Name: 를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 P NMR 분광학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 랑겐도르프 관류법과 31P NMR 분광법을 결합하여 고립된 마우스 심장의 기능과 에너지 대사를 동시에 측정하는 방법입니다. 이 기술은 심장 생리학 및 대사 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자는 실험의 NMR 분광 부분 동안 그녀에 대한 지원 린 스펜서 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 기금 R01 HL059246 국립 연구소, R01 HL067970, R01 HL088634 (박사 티안로)와 F32 HL096284 (박사 Kolwicz로)의 보조금에 의해 지원되었다.

<ol><li> 이러한 실험의 경우, 두 개의 시스템을 동시에 활용하고 있습니다. 31 P 스펙트럼 취득, Bruker 14T 자석의 이동이다 III 콘솔 TopSpin V2.1 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 인터페이스입니다. 심장 기능의 평가, 정의 내장된 심장 재관류 시스템은 데이터 분석을위한 LabChartPro 6 소프트웨어를 갖춘 PowerLab 30분의 4 데이터 수집과 인터페이스입니다. </li><li> 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5.3mM KCl, 1.2mM MgSO 4, 118mM NaCl, 25mM NaHCO 및 3 : 실험 당일, 크렙스 - Henseleit 버퍼의 1리터은 다음과 같이 준비합니다. 혼합물은 다음 5% CO 2 / 95% 이전 2mM CaCl 2의뿐만 10-15분에 대한 O 2 부풀어 오른 모양이다. 마지막으로, 기판은, 10 MM 포도당과 0.5mM pyruvate의 형태로, 추가되었습니다. </li><li> 실험 도중 온도 조절이 중요합니다. 온수 circulators가 37.0 사이의 온도를 유지하는 데 사용됩니다 - 37.5 ° C 심장이 자석 안에있는 동안. 온도 광섬유 온도 프로브를 사용하여 실험 기간 동안 감시하고 있습니다. </li><li> 재관류 압력과 왼쪽 심실 압력은 데이터 수집 시스템에 연결된 및 포함된 소프트웨어를 사용하여 표시되는 압력 트랜스 듀서를 통해 모니터링됩니다. 이들은 이전 실험 표준 혈압계로 보정됩니다. 또한, 압력 라인은 모든 기포를 제거하기 위해 적절하게 플러시됩니다. </li><li> 150 MM의 인산 나트륨 (KH 버퍼의 이온 강도에 해당되는)의 표준 샘플 전에 심장의 삽입에 프로브를 '교정'하는 데 사용됩니다. 이것은 신호를 촉진하고 심장이 프로브 내에 위치하면 수집 기간을 시작하는 데 필요한 시간을 감소시킵니다. </li><li> 응고를 줄이려면 마우스를 5 분 후에 헤파린 IP 200 유닛, 나트륨 pentobarbital (175 MG / kg) IP가 주어집니다로 주입됩니다. </li><li> 심장이 빠르게 excised (그대로 폐, thymus)와 얼음 차가운 KH 버퍼에 체포됩니다. </li><li> 얼음에 보관하는 동안, 폐 빠르게 제거됩니다. thymus의 엽 (叶)은 식별하고 부드럽게 대동맥을 노출 뒤로 벗겨 수 있습니다. thymus가 제거됩니다. 대동맥은 다음 조심스럽게 모든 주변 조직을 제거하여 격리됩니다. </li><li> 마이크로 suturing의 집게는 부드럽게 루멘을 폭로하는 대동맥의 양쪽 벽을 보유하는 데 사용됩니다. 대동맥은 신중 0.965 mm OD 폴리에틸렌 관 (PE50)에서 만든 정맥에 배치됩니다. 봉합이 빠르게 대동맥 주위에 묶인 상태에서 대동맥은 마이크로 혈관 클램프와 장소에서 개최됩니다. 클립이 제거되고 포셉는 조심스럽게 정맥은 대동맥 뿌리 위에 있는지 확인하는 데 사용됩니다. 추가 관계는 장소에 마음을 가질 필요 추가됩니다. </li><li> 별도의 조직은 집게와 microscissors를 사용하여 제거됩니다. 작은 절개는 왼쪽 외이로 이루어집니다. 부드럽게 마음을 누른 상태에서 0.61 mm OD 폴리에틸렌 관 (PE10)는 신중하게 꼭대기를 통해 좌심방, LV의 캐비티, 밖으로 삽입됩니다. 초과 관이 줄어들 수 있습니다. </li><li> deflated 물이 채워진 풍선은 LV에 아트리움을 통해 삽입하고 접착 테이프 또는 봉합을 사용하는 장소에서 개최됩니다. 연동 펌프 속도는 점차 심장에 충분한 흐름을 제공하기 위해 증가됩니다. 마음 NMR probe에 장소 때까지 심장은 약 2 ML / 분에 상응하는 지속적인 흐름과 함께 perfused 될 것입니다. LV 풍선은 LV 압력 변환기가 작동하는지 확인하기 위해 마이크로 미터 주사기를 사용하여 작은 볼륨 높게됩니다. </li><li> 마음은 신중하게 10mm의 NMR 튜브에 삽입됩니다. 넓은 구멍 "스피너는"튜브 프로브 내의 적절한 위치로 안내하는 데 사용됩니다. 전체 장치는 다음 단단히 접착 테이프와 함께 '탯줄'에 첨부되어 있습니다. </li><li> 심장 / NMR 튜브 10mm NMR 프로브의 코일 내부 때까지 탯줄은 천천히 자석의 위쪽 구멍으로 저하됩니다. </li><li> 마음이 프로브 내의 적절한 위치에되면, 연동 펌프 흐름이 80mmHg의 재관류 압력을 달성하기 위해 조정됩니다. (최대이 시점에 마음이 약 2 ML / 분 일정한 흐름 perfused 것을 기억). 재관류 압력은 다음 펌프 컨트롤러에있는 "대기"메커니즘을 사용하여 유지됩니다. 마음은 그때 15 - 분 평균 기간을 허용합니다. 그 시간 동안, LV 풍선의 크기는 80-10 mmHg의 최종 diastolic 압력을 달성하기 위해 조정됩니다. </li><li> 평균 기간 동안, 그것은 최상 인 신호를 얻기 위해서는 분광계 매개 변수를 최적화하는 것이 필요합니다. 이것은 인 핵이 resonates되는 빈도 ( "조정")에서 라디오 펄스를 설정하고 ( "shimming") 자장이 동질하여 수행됩니다. </li><li> 평균 기간 후, 여러 31 P NMR 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 각 스펙트럼에 대한 수집 기간은 t에 따라 달라집니다그는 필드 자석의 강도, 샘플의 크기, 그리고 구체적인 실험에 필요한 잡음 비율로 신호. 스펙트럼은 2.0 초 60도 플립 각도와 지연 20 μs 256 무선 주파수 펄스에서 얻은 신호를 평균하여 14 Telsa 자석을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 실험은 약 10 분 필요합니다. </li></ol> 대표 결과 데이터 수집 하드웨어 및 LabChart 소프트웨어에서, 심장 기능의 몇 가지 매개 변수는 실험 프로토콜을 통해 측정할 수 있습니다. 심장 기능의 일반적인 측정은, 좌측 심실 개발 압력 (LVDevP)은 수축기 혈압 (그림 1)에서 최종 diastolic 압력 (EDP)를 빼서에 의해 얻어진다. 이 법안은 마우스의 긴장과 심장 (즉, 압력 과부하)의 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나, 일반 C57BL6 마우스 심장 LVDevP에서 80-10 mmHg의 고정 최종 diastolic 압력 10​​0-110 mmHg 사이에 일반적으로있다. 또한, LabChart 프로그램은 LV 압력 파의 주기적 측정에 따라 심장 박동수의 측정을 위해 수 있습니다. 다시,이 법안은 다를 수 있지만 마음이 본질적인 요금으로 이길 수있을 때 전형적인 값은 350-400 BPM 있습니다. 그러나 심장은 심장 박동이 420 BPM에 보관됩니다 서성 거려 시스템을 사용하여 표준화하실 수 있습니다. 또한, 수축성 (+ DP / DT)과 휴식 (-dP/dt)의 조치는 LV 압력 파의 첫 번째 파생을 사용하여 추정 수 있습니다. 실험 프로토콜 동안 그것은 압력 볼륨 관계를 통합하여 스탈링 메커니즘을 평가하기 쉽습니다. 이것은 LV 풍선 볼륨의 점진적인 증가를 만들고 LVDevP뿐만 아니라 EDP을 지적하여 수행됩니다. 이러한 값은 다음 그림 2에서 묘사된 꾸몄다 수 있습니다. 스탈링 곡선은 80-10 mmHg의 EDP을 달성하기 위해 필요한 볼륨 LV 챔버 차원의 간접적인 아이디어를 줄 수 지적 최적이지만. 이 컨트롤에 비해 확대 마음은 더 큰 볼륨을 필요로하는 동안 일반적으로 작은 풍선 볼륨이 필요합니다 hypertrophied 마음으로 banding 대동맥의 모델에 사용할 수 있습니다. 표 1은 재관류 프로토콜 동안에 얻은 대표적인 심장 기능 데이터를 표시합니다. 31 P NMR 분광계는 phosphocreatine의 신호 (PCR)과 ATP (γ - ATP, α - ATP 및 β - ATP)뿐만 아니라 그림 2에 표시된 무기 인산염 (PI)에서 세 개의 인산염을 제공할 것입니다. 이 봉우리 각 분석 곡선 아래 영역에 대한 값을 제공합니다. ATP의 양은는 γ - ATP와 β - ATP 영역을 평균하여 추정된다. (NAD 분자가 전체 신호의 알려지지 않은 부분에 기여하기 때문에 α - ATP가 사용되지 않습니다.) 심장의 활기찬 상태는 PCR과 ATP 지역 (ATP 비율 PCR)의 지수에 의해 결정됩니다. 1.7 기본 기판으로 포도당와 함께 제공되는 마우스 중심부에 -이 값은 일반적으로 1.5입니다. 31 P NMR은 ATP 또는 PCR 직접 조치를 제공하지 않습니다 있지만, 봉우리의 면적은 샘플에서 화합물을 포함하는 인의 금액에 비례합니다. 이러한 신호 값은 다른 방법을 사용하여 예상하실 수 있습니다. 예를 들어, 마음 일대에서 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)에 의해 ATP의 직접적인 조치는 평균 농도를 얻을 수 있습니다. 이 값은 다음 스펙트럼에서 관찰된 평균 ATP 영역을 교정하는 데 사용할 수 있습니다. PCR 농도는 ATP 영역에 상대적인 PCR 지역에 따라 계산하실 수 있습니다. 그것은 PCR 신호에 무기 인산염의 상대 화학 시프트 (PI) 신호를 분석하여 산도를 측정하는 것도 가능합니다. 다른 라디오 펄스 시퀀스, 크레아틴 키나제 반응 속도 또는 ATP 합성 반응 속도를 사용하여 1도 측정할 수 있습니다. 2 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 절연 perfused 마음에서 표 1.베이스 심장 기능을 수행합니다. LVDevP : 왼쪽 심실 개발 압력, LVEDP : 왼쪽 심실 최종 diastolic 압력, HR : 심장 박동, RPP : 속도 압력 제품, + DP / DT : 첫 번째 유도체 LV 압력 긍정, -dP/dt : 첫 번째 유도체 LV 압력 부정, PP : 관류 압력, CF : 관상 동맥 흐름. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> LabChart Pro 소프트웨어에서 그림 1. 대표 LV 압력 파도. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 컨트롤 (실선)과 대동맥 밴드 (점선 라인) 마우스에서 대표 스탈링 곡선. A)로 증가 LV 볼륨 이상 LVDevP으로 표시 수축기 기능은 LV 풍선의 부피에 의해 결정됩니다. B) 증가 LV 볼륨 이상 EDP로 표현으로 Diastolic 기능은 LV 풍선의 부피에 의해 결정됩니다. LVDevP : 왼쪽 심실 개발 압력 (수축기 마이너스 diastolic Pressure); EDP : 최종 diastolic 압력. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 절연 perfused 마우스 마음의 그림 3. 대표 31 P NMR 스펙트럼. 비교적 작은 파이 피크를 확인합니다. 포도당 이외에 pyruvate 또는 지방산와 함께 제공된 aerobically perfused 마음에서이 절정을 최소화해야합니다. 국소 빈혈의 기간 동안,이 피크 증가 PCR 피크가 감소하면서. α - ATP 피크의 오른쪽 어깨를 확인할 수 있습니다. 이것은 NAD 분자의 공헌이다. PI : 무기 인산염, PCR : phosphocreatine, ATP : 아데노신 삼인산.

<ol><li>Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+increased+glycolysis+in+the+hypertrophied+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart.</a> Hypertension. 44, 662-667 (2004).</li>
<li>Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+creatine+kinase+enzyme+kinetics+in+diabetic+cardiomyopathy.+A%2831%29P+NMR+magnetization+transfer+study+of+the+intact+beating+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).</li>
<li>Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles.</a> Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).</li>
<li>Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngwall%2C+JS+%22Cardiovascular+physiology+in+the+genetically+engineered%22">Cardiovascular physiology in the genetically engineered</a>. Hoit, B. D., Walsh, R. A. , Kluwer. Boston. 151-163 (2002).</li>
<li>Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+contractile+and+metabolic+reserve+in+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha-null+hearts+can+be+rescued+by+increasing+glucose+transport+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization.</a> Circulation. 112, 2339-2346 (2005).</li>
<li>Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glucose+uptake+and+oxidation+in+mouse+hearts+prevent+high+fatty+acid+oxidation+but+cause+cardiac+dysfunction+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity.</a> Circulation. 119, 2818-2828 (2009).</li>
<li>Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+remodels+metabolic+network+in+favor+of+cardiac+glycogen+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage.</a> J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).</li>
<li>Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+energy+homeostasis+in+mouse+hearts+overexpressing+dominant+negative+alpha2+subunit+of+AMP-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase.</a> J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).</li>
<li>Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+increased+glucose+entry+on+mouse+hearts+during+normal+aging+and+ischemic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress.</a> Circulation. 116, 901-909 (2007).</li>
<li>Tian, R., Abel, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li>
<li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li>
<li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Langendorff - perfused 절연 마우스 중심부에 31 P NMR 분광법은 신뢰성과 재현성 데이터를 제공합니다. 3, 4 단, 그것은 LV 풍선의 대동맥과 삽입의 cannulation은 안정적인 심장의 성능을 수 있도록 적절하게 이러한 수행하는 필수적입니다 NMR 안에있는 동안 관. 또한, 온도 조절은 적절한 기본 기능을 달성하기 위해 답해야 해요. 좋은 analyzable NMR 스펙트럼을 얻기에있는 중요한 요인은 노이즈 비율로 신호를 증가하고있다. 이것은 최적의 &quot;조정&quot;을 보장하고 샘플의 &quot;shimming&quot;에 의해 얻을 수 있습니다. 마찬가지로 프로토콜 텍스트에 언급된 사전 심장의 삽입에 대한 표준 샘플의 사용이 용이하게하실 수 있습니다. 적절한 크기의 &quot;샘플&quot;이 또한 도움이 그것이다. 100 개 미만 MG 무게 하트는 일반적으로 낮은 PCR 및 ATP 신호 있으므로 수집 시간이 증가 좋은 인 스펙트럼을 얻기 위해 필요합니다 제공합니다. 심장 기능과 에너 지론에 관한 추가 정보를 저장하기 위해 기존의 프로토콜을 수정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 다른 지방산의 조합 (낮은 높은 농도에서), 락트 산, ketones, 그리고 인슐린의 존재를 포함할 수 있습니다 혼합 기판 버퍼와 마음을 perfused 있습니다. 재관류 버퍼의 안정 동위 원소의 사용 (즉, 기판 표시 13 C)와 함께, 우리는 TCA 사이클을 표시 아세틸 COA의 상대적 기여에 의해 기판 활용도를 추정하는 능력을 보유하고 있습니다.이 응용 프로그램에 5-7 우리는 isotopomer을 수행 13 C NMR 분광법 13 C3 - 13 C4 - 글루 탐 산염의 분석. 이것은 재관류 프로토콜의 끝에 마음을 동결 - 클램핑 및 냉동 조직의 추출을 수행합니다. 이것은 분석이 별도의 설치 매개 변수와 함께 다른 프로브의 사용을 필요로 추가 실험을 것입니다. 31 P NMR 분광법을 사용하여 심장에 2 deoxyglucose 인산염의 시간 의존 축적을 모니터링하는 동안 다른 응용 프로그램은 버퍼에 deoxyglucose과 포도당의 대체가 포함됩니다. 이 방법은 심근 포도당 이해의 측정을 위해 수 있습니다. 또한 7, 8, 저희 연구실은 국소 빈혈 / reperfusion 높은 워크로드 도전 구성된 재관류 프로토콜의 심장 기능과 에너 지론을 분석했다. 6, 8-10은 요약, 절연 마우스 마음 31 P NMR 분광법은 복잡한 장비의 사용을 필요로하는 기술적으로 도전적인 절차입니다. 그러나, 그것이 산출하는 데이터를 새로 개발 했나 보지 마우스 모델의 기능과 에너 지론을 분석하고자 연구에 귀중한 것입니다. 저희 연구실 들어,이 기술은 심장 기능, 에너 지론 및 대사에 대한 스트레스의 다양한 결과에 대한 우리의 이해에 매우 중요했습니다. 1, 11, 12

<table><tbody><tr><td>마그네슘 황산염</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 염화물</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소나트륨</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>장비</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>장비</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;ML866/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>장비</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;Quad Bridge Amp&lt;/a&gt;</td><td>장비</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;ML224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pump Controller&lt;/a&gt;</td><td>장비</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltic Pump&lt;/a&gt;</td><td>장비</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;일회용 혈압 트랜스듀서&lt;/a&gt;</td><td>장비</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;MLT0699&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>10mm NMR 샘플 튜브</td><td>장비</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE10</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;생리학적 압력 트랜스듀서&lt;/a&gt;</td><td>장비</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;MLT844&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE50</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>마이크로미터 주사기</td><td>장비</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-1101</td><td></td></tr><tr><td>맥퍼슨 핀셋</td><td>장비</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>카스트라비에호 마이크로 가위</td><td>장비</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Neoptix 신호 조절기</td><td>장비</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Reflex - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 p nmr 분광학

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

새로 개발 했나 마우스 모델은 심혈관 질환의 분자 변경과 모델 사이의 인과 관계를 결정하는 강력한 연구 도구되고 있습니다. 분자 생물학은 신호 경로의 주요 변화를 식별이 필요하지만, 그것은 기능적 중요성에 대한 대리하지 않습니다. 생리는 손상에 metabolites의 생화 학적 평가와 생리를 결합, 함수의 질문에 대한 답변을 제공할 수 있지만, 마음을 박동하는 심장 기능과 에너 지론의 전체 사진 수 있습니다. 년 동안, 우리 연구실은이 작업을 수행하는 핵 자기 공명 (NMR) 분광법와 함께 격리 심장 perfusions을 활용하고 있습니다. 심장의 에너 지론을 수행하여 측정하는 동안 왼쪽 심실 기능이 Langendorff 모드 절연 심장 perfusions에 의해 평가됩니다<sup&gt; 31</supperfused 마음&gt; P 자기 공명 분광법. 이러한 기술은 phosphocreatine 및 ATP 수준의와 함께 심장 기능의 인덱스가 마음을 치고로 동시에 측정할 수로. physiologic 또는 pathologic 스트레스가 제정하는 동안 또한, 이러한 매개 변수는 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어, 국소 빈혈 / reperfusion 또는 높은 작업 부하 도전 프로토콜을 채택 수 있습니다. banding 대동맥이나 심장 병리학의 다른 모델의 사용뿐만 아니라 경향이있다. 에 관계없이 프로토콜 내에서 변종의 유전자 변형 마우스 모델의 분자 수정의 기능과 활기찬 의미가 적절하게 관련 효소 및 대사 경로에 새로운 통찰력에 이르는, 설명하실 수 있습니다. 따라서,<sup&gt; 31</sup고립 perfused 중심부에&gt; P NMR 분광법은 심혈관 질환의 동물 모델에서 중요한 연구 기법이다.

함께 Langendorff 모드 절연 심장 재관류,<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR 분광법은 하나의 실험으로 생화학 및 생리학 분야가 조화를 이루고 있습니다. 프로토콜은 높은 에너지 인산 내용과 동시에 physiologic 기능을 모니터링하는 동안 마음에 매출의 동적 측정을 위해 수 있습니다. 제대로 수행되면,이 심장 에너 지학의 평가에 유용한 기술입니다.

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 P NMR 분광학

생체공학적으로 설계된 마우스 모델은 분자적 변화와 ... 모델 사이의 인과 관계를 규명하는 강력한 연구 도구가 되었습니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 분리 관류된 마우스 심장에서 심장 기능과 에너지 대사를 관찰하는 것입니다. 이는 마우스 심장을 LOR 모드로 관류함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로 glucose와 pyruvate가 첨가된 Krebs hand select 버퍼를 사용하며, 좌심실(lv)에 물이 채워진 벌룬을 삽입하여 실험 동안 심장 기능을 지속적으로 모니터링할 수 있도록 합니다.다음으로, 심장을 10 millimeter NMR 튜브에 넣고 자석 안에 삽입하여 TP의 포스포크레아틴 인산염의 공명을 관찰함으로써 심장 에너지 대사를 평가하며, LV 압력파와 P 31 및 질량 분석 p를 기반으로 심장 기능과 에너지 대사를 보여주는 무기 인산염 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 워싱턴 대학교 마취과학과 MIT Cadre 대사 센터의 Steve Kitz입니다. 오늘은 31 PNMR 분광법과 결합된 고립 심장 관류 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 생체 공학 마우스 모델의 심장 기능과 에너지 대사를 평가하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 프로토콜을 시작하기 위해, 1 L의 Krebs-Henseleit 또는 KH 완충액을 준비하십시오.혼합물에 5% carbon dioxide와 95% oxygen 기포를 10분에서 15분 동안 주입합니다. 그 다음 2 mM calcium chloride를 첨가하고, 이어서 기질인 10 mM glucose와 0.5 mM pyruvate를 첨가합니다. 본 실험에서는 P 31 Spectra를 한 번 획득할 때마다 두 개의 별도 시스템을 동시에 사용합니다.심장 기능을 평가하기 위해 BRUER 14 T 자석을 advanced three 콘솔 및 top spin V 2.1 소프트웨어가 설치된 컴퓨터와 연결합니다. 맞춤 제작된 심장 관류 시스템을 power lab과 연결합니다. Four 30 데이터 획득.데이터 분석을 위해 lab chart PRO six 소프트웨어가 장착되어 있습니다. 심장 관류 장치는 STH 펌프 컨트롤러로 제어되는 mini pulse three 연동 펌프를 포함하며, 이는 KH 완충액을 심장으로 관류하는 데 사용됩니다. NMR 실험 중 온도 조절은 매우 중요합니다. 가열 순환기를 사용하여 심장이 자석 내부에 있는 동안 온도를 37.0에서 37.5 °C 사이로 유지하며, 광섬유 온도 프로브를 사용하여 실험 기간 동안 온도를 모니터링합니다.실험 전 과정 동안, LV 압력과 관류압은 데이터 수집 시스템에 연결된 압력 변환기를 통해 모니터링되며, 제공된 소프트웨어를 통해 표시됩니다. LV 압력을 모니터링하는 데는 생리학적 변환기가 사용되며, 관류압을 모니터링하는 데는 일회용 혈압 변환기가 사용됩니다. 마지막으로, 가온된 산소화 완충액을 심장에 공급하기 위해 탯줄(umbilical cord)을 사용합니다.자석 내부로 진입한 후, 실험을 시작하기 전에 표준 모멘트 마노미터를 사용하여 압력 트랜스듀서를 보정하십시오. 먼저 트랜스듀서에 압력을 가하지 않은 상태에서 보정값을 0으로 설정하십시오. 그 다음, 모멘트 마노미터를 팽창시켜 더 높은 압력을 가하십시오. 이 값을 컴퓨터 프로그램에 입력하십시오.그런 다음, 이 피그 모멘트 마노미터(fig moment manometer)를 기지의 압력으로 팽창시키고 컴퓨터 화면에서 이를 확인함으로써 압력 트랜스듀서가 적절하게 보정되었는지 확인하십시오. 압력 트랜스듀서의 보정이 완료되면, 150 millimolar sodium phosphate 표준 시료가 들어 있는 10 millimeter NMR 튜브를 사용하여 NMR 프로브를 보정하십시오. 보정은 top spin 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행합니다.먼저, 인 공명 주파수를 설정하기 위해 샘플을 튜닝합니다. 그다음 샘플을 심(shim)하여 균일한 자기장을 생성합니다. 이러한 초기 보정은 신호를 원활하게 하며 데이터 획득 기간을 시작하는 데 필요한 시간을 단축시킵니다.마우스 심장 적출을 시작하기 위해 심장을 프로브 내에 배치한 후, 응고를 줄이기 위해 헤파린 200 units를 마우스의 복강 내에 주사하십시오. 5분 후, sodium Pentobarbital 175 mg/kg을 복강 내로 투여하십시오. 마우스가 마취되면 등을 바닥에 대고 눕힌 뒤, 가슴 부위가 노출되도록 팔다리를 테이프로 고정하십시오.마우스가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기 반응(toe pinch)을 수행합니다. 가위로 복강과 흉강을 절개하고, 포셉을 사용하여 늑골을 젖혀 흉강을 노출시킵니다. 폐 조직을 잡고 곡선 가위로 심장을 조심스럽게 들어 올립니다.심장 뒤쪽의 대혈관들을 절단하고, 심장이 완전히 분리될 때까지 마우스의 머리 방향으로 천천히 진행합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 KH 완충액에 심장을 넣어 정지시킵니다. 장기들을 얼음 위에 유지하며 신속하게 폐를 제거합니다.흉선의 엽을 확인하고 부드럽게 젖혀 대동맥을 노출시킵니다. 그 다음 흉선을 제거합니다. 마지막으로 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 대동맥을 분리합니다.미세 봉합용 핀셋을 사용하여 일반적으로 대동맥의 양쪽 벽을 잡아 내강을 노출시킵니다. 그런 다음 대동맥을 캐뉼라 위에 조심스럽게 배치합니다. 캐뉼라는 외경 0.965 millimeter 폴리에틸렌 튜브로 제작되었습니다.미세 혈관 클램프로 대동맥을 고정하고 대동맥 주변을 빠르게 봉합사로 묶습니다. 봉합을 마친 후 클램프를 제거합니다. 포셉을 사용하여 캐뉼라가 대동맥 기부 위에 있는지 주의 깊게 확인합니다.심장을 제자리에 고정하는 데 필요한 추가 결찰사를 묶습니다. 포셉과 미세 가위로 불필요한 조직을 제거합니다. 그런 다음 좌심방이(left oracle)에 작은 절개를 넣습니다.심장을 부드럽게 잡고 0.61 millimeter od 폴리에틸렌 튜브를 좌심방과 좌심실강을 통해 심첨단 밖으로 조심스럽게 삽입합니다. 남은 튜브 부분을 잘라냅니다. 다음으로, 공기를 뺀 물로 채워진 풍선을 심방을 통해 좌심실로 삽입합니다.접착 테이프를 사용하여 풍선을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 연동 펌프의 속도를 점진적으로 높여 심장에 충분한 유량이 공급되도록 합니다. 심장을 NMR 프로브에 넣을 때까지 약 2 mL/min에 해당하는 일정한 유량으로 KH 완충액을 사용하여 심장에 관류를 계속합니다.NMR 분광법을 위한 LV 압력 트랜스듀서의 작동 여부를 확인하기 위해 마이크로미터 시린지를 사용하여 소량의 부피로 LV 풍선을 팽창시킵니다. 먼저, 심장을 10 millimeter NMR 튜브에 조심스럽게 삽입합니다. 튜브가 적절한 위치로 유도되도록 돕기 위해 NMR 튜브 주변에 와이드 보어 스피너를 배치합니다.프로브 내부에서 전체 장치를 점착 테이프로 탯줄에 단단히 고정합니다. 그다음, 심장이 들어 있는 NMR 튜브가 10 millimeter NMR 프로브의 코일 내부에 위치할 때까지 탯줄을 자석의 상부 보어(upper bore)로 천천히 내립니다. 심장이 프로브 내의 적절한 위치에 놓이면, 관류압이 80 millimeters of mercury가 되도록 기생 펌프(parasitic pump)의 유량을 조절합니다.펌프 컨트롤러의 유지(hold) 메커니즘을 활성화하여 관류압을 유지하십시오. 심장이 평형 상태에 도달할 수 있도록 15~20분간의 평형 시간을 둡니다. 평형 시간 동안 LV 풍선의 부피를 조절하여 이완기말 압력을 8~10 mmHg로 맞춥니다.그 다음, 가능한 최적의 인 신호를 얻기 위해 분광계 파라미터를 최적화합니다. 인 핵이 공명하는 주파수가 되도록 라디오 펄스를 설정하여 NMR 기기를 조정합니다. 그런 다음 평형 도달 기간 이후에 자기장이 균일해지도록 샘플을 심(shim) 조절합니다.여러 개의 P 31 NMR 스펙트럼 획득을 시작합니다. 각 스펙트럼의 획득 기간은 자석의 자기장 세기, 시료의 크기 및 특정 실험에 필요한 신호 대 잡음비에 따라 달라집니다. 본 실험에서는 14 Tesla 자석을 사용하여 60도 플립 각도(flip angle)와 2.0초의 지연 시간을 갖는 20 microseconds의 무선 주파수 펄스를 256회 가하여 얻은 신호를 평균함으로써 스펙트럼을 획득합니다.이 실험은 약 10분이 소요됩니다. 심장 기능의 일반적인 측정 지표인 LV 발생압(developed pressure)은 수축기 압력에서 이완기말 압력(EDP)을 빼서 구합니다. 정상적인 C 57 black six 마우스의 경우, 8~10 mmHg의 고정된 이완기말 압력에서 심장 LV 발생압은 통상적으로 100~110 mmHg 사이입니다.대조군 및 대동맥 밴딩 마우스의 대표적인 스타일링 곡선이 제시되어 있습니다. 수축 기능은 LV 벌룬의 부피로 결정된 LV 부피 증가에 따른 LV 발달 압력으로 나타냅니다. 이완 기능은 LV 부피 증가에 따른 EDP로 나타냅니다.분리 관류된 마우스 심장의 P 31 NMR 스펙트럼은 포스포크레아틴(PHOSPHOCREATINE 또는 PCR), TP 유래의 3개 인산기, 그리고 무기 인산(inorganic phosphate 또는 pi)의 신호를 제공합니다. 여기서 PI 피크는 상대적으로 작게 나타납니다. 이는 피루브산 또는 지방산이 공급된 호기성 관류 심장의 전형적인 특징입니다.허혈 기간 동안 포도당 외에도, 이 피크는 증가하는 반면 PCR 피크는 감소합니다. 지금까지 실험 중에 심장 기능과 에너지 대사를 동시에 측정할 수 있도록 마우스 심장을 관류 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 심장에 관류가 충분히 이루어지는지 확인하는 것이 중요합니다.그렇지 않으면 NMR 데이터의 신뢰성이 떨어질 것입니다. 이것으로 마치겠습니다. 감사합니다. 실험에 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

assessment-cardiac-function-energetics-isolated-mouse-hearts-using

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 작품은 비침 투 작은 동물 MRI 및 MRS의 기본 절차를...

비침 투 VIVO에서 스몰 애니멀 MRI 및 MRS : 기본 실험 절차

목표는 physiologic 미리와 afterload 압력의 컨텍스트 내에서 격리된 마음의 mitochondrial 산화 환원 상태를 모니터링하는 것입니다. biventricular 작업 토끼 심장 모델이 제공됩니다. NADH 높은 spatiotemporal 해상도 형광 이미지는 epicardial 조직의 mitochondrial 산화 환원 상태를 모니터링하는 데 사용됩니다.

절연 Biventricular의 NADH 형광 이미징은 토끼 하트 워킹

이 방법은 실험적으로 유도된 심근 허혈이 있는 마우스에서 요오드화 조영제를 사용하여 심장 형태, 기능, 관류, 대사 및 생존력을 평가하기 위해 Quantum Micro-Computed Tomography(MicroCT)를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 인간 심장 질환의 다양한 동물 모델의 비파괴 고처리량 종단 생체 내 이미징에 적용할 수 있습니다.

심근 구조, 기능의 생체 양적 평가에서 관류 및 생존 능력은 심장 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여

여기에서 우리는 심혼에 있는 심실 광학 카테터를 심장 벽을 가로질러 흡광도 분광학을 능력을 발휘하기 위하여 공류된 심혼에 이용하는 방법을 소개합니다. 얻은 데이터는 조직 산소 장력뿐만 아니라 기질 활용 및 멤브레인 잠재력에 대한 강력한 정보를 이 유비쿼터스 제제에서 심장 성능 측정과 동시에 제공합니다.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

이 연구는 마우스 심혼의 좌심실 기능 적 파라미터를 정량화하기 위한 포괄적인 심장 혈관 자기 공명 영상 (CMR) 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 CMR 이미지의 수집, 후처리 및 분석뿐만 아니라 다양한 심장 기능 매개 변수의 평가를 설명합니다.

심혈관 자기 공명 영상에 의한 마우스 심장 좌심실 기능, 심근 균주 및 혈역학력의 정량화

우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.

과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

본 프로토콜은 심부전의 마우스 모델에서 이완기 기능을 평가하는 데 유용한 도구 역할을 하는 경식도 페이싱을 통해 압력-부피 관계를 얻는 방법을 설명합니다.

쥐 심부전 모델에서 심박수 의존적 이완기 기능 평가를 위한 속도 제어 절차

이 문서의 마음을 실패하고 왼쪽 심실 벽 스트레스와 기능에 미치는 영향을 정량화의 새로운 히드로 겔을 주입을위한 절차를 설명합니다. 이 절차가 성공적으로 개와 인간에 적용되었습니다.

Algisyl-LVR을 사용하여 마음을 실패의 기능에서 왼쪽 심실 벽 스트레스와 개선의 감소

대비 향상된 심장 자기 공명 (CMR) 영상은 포괄적...

작은 동물 룩 로커 반전 복구 (SALLI) 쥐의 MRI를 사용하여 심장 기능 및 심근 형태학의 평가

우심실 (RV) 부전은 심혈관 질환의 발병 기전에 중요하다, 그러나 제한 방법은 평가를 위해 사용할 수 있습니다. 초음파 영상에서의 최근 발전은 세로 RV의 연구를위한 비 침습적 및 정확한 옵션을 제공합니다. 여기서, 우리 세부 RV 압력 과부하의 뮤린 모델을 사용하여 단계별 심 초음파 방법.

경 흉부 심 초음파에 의한 폐동맥 수축의 마우스 모델에서 마우스 오른쪽 심실 구조 및 기능의 평가

배우세요 랑겐도르프 관류법과 31P NMR 분광법을 결합하여 고립된 마우스 심장의 기능과 에너지 대사를 동시에 측정하는 방법입니다. 이 기술은 심장 생리학 및 대사 연구에 활용됩니다.

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가³¹ P NMR 분광학

더 많은 동영상 탐색