Name: 마우스 요로 감염의 Transurethral 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 요로 감염을 경요도 내 접종법으로 유도하고 세균 배양 및 조직 샘플링을 통해 감염 정도를 정량화하는 방법을. 이 기술은 UTI 연구에 재현 가능한 결과를 제공합니다.

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저자는 자신의 전문 기술 지원을 셸리 샤오와 제니퍼 펜을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 소아 비뇨기과와 스탠포드 소아 연구 기금의 학회에서 부여를 통해 가능하게되었다.

요도 카테터의 I. 준비 <ol><li> 각 마우스 방광과 샘플로 신장을위한 각각 한 cryovial 튜브 5-6 스테인리스 스틸 비즈 (방광, 1.6 mm의 크기 또는 0.9-2.0 mm의 조화) 또는 지르코늄 산화물 비즈 (신장, 0.5 mm 크기)을 놓으십시오. 비드 함유 튜브 압력솥. </li><li> 주변 온도로 냉각 튜브 후, 각각의 스테인레스 스틸 비드 함유 튜브 및 각 지르코늄 산화물 비드 함유 관에 멸균 PBS 400 microliters에 멸균 PBS 200 microliters를 추가합니다. </li><li> 저희는 형수와 Hultgren 13에 기술된 요도 카테터를 준비합니다. 플랫 헤드 포셉 및 고급 가위 (홍채 또는 유사한 유형)의 깨끗한 쌍을 압력솥과 악기는 주위 온도에 냉각 수 있습니다. 70 % 에탄올과 층류 후드의 표면을 닦아주십시오. 후드에서 폴리에틸렌 튜브의 30cm (대략) 세그먼트를 잘라. 무균 살균 세 CC 주사기에 멸균 30 게이지 바늘 (1 / 2 인치 긴 바늘)을 놓으십시오. autoclaved 포셉와 컷 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝을 들고 그것이 허브를 만날 때까 바늘에 튜빙을 슬라이드. 약 2cm의 바늘의 끝을 초과되도록 튜브를 잘라. 멸균 배양 접시에있는 주사기와 장소에서 카테터를 제거합니다. </li><li> 교차 오염의 가능성을 줄이기 위해, 우리는 각각의 마우스를 하나의 카테 테르합니다. 모든 카테터가 만들어진 후, 적어도 30 분 동안 자외선을 조사하기 위해 덮개는 배양 접시에 노출하여 그들을 소독. UV 램프 똑바로 쳐다보지 또는 램프가 활성화하는 동안 모자 신체의 어떤 부분을 노출시키지 마십시오. UV 노출 후, 카테터는 배양 접시에있는 장기 저장할 수 있습니다. 우리는 불임을 유지하기 위해 Parafilm으로 접시를 밀봉하는 것이 좋습니다. </li></ol> II. 동물 접종 <ol><li> 마우스 스트레스 유발 혼란함을 주죠 요인을 방지하기 위해 실험 조작하기 전에 적어도 일주일에 도착해야합니다. 남성 마우스 요도가 ...에 카테 테르를 꽂다 매우 어려운 있기 때문에 여성의 생쥐를 사용합니다. CBA / J는 일반적으로 활용, UTI - 민감한 근친 마우스 변형입니다. 이것이 노화하기 전에 면역 성숙의 윈도우이기 때문에 생쥐, 연령 8 및 12 주 정도 사용해야합니다. 실험의 첫 날, 냉동 세균성 주식의 유리병에 살균 inoculating 루프의 끝부분을 찍어. 적절한 한천 플레이트에 작은 inoculum 및 연속 출력을 다쳤어요. 일반적으로, uropathogenic E. 대장균 (UPEC) 및 기타 종자는 37 Luria - Bertani (LB) 한천에서 밤새 성장 수 있습니다 ° C 주위 공기. UPEC의 계통 LB 한천에 고체, 노란 흰색 반투명​​ 식민지로 성장합니다. 즉시 세균성 주식은 냉동실로 돌아갑니다. Uropathogenic 박테리아 계통 반복, 시리얼 문화와 함께 시간이 지남에 따라 덜 치명이 될 수 있습니다. 따라서, 우리는 각각의 실험에 대한 새로운 한천 플레이트를 줄이 것이 좋습니다. </li><li> 실험의 일 2, 적절한 콜로니 형태를 확인 후, 밤새 국물 문화의 적어도 5 CC에서 한천 플레이트와 장소에서 하나의 식민지를 선택하십시오. LB의 국물이 가장 uropathogenic 박테리아 변종에 사용할 수 있습니다 (37 ° C, 주변 공기 200 RPM). 폭기을 허용하도록 국물 문화 튜브에 느슨하게 뚜껑을 유지. </li><li> 실험 3 일에, 유형 I 필리 표현을 향상시키기 위해, (일반적으로 37 ° C와 200 RPM) 다시 밤새 국물 최초의 국물 문화와 문화의 10 %를 가져가라. 유형 I 필리가 생체내 1 uropathogens에 대한 중요한 독성 인자로 표시되었습니다 이후 시리얼 수프 문화는 박테리아 uropathogenicity을 최적화하는 데 도움이됩니다. 폭기을 허용하도록 국물 문화 튜브에 느슨하게 뚜껑을 유지. </li><li> 실험의 일 4 일 3 국물 문화의 OD 600 측정합니다. 이미 테스트되고있는 세균성 긴장 유명하지 않은 경우, OD 600 cfu 사이의 관계를 결정하기 위해 최소 7 로그 (PBS로 수행 dilutions, LB 한천에서 수행 문화, 37 ° C 부화 야간) 이상의 10 배로 시리얼 희석 도금을 수행 / ML. 엄지의 규칙으로 0.4-0.5의 OD 600 일반적으로 50 microliters 당 1 - 2x10 7 cfu에 해당합니다. OD 600 cfu / ML 사이의 관계가 결정되면, 하나는 PBS의 50 microliters에서 마우스마다 원하는 cfu에 해당하는 OD 600 국물 문화를 조정할 수 있습니다. 일부 작업은 오히려 50 10 microliters의 접종은 kidneys6에 덜 역류에 이르게 것을 제안했다. 그러나, 대부분의 출판물은 마우스 최대 50 microliters의 사용을보고합니다. 일반적으로, 10 6 108 cfu / 마우스하지만, 각각의 박테리아 / 마우스 변형 조합이 경험적으로 생체내에 검증이 필요 사이의 원하는 cfu 범위. </li><li> 그 inocula가 떨어뜨림 후에 즉시 무효화되지 않도록하기 위해 생쥐 전에 전신 마취의 유도하기 위해 최소 30 분 동안 물을 박탈해야합니다. 또 다른 주요 작전 쥐를 scruffing하여 마취 유도 전에 voiding 유도하고 부드럽게 낮은 abdom을 눌러입니다ko 페이지를 참조하십시오. isoflurane 두 2.5 %는 1.8-2 % isoflurane과 유지 보수 마취 다음 8-12주 오래된 여성 CBA 마우스에 대한 안전 유도 복용입니다. </li><li> 마취가 달성되면, 생쥐는 isoflurane 함유 산소에 연결된 nosecone에 삽입 자신의 머리를 위로 향한 위치에 배치됩니다. 낮은 복부는 방광에서 소변을 철수하는 마사지입니다. 방광은 상대적으로 비어있는 경우,이 책략은 소변을 양보하지 않을 수 있습니다. 낮은 복부와 회음부는 70 % 에탄올로 적셔 있습니다. </li><li> 바늘없는 무균 한 CC의 주사기는 원하는 세균 inoculum을 작성하는 데 사용됩니다. 다음 멸균 요도 카테터는 무균 주사기에 배치됩니다. 관만이 1-2밀리미터은 바늘의 끝부분에 말초 남아 있도록 여분의 튜브는 가위로 카테터를 차단합니다. 그런 다음 주사기는 도청과 플런저가 똑바로 모든 거품을 제거하기 위해 주사기와 우울증이다. 정균 윤활의 덩어리가 젤리 멸균 페트리 접시 또는 멸균 주사기 래퍼의 내부에 squirted입니다. 카테터의 끝 (첨부 주사기 포함) 젤리에 담근이다. 여러 박테리아 변종이 같은 실험에서 테스트되고있다면, 다른 변종을 포함하는 카테터에 기름칠을하는 젤리 같은 드롭을 사용하지 않도록주의합니다. </li><li> 확대를위한 스테레오 현미경 (배 줌 범위 0.8x)를 사용하여 anesthetized 마우스 clitoral 후드는 부드럽게 미세 이빨 포셉 한 쌍의와 비 지배적인 손에 쥐었다하고 깊은 분홍색 요도 (外耳道) (노출 cephalad 제기 그림 1). 주사기는 (첨부 카테터)를 연필 그립으로 지배적인 손에 쥐었다하고 카테터의 끝은 45도 각도에서 요도 (外耳道)에 종사합니다. clitoral 후드는 주사기의 긴 축을 따라 뻗어이며, 효과적으로 카테 테르에 요도를 "로딩". 마우스 요도가 중복되어 있기 때문에이 작전 필수적입니다. 카테 테르는 방광 (최대 허브에, 그림 2)으로 쉽게 슬라이드해야하고, 부드럽게 요도의 중복 주름을 탐색하는 데 도움이 twirled 수 있습니다. 카테터가 hubbed되면 그것이 마우스의 긴 축을과 병렬 때까지 주사기가 낮아 수 있습니다. 비 지배적인 손으로 천천히 inoculum을 (적어도 5 초) 주입하는 데 사용되는 지배적인 손으로 카테터와 주사기의 위치를​​ 안정화 있도록 포셉를 놓을 수 있습니다. 액체가 주입하는 동안 카테터 주위에 흐르는 볼 경우 방광 하나가 가득하거나 카테 테르의 질 (요도에 바로 꼬리)에 있습니다. 사출은 즉시 중단하고 카테터의 위치를​​주의 깊게 검사해야합니다. 카테터가 요도에있다면, 주어진 마우스가 실험에 포함되지 않습니다. 반면에, 질에 잃어 버렸어요 카테터가 재지정 수 있으며 사출 다시 시도. 주사 후, 카테터와 주사기가 천천히 마우스 철회 있습니다. </li><li> 관리 세균을 철수시키고 가변 감염 수준으로 이어질 수 있습니다 초기 이후의 접종의 voiding의 가능성을 줄이기 위해 일부 조사는 transurethral inoculation10 후 30 분 동안 마취 생쥐를 유지합니다. 수술 후, 생쥐는 정상적인 호흡 패턴 및 활동의 반환을 확인하는 지속적인 관찰과 함께 깨끗한 온난 화 담요에 복구해야합니다. 일단 동물이 완전히 크롤 링하는 능력을 회복, 그들은 침구 함유 새장을 위해 제공될 수 있습니다. </li></ol> III. 감염된 조직에 측정 CFU <ol><li> 다양한 마우스 UTI 간행물은 6 시간에서 한 주 이상 사후 접종에 문화 결과를보고했습니다. 최적의 시간 지점은 각 세균 / 마우스 스트레인 조합에 대해 경험적으로 결정해야합니다. 무효화 소변은 멸균 페트리 접시 마우스를 scruffing하여 문화 얻을 수 있습니다. 수집된 소변은 항상 얼음에 보관해야합니다. 몇 시간 동안 무효화 소변을 얻기 위해 여러 시도는 마우스 voiding가 자주, 낮은 볼륨 (무효 당 30-100 microliters)이기 때문에, 필요하고, 스트레스에 의존 수 있습니다. </li><li> 무효화 소변 표본을 얻기 후에, 우리는 isoflurane과 경추 탈구를 사용하여 마우스를 희생. 복부는 무균 열립니다. 무효화 소변 표본이 성공적으로 이전 얻은 정보가 아닌 경우, 소변의 작은 금액은 종종 30 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 방광 벽을 통해 aspirated 수 있습니다. </li><li> 하나 또는 둘 모두 신장이 제거 멸균 배양 접시에 최소한 4 개 (각 조각은 50 미만 마이크로 그램한다)에 다진과에 배치됩니다 지르코늄 구슬 / PBS 함유 얼음 cryovials합니다. 방광이 제거 최소 4 조각으로 다진하고, 스테인레스 스틸 비드 /에 위치합니다 PBS 함유 얼음 cryovials합니다. 조직 / 구슬 / PBS 함유 cryovials 것은 총알이 블렌더 균 질기에 배치되고 조직은 일분에 대한 "8"속도 설정을 사용 균질하고 있습니다. 어떤 조직 조각 균질 후 유지하는 것이 일반적입니다. 액체 homogenate의 50-100 microliters가 pipetted 수있는만큼, 고체 파편문제를 반드시하지 않습니다. 균질화 시간이 몇 가지 샘플에 대한 증가하는 경우, 그것은 균질의 일관성을 유지하기 위해 모든 조직에 대해 그렇게 할 중요합니다. 그것이, 교차 오염의 가능성을 피할 개별 샘플에게 표준 균 질기를 사용하여 하나씩 처리를보다 신속하고, 상당히 균질되는 샘플을 가열하지 않기 때문에 우리는 총알 블렌더 균 질기를 활용. </li><li> 수집된 소변 및 조직 homogenates 적어도 두 개 또는 세 10 배로 dilutions은 microtiter 접시에하여야한다. 예비 실험의 경우는 최소 7 10 배로 dilutions를 만들기 위해 신중한 수 있습니다. 적절한 한천의 문화는 최대 100 소변의 microliters, 방광, 및 / 또는 신장 homogenates. 소변 표본은 볼륨 제한 수 있기 때문에, 그것은 10 배로 dilutions를 수행하기 전에 100 microliters 자신의 볼륨을 가지고해야 할 수도 있습니다. 이것이 필요한 경우, 초기 희석은 (10 배 희석 전) 세균성 산출의 최종 계산에 고려해야합니다. 이러한 미디어 그램 부정적인 유기체를위한 선택이기 때문에 우리는, eosin - 메틸렌 블루 또는 MacConkey 한천 배지 (37시 야간 보육 ° C)에 culturing의 UPEC를 선호합니다. UPEC의 변종 유제품을 발효 능력으로 인해 중앙 umbilicated, 빨강 - 분홍색 식민지로 MacConkey 한천 배지에서 성장. </li><li> 하룻밤 문화 후, 각각의 접시 cfu을 계산합니다. 순차적으로 희석 시료의 경우, 50-100 식민지가 포함된 플레이트 희석은 가장 정확한 카운트로 간주됩니다. "뒤로"조직의 밀리그램 당 조직마다 cfu을 계산하거나, ML 당. </li></ol> IV. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 포셉 (사진 맨 위로 넘어)로 cephalad clitoral 후드를 리프팅하여 노출 요도 (外耳道) (어두운 분홍색 조직) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 요도를 Catheterized. 이열의 클리토리스가 방금 카테터 위에 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 블레더 cfu 2 일 uropathogenic E. 함께 8주 오래된 여성 CBA / J 생쥐의 transurethral 감염 후 카운트 대장균. Bladders는 MacConkey 한천에 시리얼 희석 도금에 의해 균질하고 cfu / ML 결정됩니다. 다이아몬드 개별 생쥐에 대한 cfu / ML을 나타냅니다, 수평 막대가 중간 cfu / ML을 나타냅니다.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
<li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li>
<li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+LettM%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li>
<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li>
<li>Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li>
<li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li>
<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

박테리아의 transurethral 접종하여 마우스 요도의 요로 감염의 유도는 오랜 설립하지만, 기술적으로 까다로운 절차 11. 기형 및 Hultgren 최근 마우스 요로 감염 13 transurethral 기술의 우수 리뷰를 발표했다. 본 논문에서는, 우리는 더 이상이 실험 방법의 미세한 포인트를 설명하려고합니다. 초보자는 방광을 폭로 정중선 개복술을 수행하는 인도 잉크 (PBS 1 %)의 희석 용액을 주입하고, 방광의 청색 착색에 대한 관찰하여 기술을 연습 있습니다. 우리는 방광 마우스 요도 주입하는 동안 처리하는 가장 어려운 문제 중 하나입니다 것으로 나타났습니다, 그리고 최고의 물 부족과 위에서 설명한 사전 마취 voiding 전략에 의해 예방됩니다. 우리 손에, 마우스의 &lt;10 %는 요도 주입하는 동안 소변의 오버플로우를 나타냅니다. 또 다른 잠재적인 걸림돌은 요도 천공, 방광 inocula의 부적 절한 복용, 심지어는 동...

<table><tbody><tr><td>크라이오바이알 튜브, 2.0 ml 폴리프로필렌 (캡 제외)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>크라이오바이알 튜브용 캡, &amp;rsquo;O&amp;rsquo; 링 포함</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>불렛 블렌더 (Bullet Blender)</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>지르코늄 옥사이드 비즈 (0.5mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비즈 (1.6mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 혼합 비즈 (0.9-2.0mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>CBA/J 마우스, 8-12주령 암컷</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>인산완충생리식염수 (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4.3mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.4mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>이소플루레인 (Isoflurane, Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>백금이(Inoculating loops)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>에오신-메틸렌 블루 (EMB) agar 분말</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>맥콘키 (MacConkey) agar 분말</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>LB agar 분말</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic 비방사선 투과성 폴리에틸렌 튜브, PE10 [내경 0.28 mm (0.011 inch); 외경 0.61 mm (0.024 inch)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>30게이지 바늘, 1/2 inch</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 투베르쿨린 슬립 팁 (Slip-Tip) 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 루어락 (Luer-Lock) 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 요로 감염의 transurethral 유도

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

관심 Uropathogenic 세균성 변종은 한천을 재배하고 있습니다. 일반적으로, uropathogenic<em&gt; E. 대장균</em&gt; (UPEC) 및 기타 종자는 37 Luria - Bertani (LB) 한천에서 밤새 성장 수 있습니다 ° C 주위 공기. UPEC의 계통 LB 한천에 노란 흰색 반투명​​ 식민지로 성장합니다. 적절한 콜로니 형태의 확인에 따라, 하나의 식민지는 다음 국물에 교양으로 포착하고 있습니다. LB의 국물은 대부분 uropathogenic 세균의 변종에 사용할 수 있습니다. 두 시리얼, 하룻밤 LB의 국물 문화는 유형 I 필리, uropathogenic 박테리아에 대해 잘 정의된 독성 요소의 표현을 향상시키기 위해 고용 수 있습니다. 국물 문화가 호수 (PBS)를 버퍼 인산에서 원하는 농도로 희석하고 있습니다. 에이트에 12주 오래된 여성 생쥐는 isoflurane 마취하에 위치하고 transurethrally 30 게이지 주사기를 튜브가 덮인 폴리에틸렌을 사용하여 박테리아와 주사를하고 있습니다. 경험적으로 각각의 박테리아 / 마우스 변형 조합에 대한 결정되어야합니다 일반 inocula은 10아르<sup&gt; 6</sup&gt; 10<sup&gt; 8</supPBS의 10-50 microliters에서&gt; cfu마다 마우스. 원하는 감염 기간이 지나면 (한 몇 주 일), 소변 샘플과 방광과 신장이 모두 수확하고 있습니다. 각 기관은, 다진 PBS에 배치하고, 블루 불렛 균 질기에 균질입니다. 소변과 조직 homogenates는 순차적으로 PBS에 희석하고 적절한 한천에 대한 양식입니다. 그 다음날은 콜로니 형성 단위가 계산됩니다.

이 동영상은 transurethrally 마우스 요로 감염을 유발하고 결과 감염의 범위를 정할 방법을 보여 것입니다.

마우스 요로 감염의 Transurethral 유도

연구 대상인 요로감염성 세균 균주들을 한천 배지에서 배양합니다. 일반적으로 요로감염성 대장균(UPEC) 및 기타 균주들은 ...에서 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 요도를 통해 마우스의 요로 감염을 유도하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 박테리아 균주를 배양하고, 배양액을 원하는 농도로 희석함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 관심 있는 박테리아 균주를 마우스 방광에 요도로 접종하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 소변 샘플을 수집하고 신장과 방광을 적출하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 소변 및 균질화된 신장 및 방광 샘플을 agar 플레이트에 접종하는 것입니다. 최종적으로, 플레이트 샘플 내 세균 군락의 존재 여부를 통해 요로 감염이 성공적으로 이루어졌음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 스탠퍼드 대학교 의과대학 비뇨기과에 있는 제 실험실에 오신 것을 환영합니다. 저는 Shea 실험실의 Annu입니다. 오늘은 마우스의 요도를 통한 카테터 삽입 절차를 보여드리겠습니다.저희 연구실에서는 마우스의 요로 감염 유도를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 라미나 플로우 후드 내에서 30 cm 길이의 폴리에틸렌 튜빙을 자르고, 멸균된 3 cc 주사기에 30게이지 바늘을 장착하십시오.멸균 핀셋을 사용하여 절단된 튜브의 한쪽 끝을 집어 허브에 닿을 때까지 바늘 위로 밀어 넣습니다. 튜브가 바늘 끝 너머로 약 2cm 정도 연장되도록 절단합니다. 이는 카테터 삽입 과정에서 마우스의 부상을 방지하는 데 도움이 됩니다.주사기에서 카테터를 제거하여 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 감염시킬 마우스 한 마리당 카테터 하나를 준비합니다. 자외선 조사를 통해 카테터를 최소 30분 동안 멸균합니다.카테터를 장기 보관 시 멸균 상태로 유지하기 위해 접시를 파라필름으로 밀봉합니다. 분석 대상 박테리아 균주의 냉동 보존주 접종물을 적절한 아가 플레이트에 스트리킹합니다. 여기서는 요로성 병원성 대장균(UPEC)의 접종물을 스트리킹하여 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.적절한 형태의 단일 콜로니를 선택합니다. UPEC의 경우 LB 고체 배지에서 진한 황색의 반투명한 콜로니가 나타납니다. 이를 최소 5 mL의 액체 배지에 접종하여 37 °C에서 200 rpm으로 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 첫 번째 배양액의 10%를 새로운 배지에 접종하여 다시 하룻밤 동안 배양합니다. in vivo에서 병원성과 관련된 type 1 pili 발현을 강화하기 위해, 배양액의 OD 600을 측정하여 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 결정합니다.배양액 밀리리터당 CFU의 약어입니다. 접종물이 즉시 배출되지 않도록 최종 농도가 10⁶에서 10⁸ CFU/10~50 µL 사이가 되도록 멸균된 1x PBS로 배양액을 희석하십시오. 설치 후, 마취 전 30분 동안 마우스의 식수를 제한하고, 마우스의 목덜미 가죽을 잡은 상태에서 하복부를 부드럽게 눌러 배뇨를 유도하십시오.마취된 마우스를 등 쪽이 바닥으로 가게 눕히고, 머리를 isof fluorine이 포함된 산소에 연결된 노즈콘(nose cone)에 넣습니다. 복부를 마사지하여 방광에 남아 있는 소변을 모두 배출시킵니다. 분무기를 사용하여 하복부와 회음부를 70% ethanol로 적십니다.다음으로, 멸균된 1 mL 시린지를 사용하여 박테리아 접종액을 흡입합니다. 준비된 멸균 카테터를 시린지에 고정합니다. 가위를 사용하여 튜브가 바늘 끝 너머로 1~2 mm만 연장되도록 절단합니다.이는 카테터 삽입 중 마우스가 부상을 입는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 시린지를 톡톡 두드린 후 플런저를 누르십시오. 공기 방울을 제거하려면 박테리아 정지 윤활 젤리(bacterial static lubricating jelly) 한 방울에 카테터를 담가 윤활 처리하십시오. 실체 현미경으로 테스트할 각 박테리아 균주마다 서로 다른 젤리 방울을 사용해야 합니다.비우세손의 미세 치아 핀셋을 사용하여 음핵 포피를 부드럽게 잡고 들어 올려, 우세손 쪽에 짙은 분홍색의 요도 ATU가 노출되도록 합니다. 카테터가 연결된 주사기를 잡습니다. 연필을 잡듯 잡고, 마우스 복부와 45도 각도를 이루도록 카테터 팁을 요도 ATU에 삽입합니다.정중단면 시상면에서. 클리토리스 후드를 주사기의 장축을 따라 늘려줍니다. 요도를 카테터에 효과적으로 삽입합니다.필요한 경우 카테터가 방광 내로 쉽게 미끄러져 들어가야 합니다. 카테터를 부드럽게 회전시켜 요도의 중복된 주름을 통과하도록 돕습니다. 카테터가 허브까지 완전히 삽입되면, 시린지를 생쥐의 복부와 평행하게 내립니다.포셉을 내려놓고 비우세손을 사용하여 카테터와 주사기를 고정합니다. 최소 5초에 걸쳐 접종액을 천천히 주입합니다. 주입 중 카테터 주변으로 액체가 흐르는 것이 보이면, 방광이 가득 찼거나 카테터가 질 내에 위치한 것입니다.주입을 중단하고 카테터의 위치를 확인하십시오. 필요한 경우 요도 내 카테터의 위치를 다시 조정하십시오. 주입 후, 카테터를 천천히 제거하십시오.접종 후 30분 동안 마우스가 마취 상태를 유지하도록 합니다. 수술 후 배뇨 위험을 줄이기 위해, 마우스가 깨끗한 가온 담요 위에서 회복하도록 하며, 정상적인 호흡 패턴과 활동이 돌아왔는지 지속적으로 관찰합니다. 마우스가 완전히 회복되어 기어갈 수 있게 되면, 베딩이 깔린 케이지로 옮깁니다.박테리아 균주와 마우스 계통의 조합에 따라, 완전한 감염이 일어나기까지 6시간에서 1주일 정도가 소요될 수 있습니다. 배양을 위해, 수 시간에 걸쳐 감염된 각 마우스당 멸균 페트리 접시를 얼음 위에 준비합니다. 소변을 수집하여 배양하기 위해 접시 위에서 마우스의 목덜미를 잡습니다.50 µL의 소변이면 충분합니다. 소변을 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅한 후, 캡을 닫고 얼음 위에 보관하십시오. 해부 현미경 하에서, 안락사시킨 마우스를 해부 트레이 위에 배면으로 놓습니다.복부를 70% ethanol로 분무합니다. 가위를 사용하여 피부와 그 아래의 복벽에 3~4 cm 길이의 절개를 가합니다. 필요한 경우, 핀을 사용하여 복벽을 복강 내용물로부터 견인합니다.이전의 소변 수집 시도가 실패한 경우, 30 gauge 바늘과 주사기를 사용하여 방광벽을 통해 소변을 직접 흡인합니다. 포셉과 가위를 사용하여 신장을 제거합니다. 이를 멸균 페트리 접시에 옮기고 각각의 신장을 약 2~3 mm 크기로 최소 4조각 이상 잘게 자릅니다.각 신장 조각을 0.5 mm 멸균 지르코늄 옥사이드 비드 5~6개와 멸균 PBS 400 µL가 들어 있는 cryo vial로 옮깁니다. 신장 샘플은 얼음 위에 보관하십시오. 포셉과 가위를 사용하여 방광을 제거합니다.신장과 동일한 방법으로 방광을 잘게 다집니다. 각 방광 조각을 1.6 millimeter 스테인리스강 비드와 200 microliters의 멸균 PBS가 들어 있는 크라이오 바이알로 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 바이알을 불렛 블렌더 균질기에 넣고 속도 설정 8에서 최소 1분 동안 조직을 균질화합니다.균질화 후 일부 조직 파편이 남아있는 경우가 흔합니다. 모든 샘플은 마이크로타이터 플레이트에서 동일한 시간 동안 균질화해야 합니다. 수집한 소변 및 조직 균질액을 얼음 위에서 10배 단계 희석하십시오.냉각된 PBS를 도포합니다. 희석 과정을 마칩니다. 적절한 한천 배지 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.각 플레이트의 콜로니 수로부터 장기당, 조직 mg당 또는 소변 mL당 CFU를 역산할 수 있습니다. 저희는 이러한 기술을 사용하여 박테리아 스트레스 반응의 돌연변이가 UPEC의 in vivo UTI 유발 능력 및 감염된 마우스에 투여된 항생제에 대한 내성에 어떤 영향을 미치는지 연구해 왔습니다. 이 표는 요도를 통한 접종 후 야생형 UPEC의 마우스 방광 감염 능력을 보여줍니다.마우스에서 요로 감염을 횡적으로 유도하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 마우스의 카테터 삽입을 부드럽게 진행하는 것이 중요합니다. 적절한 기술을 갖추면 카테터 삽입이 용이해지지만, 이를 위해서는 연습이 필요할 수 있습니다.여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Luyts, N. 외. 생체발광 영상을 이용한 요로 감염 및 그 치료에 대한 종단 추적 관찰. J. Vis. 경험 (2021).이 영상은 방광에 주입된 생물발광성 대장균 을 이용해 쥐 모델에서 요로 감염을 유도하고 추적하는 과정을 시연하며, 박테리아의 부착, 침입, 세포 내 복제가 이루어집니다. 생물발광 오페론에서 방출되는 빛은 감염 진행 중 박테리아 부하를 실시간으로 측정하는 지표 역할을 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 요로 감염의 시각화

출처: Conover, M. S. 외, J. 쥐 모델에서 요로감염 및 CAUTI의 확립 및 특성화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 암컷 쥐에 경요도 카테터를 조립하고 이식한 후 박테리아 접종을 통해 카테터 관련 요로 감염을 확립하고 바이오필름 매개 숙주-병원체 상호작용을 조사하는 절차를 시연합니다.

마우스 모델에서의 카테터 관련 요로 감염

출처: Conover, M. S. 외, 마우스 모델에서 요로감염 및 CAUTI의 확립 및 특성화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 β-갈락토시다아제 발현 대장균에 감염된 마우스 방광 조직에서 세포 내 박테리아 군집(IBCs)을 검출하는 과정을 보여줍니다. 조직 고정, 투과화 및 X-gal 염색 후, IBCs는 해부 현미경 아래에서 파란색 천점으로 나타나 요로 감염 시 세균 침입을 확인한다.

감염된 쥐 방광 내 세포 내 박테리아 군집 시각화

이 비디오에서는 생쥐에서 요로 감염 모델을 생성하기 위해 요로병원성 박테리아의 방광 내 투여 기술에 대해 설명합니다. 이 모델은 비뇨기계 내 요로병원성 세균 감염의 확산과 요로감염 감수성을 결정하는 메커니즘을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

요로 감염 생성 모델: 요로 감염 모델을 개발하기 위해 마우스에 요로병원성 박테리아를 투여하는 기술

이 비디오는 경요도 카테터 점안을 통해 암컷 마우스 방광에서 요병원성 대장균 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 주입된 박테리아는 방광 내에서 요로 감염을 성공적으로 확립하여 요로와 관련된 의료 관련 질병을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

경요도 카테터 삽입 및 세균 접종을 통해 수컷 마우스에서 요로 감염 모델을 생성하다

암컷 마우스의 요로 감염 모델 구축

요로 감염(UTI)을 모델링하는 능력은 박테리아 발병 기전을 이해하고 새로운 치료법의 개발을 촉발할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 이 작업의 목표는 인간에서 관찰된 결과를 요약하고 예측하는 실험적 요로감염 및 카테터 관련 요로감염의 마우스 모델을 시연하는 것입니다.

마우스 모델의 설립 및 요로 감염 및 CAUTI의 특성

쥐의 transurethral 도관 법의 설립된 모델 등 요로 감염, 방광 병 리의 연구를 허용 하지만 여성에서 수행할 수 있습니다. 여기, 남성 transurethral 주입의 새로운 모델에는 남녀 간의 강한 임상 및 역학 다름에 의해 표시 된 지역에 연구 수 있게 된다.

작은 동물 모델에서 요로 감염: 남성 및 여성 쥐의 Transurethral 도관 법

Transurethral 점 도전 절차 이며 문학에서 잘 설명 되어 있다. 이 원고의 목적은 transurethral 방광 및/또는 성인 남성 생쥐에서 전립선으로 활성 물질과 액체의 intravesical 전달 카 테 터 삽입에 대 한 기술을 설명 하는 것입니다.

성인 남성 마우스 transurethral 주입 절차

재발성 UPEC UTI를 유도하기 위해 잠복성 세포내 방광 저장소와 G. 질리스에 대한 후속 방광 노출을 확립하는 비뇨병원성 대장균(UPEC) 경요도 접종의 마우스 모델이 입증된다. 또한 박테리아의 열거, 소변 세포학 및 주사 전자 현미경을위한 현장 방광 고정 및 처리가 입증되었습니다.

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.

요로 감염의 세로 후속 및 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스에서의 치료

배우세요 마우스 요로 감염을 경요도 내 접종법으로 유도하고 세균 배양 및 조직 샘플링을 통해 감염 정도를 정량화하는 방법을. 이 기술은 UTI 연구에 재현 가능한 결과를 제공합니다.

마우스 요로 감염의 Transurethral 유도

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