를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 ³¹ P NMR 분광학

다음 실험의 전반적인 목적은 분리 관류된 마우스 심장에서 심장 기능과 에너지 대사를 관찰하는 것입니다. 이는 마우스 심장을 LOR 모드로 관류함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로 glucose와 pyruvate가 첨가된 Krebs hand select 버퍼를 사용하며, 좌심실(lv)에 물이 채워진 벌룬을 삽입하여 실험 동안 심장 기능을 지속적으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

다음으로, 심장을 10 millimeter NMR 튜브에 넣고 자석 안에 삽입하여 TP의 포스포크레아틴 인산염의 공명을 관찰함으로써 심장 에너지 대사를 평가하며, LV 압력파와 P 31 및 질량 분석 p를 기반으로 심장 기능과 에너지 대사를 보여주는 무기 인산염 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 워싱턴 대학교 마취과학과 MIT Cadre 대사 센터의 Steve Kitz입니다. 오늘은 31 PNMR 분광법과 결합된 고립 심장 관류 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 생체 공학 마우스 모델의 심장 기능과 에너지 대사를 평가하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 프로토콜을 시작하기 위해, 1 L의 Krebs-Henseleit 또는 KH 완충액을 준비하십시오.

혼합물에 5% carbon dioxide와 95% oxygen 기포를 10분에서 15분 동안 주입합니다. 그 다음 2 mM calcium chloride를 첨가하고, 이어서 기질인 10 mM glucose와 0.5 mM pyruvate를 첨가합니다. 본 실험에서는 P 31 Spectra를 한 번 획득할 때마다 두 개의 별도 시스템을 동시에 사용합니다.

심장 기능을 평가하기 위해 BRUER 14 T 자석을 advanced three 콘솔 및 top spin V 2.1 소프트웨어가 설치된 컴퓨터와 연결합니다. 맞춤 제작된 심장 관류 시스템을 power lab과 연결합니다. Four 30 데이터 획득.

데이터 분석을 위해 lab chart PRO six 소프트웨어가 장착되어 있습니다. 심장 관류 장치는 STH 펌프 컨트롤러로 제어되는 mini pulse three 연동 펌프를 포함하며, 이는 KH 완충액을 심장으로 관류하는 데 사용됩니다. NMR 실험 중 온도 조절은 매우 중요합니다. 가열 순환기를 사용하여 심장이 자석 내부에 있는 동안 온도를 37.0에서 37.5 °C 사이로 유지하며, 광섬유 온도 프로브를 사용하여 실험 기간 동안 온도를 모니터링합니다.

실험 전 과정 동안, LV 압력과 관류압은 데이터 수집 시스템에 연결된 압력 변환기를 통해 모니터링되며, 제공된 소프트웨어를 통해 표시됩니다. LV 압력을 모니터링하는 데는 생리학적 변환기가 사용되며, 관류압을 모니터링하는 데는 일회용 혈압 변환기가 사용됩니다. 마지막으로, 가온된 산소화 완충액을 심장에 공급하기 위해 탯줄(umbilical cord)을 사용합니다.

자석 내부로 진입한 후, 실험을 시작하기 전에 표준 모멘트 마노미터를 사용하여 압력 트랜스듀서를 보정하십시오. 먼저 트랜스듀서에 압력을 가하지 않은 상태에서 보정값을 0으로 설정하십시오. 그 다음, 모멘트 마노미터를 팽창시켜 더 높은 압력을 가하십시오. 이 값을 컴퓨터 프로그램에 입력하십시오.

그런 다음, 이 피그 모멘트 마노미터(fig moment manometer)를 기지의 압력으로 팽창시키고 컴퓨터 화면에서 이를 확인함으로써 압력 트랜스듀서가 적절하게 보정되었는지 확인하십시오. 압력 트랜스듀서의 보정이 완료되면, 150 millimolar sodium phosphate 표준 시료가 들어 있는 10 millimeter NMR 튜브를 사용하여 NMR 프로브를 보정하십시오. 보정은 top spin 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행합니다.

먼저, 인 공명 주파수를 설정하기 위해 샘플을 튜닝합니다. 그다음 샘플을 심(shim)하여 균일한 자기장을 생성합니다. 이러한 초기 보정은 신호를 원활하게 하며 데이터 획득 기간을 시작하는 데 필요한 시간을 단축시킵니다.

마우스 심장 적출을 시작하기 위해 심장을 프로브 내에 배치한 후, 응고를 줄이기 위해 헤파린 200 units를 마우스의 복강 내에 주사하십시오. 5분 후, sodium Pentobarbital 175 mg/kg을 복강 내로 투여하십시오. 마우스가 마취되면 등을 바닥에 대고 눕힌 뒤, 가슴 부위가 노출되도록 팔다리를 테이프로 고정하십시오.

마우스가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기 반응(toe pinch)을 수행합니다. 가위로 복강과 흉강을 절개하고, 포셉을 사용하여 늑골을 젖혀 흉강을 노출시킵니다. 폐 조직을 잡고 곡선 가위로 심장을 조심스럽게 들어 올립니다.

심장 뒤쪽의 대혈관들을 절단하고, 심장이 완전히 분리될 때까지 마우스의 머리 방향으로 천천히 진행합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 KH 완충액에 심장을 넣어 정지시킵니다. 장기들을 얼음 위에 유지하며 신속하게 폐를 제거합니다.

흉선의 엽을 확인하고 부드럽게 젖혀 대동맥을 노출시킵니다. 그 다음 흉선을 제거합니다. 마지막으로 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 대동맥을 분리합니다.

미세 봉합용 핀셋을 사용하여 일반적으로 대동맥의 양쪽 벽을 잡아 내강을 노출시킵니다. 그런 다음 대동맥을 캐뉼라 위에 조심스럽게 배치합니다. 캐뉼라는 외경 0.965 millimeter 폴리에틸렌 튜브로 제작되었습니다.

미세 혈관 클램프로 대동맥을 고정하고 대동맥 주변을 빠르게 봉합사로 묶습니다. 봉합을 마친 후 클램프를 제거합니다. 포셉을 사용하여 캐뉼라가 대동맥 기부 위에 있는지 주의 깊게 확인합니다.

심장을 제자리에 고정하는 데 필요한 추가 결찰사를 묶습니다. 포셉과 미세 가위로 불필요한 조직을 제거합니다. 그런 다음 좌심방이(left oracle)에 작은 절개를 넣습니다.

심장을 부드럽게 잡고 0.61 millimeter od 폴리에틸렌 튜브를 좌심방과 좌심실강을 통해 심첨단 밖으로 조심스럽게 삽입합니다. 남은 튜브 부분을 잘라냅니다. 다음으로, 공기를 뺀 물로 채워진 풍선을 심방을 통해 좌심실로 삽입합니다.

접착 테이프를 사용하여 풍선을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 연동 펌프의 속도를 점진적으로 높여 심장에 충분한 유량이 공급되도록 합니다. 심장을 NMR 프로브에 넣을 때까지 약 2 mL/min에 해당하는 일정한 유량으로 KH 완충액을 사용하여 심장에 관류를 계속합니다.

NMR 분광법을 위한 LV 압력 트랜스듀서의 작동 여부를 확인하기 위해 마이크로미터 시린지를 사용하여 소량의 부피로 LV 풍선을 팽창시킵니다. 먼저, 심장을 10 millimeter NMR 튜브에 조심스럽게 삽입합니다. 튜브가 적절한 위치로 유도되도록 돕기 위해 NMR 튜브 주변에 와이드 보어 스피너를 배치합니다.

프로브 내부에서 전체 장치를 점착 테이프로 탯줄에 단단히 고정합니다. 그다음, 심장이 들어 있는 NMR 튜브가 10 millimeter NMR 프로브의 코일 내부에 위치할 때까지 탯줄을 자석의 상부 보어(upper bore)로 천천히 내립니다. 심장이 프로브 내의 적절한 위치에 놓이면, 관류압이 80 millimeters of mercury가 되도록 기생 펌프(parasitic pump)의 유량을 조절합니다.

펌프 컨트롤러의 유지(hold) 메커니즘을 활성화하여 관류압을 유지하십시오. 심장이 평형 상태에 도달할 수 있도록 15~20분간의 평형 시간을 둡니다. 평형 시간 동안 LV 풍선의 부피를 조절하여 이완기말 압력을 8~10 mmHg로 맞춥니다.

그 다음, 가능한 최적의 인 신호를 얻기 위해 분광계 파라미터를 최적화합니다. 인 핵이 공명하는 주파수가 되도록 라디오 펄스를 설정하여 NMR 기기를 조정합니다. 그런 다음 평형 도달 기간 이후에 자기장이 균일해지도록 샘플을 심(shim) 조절합니다.

여러 개의 P 31 NMR 스펙트럼 획득을 시작합니다. 각 스펙트럼의 획득 기간은 자석의 자기장 세기, 시료의 크기 및 특정 실험에 필요한 신호 대 잡음비에 따라 달라집니다. 본 실험에서는 14 Tesla 자석을 사용하여 60도 플립 각도(flip angle)와 2.0초의 지연 시간을 갖는 20 microseconds의 무선 주파수 펄스를 256회 가하여 얻은 신호를 평균함으로써 스펙트럼을 획득합니다.

이 실험은 약 10분이 소요됩니다. 심장 기능의 일반적인 측정 지표인 LV 발생압(developed pressure)은 수축기 압력에서 이완기말 압력(EDP)을 빼서 구합니다. 정상적인 C 57 black six 마우스의 경우, 8~10 mmHg의 고정된 이완기말 압력에서 심장 LV 발생압은 통상적으로 100~110 mmHg 사이입니다.

대조군 및 대동맥 밴딩 마우스의 대표적인 스타일링 곡선이 제시되어 있습니다. 수축 기능은 LV 벌룬의 부피로 결정된 LV 부피 증가에 따른 LV 발달 압력으로 나타냅니다. 이완 기능은 LV 부피 증가에 따른 EDP로 나타냅니다.

분리 관류된 마우스 심장의 P 31 NMR 스펙트럼은 포스포크레아틴(PHOSPHOCREATINE 또는 PCR), TP 유래의 3개 인산기, 그리고 무기 인산(inorganic phosphate 또는 pi)의 신호를 제공합니다. 여기서 PI 피크는 상대적으로 작게 나타납니다. 이는 피루브산 또는 지방산이 공급된 호기성 관류 심장의 전형적인 특징입니다.

허혈 기간 동안 포도당 외에도, 이 피크는 증가하는 반면 PCR 피크는 감소합니다. 지금까지 실험 중에 심장 기능과 에너지 대사를 동시에 측정할 수 있도록 마우스 심장을 관류 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 심장에 관류가 충분히 이루어지는지 확인하는 것이 중요합니다.

그렇지 않으면 NMR 데이터의 신뢰성이 떨어질 것입니다. 이것으로 마치겠습니다. 감사합니다. 실험에 좋은 결과 있으시길 바랍니다.