기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

기계적 자극에 대한 실시간 세포 반응에 대한 연구는 24시간 동안 유리 바닥 접시에서 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포를 먼저 성장시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 A FM 팁을 비오틴화 피브로넥틴으로 코팅하는 것입니다. 그런 다음 기능화된 FM 팁을 세포 표면과 접촉시켜 A FM 팁 주위에 강력한 초점 접착을 형성할 수 있도록 하여 피브로넥틴 코팅 팁과 세포 사이의 매트릭스 인테그린 액틴 연결을 통해 act 세포골격을 직접 조작할 수 있습니다.

마지막 단계는 A FM tip의 상향 이동을 제어하여 살아있는 세포를 기계적으로 자극하여 강한 초점 접착을 깨뜨리지 않고 세포 접촉 지점에 수직력이 가해지도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 세포가 기질에 대한 부착을 강화하고 실시간 형광 광학 이미징으로 기록된 바와 같이 액틴 세포골격 재편성을 유도함으로써 기계적 자극에 반응한다는 것을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 텍사스 a 및 m 건강 과학 센터의 시스템 생물학 및 중개 의학과 조교수인 Andrea Trake입니다.

안녕하세요, 저는 Sum Lim입니다. 저는 텍사스 a and m Health Science Center의 시스템 생물학 및 중개 의학과의 박사 후 연구원입니다. 오늘은 기계적 자극에 대한 적응형 세포 리모델링을 연구하는 절차를 보여드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 살아있는 혈관 평활근 세포에서 실시간 세포골격 리모델링을 조사합니다. 이제 시작하겠습니다. 이러한 연구를 위해 CSU 22 Yokogawa 스캐닝 헤드와 결합된 전반사 형광 또는 잔디 부착물이 있는 도립 Olympus IX 81 현미경이 사용됩니다.

바이오 스코프 SZ 원자력 현미경은 도립 광학 현미경 상단에 장착됩니다. 전체 시스템은 연구 등급 광학 테이블에 장착되며 이전에 자세히 설명되었습니다. 이 통합 현미경은 두 개의 quant EM 전자 증식 전하 결합 장치 또는 E-M-C-C-D 카메라를 사용합니다.

하나는 잔디 이미징용이고 다른 하나는 컨포칼 이미징용입니다. 스피닝 디스크 스캐너 외부 필터 휠과 E-M-C-C-D 카메라로 구성된 컨포칼 어셈블리는 진동 감쇠에 필요한 실리콘 패드 위에 놓인 알루미늄 베이스 플레이트에 장착됩니다. 전체 컨포칼 어셈블리는 나사산 칼라가 있는 플랜지를 통해 현미경과 연결됩니다.

따라서 원자력 현미경 또는 FM 측정 중에 어셈블리를 현미경에서 분리하여 회전 디스크 스캐너의 진동을 피할 수 있습니다. 아르곤 크립톤 레이저는 잔디 및 컨포칼 이미징 모드 모두에 대한 여기 소스로 사용됩니다. 레이저는 두 개의 광섬유 중 하나에 결합할 수 있으며, 이는 레이저를 잔디 부착물 또는 공초점 스캐닝 헤드에 전달합니다.

둘째, 컴퓨터가 시스템을 제어합니다. 하나는 광학 이미징을 제어하는 슬라이드 북 소프트웨어와 다른 하나는 기계적 자극 실험 24시간 전에 A FM을 제어하는 나노 스코프 소프트웨어를 사용하여 유리 바닥 세포 배양 접시에 특정 단백질을 표적으로 하는 GFP 구조를 발현하는 살아있는 세포를 배치합니다. 실험 당일에는 세포 배양 배지를 페놀 레드 유리 배지로 교체하십시오.

FM 실험은 소음에 매우 민감하므로 실험 중 광학 테이블이나 현미경에 말을 걸거나 만지지 않도록 하여 소음을 최소화하십시오. FM 측정에서 회전 디스크를 현미경에서 컨포칼로 분리합니다. 실험은 자기 고리가 있는 FM 스테이지에 세포 배양 접시를 장착하여 접시를 자기 현미경 단계에 고정하는 것으로 시작됩니다.

A FM 프로브의 V자형 캔틸레버는 2미크론 비오틴화 유리 비드로 맞춤 제작됩니다. 캔틸레버는 현미경을 사용하여 쉽게 볼 수 있습니다. 비드는 캔틸레버의 맨 끝에 접착되어 있으며 여기에 코팅 용액을 적방울로 도포해야 합니다.

실험을 위해 FM 프로브를 준비하려면 먼저 팁을 유리 홀더에 장착한 다음 유리 홀더를 테이블 마운트에 놓고 팁을 코팅합니다. 팁 맨 끝에 10마이크로리터의 docos phosphate 완충 식염수 또는 DPBS를 조심스럽게 떨어뜨려 팁을 씻은 다음 김 물티슈를 사용하여 팁을 건조시킵니다. DPBS로 세척한 후 밀리리터당 1mg씩 이 절차를 5회 반복합니다.

솔루션에 열렬합니다. 팁 위로 떨어뜨립니다. 아바돈 코팅 후 5분 동안 팁을 배양합니다.

DPBS로 팁을 5번 더 씻습니다. 그런 다음 밀리리터당 1mg의 용액을 첨가하여 비오틴화된 피브로넥틴을 아바돈에 가교 결합합니다. 팁에 떨어뜨려 5분 동안 배양합니다.

마지막으로, DPBS로 팁을 다시 5번 씻어 팁의 마지막 한 방울을 남깁니다. 팁이 준비되면 FM 스캐너에 팁을 장착합니다. FM 팁을 장착한 후 홀더 주위에 보호용 실리콘 스커트를 놓습니다.

그런 다음 비디오 시청의 현미경을 설정합니다. 그런 다음 FM 팁을 시야각 중앙에 정렬합니다. 캔틸레버의 맨 끝에 레이저 빔을 배치하여 광학 레버를 설정합니다.

그런 다음 대물렌즈를 단세포 이미징을 위한 적절한 고배율 대물렌즈로 변경합니다. 그런 다음 기계적으로 자극될 세포를 시야로 가져오고 A FM 팁이 세포 표면에 닿아야 하는 위치를 선택합니다. 마지막으로 FM 팁이 해당 특정 셀에 닿을 때까지 내립니다.

팁을 셀에 접촉시킨 후 약 20분 동안 기다립니다. 이를 통해 세포 표면의 FM 접촉 지점에서 강력한 초점 접착력이 형성될 수 있습니다. 대기 시간이 지나면 기계적 자극 절차는 기계적 자극 실험을 준비하기 시작할 수 있습니다.

비디오 카메라에서 E-M-C-C-D 카메라로 전환하여 이미징을 위해 형광 세포를 볼 수 있습니다. 그런 다음 정지 중인 세포의 초기 이미지를 획득합니다. 스피닝 디스크와 음성 현미경을 사용하여 세포체 전체의 세포골격 행위를 시각화합니다.

반대로, 잔디를 사용하여 세포를 자극하기 위한 국소 접착을 시각화합니다. 캔틸레버를 사용하여 3-5분마다 개별 단계로 제어된 상향 움직임을 적용합니다. A FM 데이터를 획득하는 동안 작업자가 Z piso 위치의 전압을 지속적으로 모니터링하여 수직 극에 대한 적절한 타이밍을 결정하는 것이 중요합니다.

FM 데이터 수집과 동시에 슬라이드 북 소프트웨어를 사용하여 각 수직 당김 후 세포의 공초점 또는 잔디 이미지를 기록합니다. 마지막으로 자극 실험이 완료되면 세포에서 FM 팁을 빼냅니다. 혈관 평활근 세포는 actin, MRFP 및 vcul과 transfection합니다.

GFP는 정점 세포 표면에서 FM을 사용하여 이미지화했습니다. 동일한 세포를 기저 세포 표면의 잔디를 사용하여 이미지화했습니다. 여기서 두 이미지는 겹쳐져 있습니다.

동일한 세포의 이미지도 세포체 전체에 걸쳐 회전 디스크 컨포칼을 사용하여 획득되었으며 3D 스택의 최대 투영으로 표시됩니다. A FM과 회전 디스크 컨포칼 이미지 사이의 좋은 겹침이 표시됩니다. 액틴 MRFP로 형질주입된 그녀의 혈관 평활근 세포는 A FM에 의해 기계적으로 자극되고 회전 디스크 컨포칼 현미경으로 이미지화되었습니다.

오류는 FM 자극에 대한 현저한 재구조를 보여주는 작용 섬유를 나타냅니다. 일부 작용 섬유는 중합하는 반면 다른 작용 섬유는 기계적 자극으로 인해 해중합되고 다른 작용 섬유는 함께 뭉칩니다. 행위 재구성으로 인해 EFM을 사용하여 생명 판매 문화를 기계적으로 자극하는 동시에 광학 이미징 방법을 사용하여 CY 재배열을 기록하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 FM 실험은 매우 시끄럽고 민감하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해주셔서 감사드리며, 여러분의 발언에 행운을 빕니다.