 기증자 세포를 블라스팅된 수혜자의 올바른 부위에 이식하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 기증자 세포가 올바른 세포 유형으로 분화할 수 있습니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.