Name: 플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 플라스미드 DNA에서 재조합 독감 바이러스를 생성하는 방법을. 293T와 MDCK 세포를 공동 배양하여 바이러스를 증폭하고 HA 분석으로 확인합니다. 이 기술은 백신 개발과 바이러스 생물학 연구에 필수적입니다.

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저자는 인플루엔자 역방향 유전학 기술과 plasmids의 발전을위한 아돌포 가르시아 - 사스 트레와 피터 Palese 실험실에서 과거와 현재 회원을 감사드립니다. AG - S 실험실의 연구는 부분적으로 CRIP, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 투자 센터 (HHSN266200700010C)와 NIAD 보조금 R01AI046954, U01AI070469 및 P01AI058113으로 후원됩니다. LM - S 실험실 연구는 부분적으로 NIAID 부여 RO1AI077719에 의해 후원됩니다.

1. 인플루엔자 바이러스 구조 transfection 인플루엔자 바이러스는 부정적 - 표류하는 RNA 싸여 바이러스의 Orthomyxoviridae 제품군에 속한다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 적어도 11 바이러스성 단백질 (그림 1) 4 인코딩 부정 극성의 8 개의 RNA의 유전자로 구성되어 있습니다. 우리는 (8 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 세그먼트를 포함하는 ambisense의 plasmids (pDZ)를 사용하여 가장 일반적인 실험실 변형, 인플루엔자 A/PR/8/34 5 중 하나의 구조에서,이 보고서에서, 초점을 맞출 것이다 그림 2). 플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조를 위해, 우리는 각각의 재조합 바이러스 당 3 독립 transfections을 권장합니다. 하나 이상의 재조합 바이러스의 구조를 시도하는 경우, 구조를 바이러스의 수에 accordantly 다음 단계를 수행 규모. 다음 transfection 및 감염 프로토콜은 6 - 잘 접시를 위해 설정됩니다. 프로토콜의 구조 표현은 그림 3에서 그림입니다. <ol><li> OptiMEM - Lipofectamine 2000 (LPF2000) 혼합 : OptiMEM 미디어 250 μl와 LPF2000 당 transfection 6-8 μl를 준비합니다. 실온 (RT)에서 50~10분에 대한 부화. 한편, 플라스미드 transfection 혼합물을 준비합니다. </li><li> 플라스미드 transfection 혼합물 : OptiMEM 미디어 50 μl의 플라스미드 transfection 칵테일을 준비합니다. 우리는 일반적으로 구조마다 각각의 플라스미드 인플루엔자 DNA 1 μg을 사용합니다. OptiMEM 미디어 50 μl를 포함하는 튜브에 1 pDZ plasmids의 μl (1 μg / μl에서) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, 그리고 NS를 추가합니다. </li><li> OptiMEM - LPF2000 - DNA 플라스미드 혼합 : 인플루엔자 DNA 플라스미드 transfection 혼합물 (단계 1.2)로 1.1 단계에서 250 μl를 추가합니다. RT에서 20~30분이 혼합물을 품어. 한편, transfection에 대한 293T 및 MDCK 세포의 suspensions을 준비합니다. </li><li> 293T/MDCK 공동 문화의 준비 : 시작하기 전에, 37에 PBS 1X, DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 미디어, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 트립신 혼합물을 가지고 ° C. 세포의 밀도가 80-90%의 합류에 transfection의 날이 될 것입니다. 보통 293T 및 MDCK 세포 중 하나가 합류 100mm 요리 중 하나가 합류 100mm 요리는 구출 10-12 사용할 수 있습니다. 우리는 잘 당 셀 250 μl를 사용하려고합니다. 두 셀 라인 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 3 ML의 총 resuspended 것입니다. <ul><li> 조심스럽게 15 ML의 원심 분리기 튜브의 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 10 ML 각 세포 라인을 resuspend. 당신은 MDCK 세포에 대한 293T 세포 하나 하나의 튜브 튜브를해야합니다. </li><li> DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 3 ML에있는 293T 세포를 Resuspend하고 resuspended 때, 그 세포를 resuspend하는 MD​​CK 세포에 3 ML을 제공합니다. 이것은 귀하의 공동 문화 사용할 수 293T 및 MDCK 세포의 혼합물을 제공합니다. </li><li> 물론 당 293T/MDCK 전지 (6월 10일에서 12일까지 - 음 웰스) 250 μl를 추가합니다. </li></ul></li><li> 20-30분 RT 보육 (1.3 단계) 후 OptiMEM - LPF2000 - 독감 DNA 플라스미드 혼합하는 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 1 ML를 추가합니다. </li><li> 293T/MDCK 세포의 250 μl (1.4 단계)와 우물에 1.3 ML (1.5 단계)을 추가합니다. </li><li> 37 부드럽게 6 잘 판을 흔들 배양기에서 (ON) 야간 transfection의 부화를하게 ° C와 5% CO 2. </li><li> 다음날, 약 16~24시간 포스트 transfection은 transfection 미디어를 변경하고 48 시간 TPCK - 트립신 1 μg / ML를 포함한 DMEM PS 0.3 % BA 1 % 안에 transfected 세포를 품어. </li><li> 미디어를 변경 48 시간 후 microcentrifuge 관에 transfected 세포의 표면에 뜨는를 전송합니다. </li><li> 1~2분, 13,000 RPM의 microcentrifuge의 조직 문화 뜨는을 원심 분리기. </li><li> 6 - 잘 접시 (전날 도금) 또는 단계를 1.10에서 centrifuged 조직 문화 supernatants 200 μl 10 일 된 닭 embryonated 달걀 신선한 MDCK 세포를 감염. 2-3 일동안은 37 세포 및 / 또는 계란 ° C를 품어. <ol><li> 10 일 된 닭 embryonated 계란의 감염 : 닭고기 embryonated 달걀을 감염 모든 절차는 무균 조건 하에서 수행됩니다. <ol><li> 공기 색과 allantoic 캐비티 사이의 인터페이스를 보시려면 빛을 candling 상자를 사용하여 10 일간 된 달걀 양초. 인터페이스 테두리에 연필 마크를 확인하십시오. </li><li> 5 ML의 주사기 바늘로 달걀 껍질에 구멍을합니다. </li><li> 1 ML의 주사기를 통해 단계를 1.10에서 조직 문화 supernatants 200 μl 각 계란을 감염. </li><li> 면봉을 사용하여 녹인 왁스와 달걀 껍질에 구멍을 커버. </li><li> 2-3 일동안은 37οC에 감염된 알을 품어. </li></ol></li><li> 신선한 MDCK 세포의 감염 : 통과 전날 사전, 공동 문화 293T/MDCK에서 조직 문화 뜨는MDCK 세포와 정지 6 - 웰 플레이트 요리 다음날 80-90%의 합류에 도달합니다. 보통 합류 100mm 조직 문화 판은 6-8 우물로 분할 수 있습니다. 세포를 씻어 두 번, PBS 1X와 trypsinize 및 6 자 번호판을 준비합니다. 부드럽게 세포의 군복을 입은 배포를하기 위해 손으로 접시를 흔들. 문화 전지, ON, 37 ° C 배양기 5 % CO 2. 감염 전에 monolayer을 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인, 다음, 감염 진행 : <ul><li> PBS 1X 1 ML과 함께 두 번, 세포를 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간 동안 centrifuged 조직 문화 supernatants의 200 μl로 감염. 세포가 건조시키지 마십시오. 6 잘 판 매 10 분 록. </li><li> 바이러스 흡수 1 시간 후, MDCK 세포에서 감염 미디어를 제거하고 TPCK - 트립신 1 μg / ML를 포함한 DMEM PS 0.3 % BA 1 % 2 ML를 추가합니다. </li><li> 48-72시간에서 통과 후, cytopathic 효과 (CPE)는 MDCK 감염된 세포의 관찰, transfection 효율과 바이러스 부하에 따라 것입니다. CPE는 성공적인 구조를 제안합니다. 그러나, HA 분석 (제 2)은 아직도 조직 문화 supernatants에서 바이러스의 존재를 확인하기 위해 수행되어야합니다. </li></ul></li></ol></li><li> 감염된 닭고기 embryonated 계란에서 수확 allantoic 액 : 감염된 계란에서 allantoic 유체를 수확하기 위해 모든 절차는 무균 조건 하에서 수행됩니다. allantoic 유체의 약 8-12 ML 각 10 일간 된에 감염된 계란에서 수확 수 있습니다. 전에 allantoic 유체를 수확하기 위해, 4에서 2 시간 동안 닭 계란 (또는 ON) 부화 ° C는 닭 배아를 죽이고 혈액을 응고합니다. <ul><li> 멸균 조건을 확립하기 위해 70 %의 에탄올과 eggshells 씻으십시오. </li><li> 스푼으로 감청하여 공기 구멍을 통해 조심스럽게, 계란을 엽니다. 포셉의 도움으로 깨진 달걀 껍질을 제거합니다. </li><li> 1 ML의 바늘로, 계란의 노른자를 한방울 흘리지 않고 all​​antoic 멤브레인를 제거합니다. </li><li> 당신이 allantoic 유체에 10 ML의 피펫을 가이드로 주걱으로 닭 배아를 안정화. 속보 또는 달걀 노른자의의를 수집하지 않고 얼음 양동이에 얼음에 15 ML의 원심 관에 가능한 한 많은 allantoic 유체로 수집합니다. 각각의 달걀에 대한 15 ML의 원심 분리기 튜브를 사용하십시오. </li><li> 4 5 분 원심 분리기 ° C 및 신선한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 allantoic 유체 (pelleted 적혈구를 복용하지 않고) 전송. </li><li> 4 centrifuged allantoic 유체가 들어있는 튜브를 저장 ° C들은 hemagglutination (HA) 분석과 구조 바이러스의 존재에 대한 확인까지. </li></ul></li></ol> 2. 재조합 독감 바이러스의 구조를 확인하는 HA 분석 Hemagglutination 분석 (HA)는 정기적으로 MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 수확한 계란의 allantoic 유체의 구조 바이러스의 존재를 감지하는 데 사용됩니다. 또는, immunofluorescence assays (IFA)도 수행할 수 있습니다. 분석은 구조 바이러스의 존재를 식별되면, 바이러스는 플라크가 정화 및 바이러스의 유전자 구성이 RT - PCR 및 시퀀싱에 의해 확인됩니다되어야합니다. MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 감염된 계란에서 allantoic 액체에서 바이러스의 존재는 macroscopically 닭고기의 HA (또는 다른 소스) 적혈구 (RBC)를 사용하여 결정하실 수 있습니다. 바이러스의 부재가 잘 하단에 빨간색 펠릿 (그림 4)의 형성을 허용하면서 바이러스의 존재는 RBC의 hemagglutination을 유도. 인플루엔자 바이러스의 경우, 그것은 약 10 3 -10 4 플라크 형성 단위 (PFU)이 HA 분석에 긍정적인 신호를 제공하는 데 필요한 것으로 생각되며 따라서 IFA가 확인하는 HA 분석과 병행하여 수행할 수 진정한 부정적인 결과. 이하 103-104 바이러스가이 기술을 감지할 수 있기 때문에 기본 백신 독감 항체와 IFA는 HA 분석보다 더 민감합니다. 그것은 IFA에서 긍정적인 HA - 아무것도 없습니다 supernatants 또는 allantoic 체액보다 수 있습니다. 이 경우 바이러스가 MDCK 세포 또는 달걀에서 다시 passaging으로 증폭한다. Allantoic 유체 및 / 또는 두 번째 통로에서 조직 문화 supernatants 이제 HA 분석에서 분명 긍정해야합니다. HA의 assays은 V - 바닥 96 - 웰 플레이트에서 실시하고 있습니다. 부정적인 (예를 들어, PBS 1X)와 긍정적인 (조직 문화 supernatants 및 / 또는 독감 바이러스 감염에서 allantoic 액체) 컨트롤 샘플은 항상 그것을 확인할 수있는 HA 분석에 포함되어야합니다. <ul><li> V - 하단의 각 잘 96 - 웰 플레이트에 PBS 1X의 50 μl를 분배. </li><li> 50 μl 추가감염된 최초의 잘하는 계란에서 MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체는 다음과 우물 2 배 직렬 dilutions합니다. 마지막 우물에서 추가 50 μl를 폐기하십시오. </li><li> 0.5 % 각각 잘하는 -1.0 %의 닭 적혈구 (PBS 1X에서 준비) 50 μl를 추가합니다. </li><li> 얼음 V - 하단 96 자 30-45분에 대한 번호판을 (빨간색 점이 부정적인 제어 PBS 샘플의 하단에서 볼 수 있습니다까지) 알을 품다. 로 그림 4에 표시된 결과를 읽고 interpretate. </li></ul> 3. 조직 문화 supernatants의 통로 HA의 분석에 부정적인 결과는 조직 문화 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체에서 바이러스되는 현재의 낮은 수준 낮은 transfection 효율의 결과 수 있습니다. 신선한 MDCK 및 / 또는 embryonated 계란에서 이러한 샘플 통로 감염증는 이전에 다음 섹션 1.11.2에 설명되어있는대로 수행됩니다 (그림 3에 표시된) 바이러스의 증폭을 허용합니다. 4. 대표 결과 성공적인 독감 바이러스의 구조는 긍정적인 HA 분석 (그림 4)의 존재에 의해 확인됩니다. 또한, 조직 문화 supernatants 또는 계란에서 allantoic 유체에 감염된 세포에서 CPE의 존재는 긍정적인 바이러스 구조를 제안합니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 인플루엔자 바이러스 구조 : 인플루엔자 바이러스는 두 가지 바이러스 glycoproteins (HA, NA)와를 포함하는 지질 이중층에 둘러싸여 또한, 이온 채널 단백질, M2. HA는 sialic에 바인딩 산성 함유 수용체를 담당하는 바이러스 첨부 단백질입니다. NA 호스트 세포에서 바이러스의 릴리스에 대한 책임이 있습니다. 지질 이중층 밑에, virion 조립 및 신진 및 바이러스 ribonucleocapsids의 원자력 수출에 필요한 핵 수출 단백질 (NEP)의 역할을 안쪽 표면 봉투 매트릭스 단백질 1, M1, 구성된 단백질 층입니다. 바이러스의 핵심은 바이러스 핵 단백질, NP하여 encapsidated 8 단일 좌초 부정적인 RNA 바이러스의 유전자로 구성된, ribonucleoprotein (RNP) 복합 구성되어 있습니다. RNP 복합과 관련된 바이러스 RNA 의존 RNA 중합 효소 subunits PA, PB1, PB2하고 있습니다. 각각 RNA 세그먼트 NS와 PB1로 인코딩되지 않은 구조 단백질 NS1과 PB1 - F2는, virion 구조의 일부가되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 인플루엔자 바이러스 구조 plasmids : ambisense 플라스미드 pDZ에 복제된 8 개의 독감 바이러스 유전자가 표시됩니다. pCAGGs 7 플라스미드 단백질 표현에서 파생된 플라스미드 pDZ 6, 인간의 RNA 효소 나는 발기인과 부정적인 감각의 게놈의 RNA를 인코딩 마우스 터미네이터 순서와 양방향 플라스미드 벡터이며 반대 방향으로 난 연합 효소로 효소 II 전사 카세트 (닭고기 β - 굴지의 발기인 및 polyA)이 같은 바이러스 유전자에서 바이러스 단백질을 인코딩합니다. 각 바이러스 세그먼트의 cDNAs는 SAPI 제한 endonuclease 사이트 및 각 세그먼트 (바이러스 유전자의 끝에 블랙 박스)의 noncoding 영역을 포함하는 순방향 및 역방향 primers와 RT - PCR에 의해 생성됩니다. PCR 제품은 삽 - I와 소화 pDZ로 복제된 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 에이트 - 플라스미드 기반의 독감 구조 시스템 : 8 인플루엔자 바이러스의 유전자를 포함하는 pDZ의 plasmids가 공동 문화 (1 일) 293T - MDCK 세포에서 정지, 공동 transfected 있습니다. 스물 네 시간 FBS없이 포스트 transfection, 미디어지만 TPCK / 트립신을 포함 (제 2 일) 대체됩니다. 마흔 여덟 시간 미디어를 변경한 후, 조직 문화 뜨는은 수확과 MDCK 또는 10 일 된 embryonated 닭고기 달걀 (일 4) 감염하는 데 사용됩니다. 48-72시간 포스트 증폭, 계란에서 감염 MDCK 세포 또는 allantoic 유체의 조직 문화 supernatants는 HA (6 일)에서 수확 및 바이러스의 존재에 대한 assayed 있습니다. 어떤 바이러스가 감지되지 않으면, 같은 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체는 신선한 MDCK 세포 및 / 또는 embryonated 계란에 다시 passaged 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 적혈구응집소 분석 (HA) : 바이러스 입자에 의해 RBC의 Hemagglutination은 macroscopically 볼 수 있으며, 조직 문화 supernatants 또는 / 및 allantoic 체액에서 바이러스 입자를 감지하는 기준이됩니다. HA 분석 바이러스는 전염성 아르 입자와 타락한과 세포를 감염시킬 수있는 더 이상의 입자 사이에 차별하지 않습니다 있지만, 분석은 샘플에서 바이러스의 존재의 좋은 지표입니다. A) 생물 학적 샘플에서 바이러스의 존재 (하단)의 부재는 (위) 접시의 바닥이나 부재, resp에서 RBC의 존재에 의해 결정됩니다ectively. B)없이 바이러스 감지 수준 (위) 또는 바이러스의 존재 (아래)과 HA 분석의 대표적인 결과가 표시됩니다.

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의학의 마운트시나이 학교는 재조합 독감 바이러스의 영역에서 지적 재산권을 가지고 있으며, AG - S는 지적 재산권의 발명가이다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조는 프로토콜이 정기적으로 실험실에서 수행되면 간단하고 간단하게,하지만 처음에 여러 일이 잘못 이동할 수 있습니다. 바이러스를 생성하는 좋은 플라스미드 준비를하기 위해 필수적인 그것을 것입니다. 세포 라인 (293T 및 MDCK)의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 구조를 위해 중요합니다. 전통적으로, 유전자 태그는 침묵 돌연변이 유발에 의해 플라스미드 인플루엔자 유전자 인코딩에 삽입됩니다. 이 침묵 돌연변이 (S) 및 예를 들어, 창조의 소개, 소설의 제한 효소 사이트는 효소 분해에 의해 야생 - 타입과 재조합 독감 바이러스를 구분하는 데 사용됩니다. 따라서, 재조합 바이러스를 정화 상패의 증폭 후, RT - PCR 및 시퀀싱 방법은 구출 바이러스의 특성을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 이러한 역방향 유전학 기술과 plasmids에서 재조합 독감 바이러스의 성공적인 구조의 개발은 바이러스의 생물에 대한 구체적인 질문에 대한 답변을하실 수 있습니다.

셀 라인 293T (카탈로그 번호 CRL - 11268) 및 MDCK는 (카탈로그 번호 CCL - 34) 세포 라인 DMEM 10% FBS, 1 % PS에서 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 유지됩니다. 세포는 미국 유형 문화 수집 (ATCC, 10801 유니버 시티대로, 머내서스, VA. 20110-2209 미국) 제공 형태입니다. Embryonated 닭고기 계란 Embryonated 10 일 된 닭 계란은 찰스 리버 연구소 무균 요금 조류 공급 장치 (SPAFAS) 조류 제품 및 서비스에서 얻을 수 있습니다. 프랭클린 커먼스, 106 루트 32, 노스 프랭클린, CT 06254 미국. 계란은 37 ° C 이전에서, 바이러스 감염 후 incubated 수 있습니다. 바이러스 감염 전후, 계란은 배아의 생존을 결정하는 candled 있습니다. 그것은 바이러스 감염 전후에 죽은 알을 찾기 위해 매우 중요합니다. 감염 전에 죽은 계란은 쉽게 혈관의 부재뿐만 아니라 배아 이동성의 부재에 의해 발견하실 수 있습니다. candled 때, 라이브 배아가 이동합니다. 바이러스 감염 후 죽은 계란은 (아마도 독감 바이러스 감염에 관한) 쉽게 allantoic 유체의 작고 피묻은 볼륨으로 볼 수로 계란의 나쁜 모습으로 발견됩니다. 감염 - 달걀은 두 autoclavable 봉투에 삭제 및 표준 절차에 따라 autoclaved 있습니다. 치킨 적혈구 (RBC) 치킨 RBC는 트러 슬로 팜, 201 밸리로드, 체스터, MD 21620에서 구입할 수 있습니다. 4 스토어 ° C. HA의 assays 들어, 50 ML의 원심 분리기 튜브의 PBS 1X 45 ML과 닭고기 RBC 5 ML 씻는다. 1,000 RPM으로, RT에서 5 분 원심 분리기. 신중하게 뜨는을 취소하고 PBS 1X의 pelleted RBC의 1:1000 희석 (0.5-1.0 % RBC의 최종 농도)를 사용합니다. 조직 문화 supernatants 및 allantoic 유체 , 조직 문화 supernatants 및 allantoic 체액 모두 4 ° C 짧은 기간 동안 저장할 수 있습니다. 바이러스 구조를 확인 후, 세포 supernatants 또는 allantoic 유체의 바이러스는 -80 ° C.에 저장됩니다 Plasmids 모든 plasmids은 플라스미드 맥시 키트의 다음 제조 업체의 권장 사항을 사용하여 준비가되어 있습니다. 모든 plasmids은 ddH 2 O 1 μg / ML의 농도에서 나누어지는되며 -20 ° C.에 저장된 단기 스토리지, 플라스미드는 4 유지할 수 있습니다 ° C.를 플라스미드 정화 DNA의 농도는 순도가 260:280 NM 비율을 사용하여 예상되는, 260 NM에서 분광 광도법에 의해 결정됩니다. 1.8-2.0 NM 260:280 비율로 준비가 바이러스 구조 목적 appropriated 간주됩니다. 또한 플라스미드 농도와 순도는 아가로 오스 겔 크로마 토그래피로 확인되어야합니다. Ambisense pDZ plasmids (6) 8 인플루엔자 바이러스 유전자 A/PR/8/34 (7)이있는 그림 2 그림입니다. 바이러스 독감 A/PR/8/34을 구해준 것에 대해 설명하는 프로토콜은 biosafety 수준 (BSL) 2 조건 하에서 수행할 수 있습니다. 조직 문화 supernatants 및 embryonated 계란을 포함한 오염 물질은, 폐기하기 전에 소독한다. 다른 인플루엔자 바이러스의 구조는 높은 BSL 조건 및, 따라서, 특수 조건 / 보안 측정을 소집해야합니다 필요할 수 있습니다. 조직 문화 미디어 및 솔루션 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS : 445 ML Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM), 태아 소 혈청 (FBS) 50 ML 및 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 5 ML. 4 스토어 ° C. 이 미디어는 transfections에 대한 293T 및 MDCK 세포뿐만 아니라 유지하는 데 사용됩니다. DMEM 0.3 % BA 1퍼센트 PS : DMEM의 495.7 ML, 35% 보빈 알부민 (BA) 4.3 ML. 4 스토어 ° C. 그냥 사용하기 전에, 1 μg / ML의 최종 농도 TPCK 처리 트립신을 추가합니다. 전염성 미디어. NaCl 80 G, KCl 2 G, 나 2 HPO 4 0.7 H 2 O, KH 2 2g PO 4 11.5 g : 10X 인산은 호수 (PBS)를 버퍼. 최대 1리터에 ddH 2 O를 추가합니다. 7.3으로 산도를 조정합니다. 압력솥으로 소독. 상온에서 보관하십시오. 1X PBS : ddH 2 O.로 희석 10X PBS 1시 10분 상온에서 압력솥과 저장에 의해 소독.

플라스미드 dna의 재조합 독감 바이러스의 생성

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

독감 연구 그룹의 숫자로 노력은 인플루엔자 바이러스 역방향 유전학의 개발과 개선에 중요한되었습니다. 원래 1999 년에 설립<sup&gt; 1,2</sup특정 질문이 유전자 조작, 전염성, 재조합 독감 바이러스에 의해 답변 되었기 때문에 재조합 바이러스를 생성하는&gt; 플라스미드 기반의 리버스 유전자 기술은 인플루엔자 연구 분야를 혁명있다. 이러한 연구는 바이러스 복제, 바이러스 단백질의 기능, 바이러스 복제 및 / 또는 pathogenesis에서 바이러스 단백질의 특정 변이의 기여하고, 또한 바이러스성 벡터 외국인 단백질을 표현하는 재조합 독감 바이러스를 사용하여 포함<sup&gt; 3</sup&gt;.

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

다수의 인플루엔자 연구팀의 노력은 인플루엔자 A 바이러스 역전유전학의 발전과 개선에 중추적인 역할을 해왔습니다. 원래...

다음 실험의 전반적인 목표는 플라스미드 DNA로부터 재조합 인플루엔자 바이러스를 생성하는 것입니다. 이는 Lipofectamine 2000을 사용하여 8개의 인플루엔자 유전자를 인코딩하는 DNA 플라스미드를 293T 세포와 MDCK 세포의 공동 배양액에 전달함으로써 달성됩니다. 조직 배양 상청액을 사용하여 신선한 MDCK 세포 또는 부화 10일 된 유정란에 감염시키면, 형질전환된 세포의 상청액에 존재하는 바이러스가 증폭됩니다.다음으로 감염된 닭 배아란으로부터 조직 배양 상청액과 요막액을 수확하겠습니다. HA 분석법을 사용하여 바이러스의 존재를 확인하며, 응집 반응의 발생 여부를 통해 바이러스의 존재를 보여주는 결과를 얻게 됩니다. 안녕하세요, 로체스터 대학교 미생물학 및 면역학과의 Luis Martinez Rito입니다.오늘은 플라스미드 DNA로부터 재조합 인플루엔자 바이러스를 회수하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 인플루엔자 바이러스 생물학의 다양한 측면을 연구하고 잠재적인 벡터 및 백신을 개발하기 위해 이 기술을 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.형질전환을 시작하기 전, 1배 농도의 인산완충식염수(phosphate buffered saline), P-B-S-E-D-T-A, 트립신(trypsin) 및 10% 태아송아지혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 함유된 KO 변형 이글 매질(DMEM) 등의 세포 배양 시약을 37°C로 가온합니다. 그다음, 형질전환 1회당 250 µL의 Opti-MEM 배지와 6-8 µL의 Lipofectamine 2000을 준비하여 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 50 µL의 Opti-MEM 배지가 들어 있는 튜브에 1 µg의 플라스미드 DNA를 첨가하여 플라스미드 형질전환 혼합물을 준비합니다. 바이러스 세그먼트를 포함하는 8종의 PDZ 플라스미드를 각각 1 µg씩 첨가합니다.PB two PB one pa ha np na m 및 N MS. 인플루엔자 DNA 플라스미드 트랜스펙션 혼합물에 상온의 opti MEML PF 2000 250 µL를 첨가하고 상온에서 20~30분 동안 배양합니다. 그동안 트랜스펙션을 위해 2 9 3 T 및 MDCK 세포 현탁액을 준비합니다. 2 9 3 T 및 MDCK 세포의 밀도는 80~90% 합류도(confluence)여야 합니다.형질전환 당일, 100 mm 디시당 약 5×10⁶개의 세포를 준비합니다. 표준 세포 배양 기술을 사용하여 세포를 세척하여 분리하고 원심 분리합니다. 293T 세포를 3 mL의 DMEM-FBS-PS로 재현탁합니다. 재현탁 후, 해당 3 mL를 MDCK 세포에 넣어 재현탁합니다.이렇게 하면 공동 배양에 사용할 2 9 3 T 세포와 MDCK 세포의 혼합물이 만들어집니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 2 9 3 T-M-D-C-K 세포 혼합액 250 microliters를 넣습니다. 20~30분 후, 각 opti M-E-M-L-P-F 2000 인플루엔자 DNA 플라스미드 혼합물에 DMEM 10%FBS 1%PS 1 milliliter를 추가합니다.그 후 250 mL의 2 9 3 T-M-D-C-K 세포가 들어 있는 웰에 추가합니다. 6-웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 섞어준 뒤, 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 transfection 상태로 배양합니다. 다음 날, transfection 후 16~24시간이 지나면 transfection 배지를 교체하고, 1 µg/mL의 L-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone(TPCK) 처리된 trypsin이 포함된 DMEM 0.3% Bovine albumin(BA) 1% PS에서 transfection된 세포를 48시간 동안 배양합니다.MDCK 세포 감염이 필요한 경우, 감염 전날 또는 초기 바이러스 트랜스펙션 2일 후에 신선한 MDCK 세포를 플레이트에 분주하십시오. 배지를 교체한 지 48시간 후에 트랜스펙션된 세포의 상층액(SUP natant)을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오. MDCK 세포를 감염시키기 전, 조직 배양 상층액을 마이크로 원심분리기로 13,000 RPM에서 1~2분간 원심분리하십시오. 현미경으로 세포를 관찰하여 단층(monolayer) 형성을 확인한 후 감염 과정을 진행하십시오. 1× PBS 1 mL로 세포를 두 번 세척하십시오.이전 단계에서 원심분리한 조직 배양 상층액 200 µL를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 바이러스 흡착 1시간 동안 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 10분마다 플레이트를 흔들어 줍니다. MDCK 세포에서 감염 배지를 제거하고, 1 µg/mL의 TPCK trypsin이 포함된 DMEM 0.3%BA 1%PS 2 mL를 첨가합니다.계대 배양 후 48~72시간이 지나면 MDCK 감염 세포에서 세포병성 효과가 관찰될 것입니다. 형질전환 효율과 바이러스 양에 따라 세포병성 효과는 세포의 원형화, 사멸 및 표면에서의 탈락 등으로 나타납니다. 그다음, 조직 배양 내 바이러스의 존재를 확인하기 위한 분석을 위해 MDCK 세포로부터 snat을 분리하십시오.세포 파편을 제거하기 위해 상층액을 13,000 RPM에서 1~2분 동안 원심 분리한 후, 이를 새로운 원심 분리 튜브로 옮겨 함께 배아 닭란에 감염시킵니다. 광원 캔들링 박스를 사용하여 10일 된 계란의 기낭과 양막강 사이의 경계면을 확인합니다. 5 mL 주사기 바늘을 이용하여 경계면 테두리에 연필로 표시합니다.1 mL 주사기로 달걀 껍데기에 구멍을 냅니다. 각 달걀에 앞서 준비한 조직 배양 상층액 200 µL를 접종합니다. 면봉을 사용하여 녹은 왁스로 달걀 껍데기의 구멍을 메웁니다.Allantoic fluid를 수확하기 전, 감염된 달걀을 37°C에서 2~3일 동안 배양합니다. 이후 닭 배아를 사멸시키고 혈액을 응고시키기 위해 닭 달걀을 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 무균 상태를 조성하기 위해 달걀 껍질을 70% ethanol로 세척합니다.숟가락으로 두드려 기실 위쪽의 알껍데기를 조심스럽게 엽니다. 1 mL 바늘이 장착된 포셉을 사용하여 깨진 알껍데기를 제거합니다. 난황이 터지지 않도록 주의하며 배아막을 제거합니다.스패튤라를 사용하여 닭 배아를 고정하고, 10 mL 피펫을 알란토아액(allantoic fluid)으로 안내합니다. 가능한 한 많은 알란토아액을 수집하십시오. 각 계란당 8~12 mL의 액체를 얼음 위에 놓인 15 mL 원심분리 튜브에 담습니다.계란 노른자가 깨지거나 섞이지 않도록 주의하며 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 알란토액(allantoic fluid)을 얼음 위에 놓인 새 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. HA 분석법을 통해 회수된 바이러스의 존재 여부를 확인할 때까지 알란토액이 담긴 튜브를 4°C에서 보관합니다. HA 분석은 VBO 96-well 플레이트를 사용하며, 1X PBS를 음성 대조군으로, 조직 배양액을 양성 대조군으로 하여 수행합니다.Allantoic fluid를 상등액과 함께 분리합니다. 비-저항성 인플루엔자 바이러스 감염된 난황액은 항상 NAHA 분석에 포함되어야 합니다. V-bottom 96-well 플레이트의 각 웰에 1X PBS 50 µL를 분주합니다. 첫 번째 웰에 MDCK 조직 배양 상등액 및/또는 감염된 유정란에서 얻은 Allantoic fluid 50 µL를 추가하고, 다음 웰들에 대해 2배 단계 희석을 수행합니다.마지막 웰에서 남은 50 µL를 버립니다. 각 웰에 0.5~1% 닭 적혈구 50 µL를 첨가합니다. V-bottom 96-웰 플레이트를 얼음 위에서 30~45분 동안, 또는 음성 대조군 PBS 샘플의 바닥에 붉은색이 보일 때까지 배양합니다. MDCK 조직 배양 상층액 및/또는 감염된 난의 전란액 내 바이러스의 존재 여부는 닭 적혈구의 헤마글루티닌 반응을 이용하여 육안으로 결정할 수 있습니다.바이러스가 존재하면 혈구 응집이 유도되는 반면, 바이러스가 없으면 웰 바닥에 적혈구 펠렛이 형성됩니다. 또한, 조직 배양 상층액 또는 유정란의 난낭액을 접종한 세포에서 세포 원형화, 사멸, 표면 탈리 등의 CPE가 나타나면 인플루엔자 바이러스의 경우 바이러스 복구가 성공적으로 이루어졌음을 시사합니다. HA 분석에서 양성 신호를 얻으려면 약 10³에서 10⁴ plaque forming units(pfu)가 필요합니다. 따라서 HA 분석과 병행하여 면역형광 분석을 수행함으로써 실제 음성 결과인지를 확인할 수 있습니다.형광 표지 항체로 감염된 세포를 염색하여 개별 바이러스 입자의 존재를 검출할 수 있으므로, 면역형광법을 사용할 경우 HA 음성인 상청액이나 Allantoic fluid가 양성으로 나타날 가능성이 있습니다. 이 경우, MDCK 세포나 계란에서 다시 패키징하여 바이러스를 증폭시켜야 합니다. 2차 계대의 Allantoic fluid 또는 조직 배양 상청액은 이제 HA 분석에서 명확하게 양성으로 나타나야 합니다.지금까지 플라스미드 DNA로부터 인플루엔자 바이러스를 복구하는 방법을 살펴보았습니다. 플라스미드 DNA로부터 인플루엔자 바이러스를 복구하는 과정은 간단하고 명확합니다. 본 프로토콜은 플라스미드 DNA로부터 재조합 인플루엔자 바이러스를 복구하기 위해 실험실에서 최초로 수행되었습니다.재조합 바이러스당 세 번의 독립적인 형질전환을 권장합니다. 두 종류 이상의 재조합 인플루엔자 바이러스 구조화를 시도하는 경우, 구조화할 바이러스 수에 맞춰 단계별 규모를 조정하십시오. 플라스미드 DNA로부터 재조합 인플루엔자 바이러스를 구조화하기 위한 다음의 형질전환 및 감염 프로토콜은 6웰 플레이트 기준의 숙련 기술입니다.감염된 알에서 LAN 체액을 채취하기 위한 모든 과정은 무균 조건 하에 수행됩니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

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