Name: 기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 기계 자극에 대한 라이브 세포 반응을 원자 힘 현미경과 광학 현미경을 통합하여 연구하는 방법입니다. GFP 융합 단백질을 발현하는 세포를 사용하여 실시간으로 세포골격 재구성을 관찰할 수 있습니다.

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플라스미드 Vinculin - GFP는 마이클 데이비슨, 플로리다 주립 대학, 탤러해시, 플로리다의 선물 케네스 야마다, 플라스미드 국립 보건 연구소, 치과와 Craniofacial 연구의 국립 연구소, 베데스다, 메릴랜드, 그리고 굴지 - mRFP에서 선물했다. 이 작품은 NSF 경력 보너스 # 0747334 및 AHA - 국립 SDG # 0835205N Andreea Trache에 의해 지원되었다.

1. 통합 현미경 시스템의 개요 이러한 연구에 사용되는 현미경 시스템은 상세 1에서 설명되었습니다. 간단히, TIRF 첨부 (올림푸스, 센터 밸리, PA)와 거꾸로 올림푸스 IX - 81 현미경과 결합 CSU - 22 요코 스캔 헤드 (요코 전기 병원, 일본). Bioscope SZ 원자 힘 현미경 (Veeco 인스 트루먼 트의 병원, 산타 바바라, CA)는 광학 거꾸로 현미경 위에 탑재하고, 전체 시스템은 연구 등급 광학 테이블의 상단 (뉴 포트, 어빈, CA)에 위치합니다. 회전 디스크 스캐너, 외부 필터 휠과 EMCCD 카메라 (로퍼 과학 - Photometrics, 투싼,​​ AZ)에서 구성된 공촛점 어셈블리가 rigidly 진동 감쇠에 필요한 실리콘 패드에 위치 알루미늄베이스 플레이트와 연결됩니다. 공촛점 스캐너 AFM 측정하는 동안 현미경에서 decoupled 수 treaded 칼라와 플랜지를 통해 현미경으로 연결하는 회전 디스크 스캐너로부터 진동 AFM 측정에 영향을 미치지 않습니다 그러한. 아르곤 - 크립톤 레이저 (스펙트럼 물리학, Mountain View, CA)를 각각 TIRF 및 공촛점 이미징 모드 모두 여기 소스로 사용하고 TIRF 첨부 파일 또는 스캔 머리에 레이저를 전달이 광학 섬유에 또는 결합 수 있습니다 . 두 컴퓨터가 시스템을 제어 : Slidebook 소프트웨어는 광학 이미징을 제어하고 Nanoscope 소프트웨어는 AFM을 제어합니다. 2. 세포 배양 라이브 세포가 특정 단백질에 대한 타겟으로 GFP를 구성 표현은 24 시간 전에 기계적 자극 실험에 유리 바닥 세포 배양 접시에 배치해야합니다. 실험 당일 페놀 레드 무료 매체와 세포 배양 매체를 교체하십시오. 세포 배양 접시는 자기 칼라와 AFM 무대에 장착할 수 있습니다. 3. AFM 팁 준비 및 현미경 설정 2 마이크론과 함께 사용자 정의 AFM 팁 유리 구슬이 DPBS있는 5 번 세탁 후 아비딘 (1 MG / ML)로 5 분 incubated, DPBS 다섯번로 다시 씻어, 다음 1 MG / ML biotinilated 5 분 incubated 것입니다 biotinilated fibronectin. 팁은 끝 2에서 다섯 번 이상 씻어 AFM 스캐너에 탑재하고 보호 실리콘 스커트는 보유자 주위에 배치됩니다 것입니다. 보기의 필드의 중앙에 AFM 팁 정렬에 비디오를 볼 수 있도록 현미경을 설정합니다. 캔틸레버의 가장 끝에있는 레이저 광선을 배치하여 광학 레버를 정렬하고 단일 세포 이미징에 대한 적절한 높은 배율 목표로 목적을 변경합니다. 팁의 상수 봄 실험을 시작하기 전에 결정되어야한다. 이 매개 변수는 Nanoscope 소프트웨어에서 사용 가능한 열 조정 방법을 사용하여 측정됩니다. 개화 이미징 수 있도록 EMCCD 카메라로 비디오 카메라에서 전환합니다. 그런 다음, 셀을 선택하고 특정 세포와 접촉 AFM 팁 가져. 세포 표면과 접촉의 AFM 지점에 양식에 강한 초점 접착에 필요한 20 분 대기 시간 후, 기계적 자극 절차가 시작됩니다. 4. 라이브 세포의 기계 자극 3-4 TIRF 영상은 초점 adhesions를 시각화하고 quantifying을위한 최고의 방법되며, 방적 디스크 공촛점 이미징 5 세포 체내 굴지의 cytoskeleton을 시각화에 사용됩니다. AFM 6 유체 아래의 연락처 모드 이미징에 사용됩니다. 세포의 TIRF 또는 공촛점 이미지가 기계적 자극 절차를 시작하기 전에 취득됩니다. 기계적 자극이 일정 기간 (1-1.5 시간) 동안 매 3-5 분 이산 단계로 상향 이동됩니다 기능화 AFM 프로브에 의해 유발됩니다. 세포 반응 - 반응은 높이 이미지, 1 초 단위 시간을 나타내는 이미지의 각 라인의 시리즈로 Nanoscope 소프트웨어에 지속적으로 기록됩니다. AFM 데이터를 수집하는 동안 작업자는 항상 AFM 팁의 Z 위치는 다음 당기에 대한 적절한 타이밍을 결정하기 위해 모니터링합니다. 각각의 기계적 자극 후 지속 AFM 데이터를 획득하면서 Slidebook 소프트웨어의 세포의 TIRF 또는 공촛점 이미지를 얻을 수 있습니다. 광학 이미지는 굴지의 cytoskeleton과 초점 adhesions의 개편을 보여 영화를 만들 오프라인 처리할 수 있습니다. 또한, 각 이미지는 셀 영역, 특정 단백질 영역을 결정하고, 일반적인 세​​포 형태를 분석하기 위해 양적 처리할 수 있습니다. AFM 팁은 세포와 AFM 팁 감도에서 철회되는 실험의 끝에 Nanoscope 소프트웨어에서 측정됩니다. 실험은 매우 소음 민감합니다! 전 동안 감동 아무 말도 또는 현미경periment은 피해야한다. AFM 측정에서 소음을 최소화하기 위해, 회전 디스크 공촛점는 현미경에서 드 결합해야합니다. 세포 표면과 AFM 팁 사이에 강한 초점 접착력을 형성하는 대기 시간은 사용되는 세포 유형과 끝에 매트릭스 코팅에 따라 달라질 수 있습니다. 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 굴지 - mRFP 및 vinculin - GFP와 transfected 같은 혈관 평활근 세포 (VSMC)가로 몇 군데되었습니다 혀끝의 세포 표면에 (A) AFM, (B) 기저 세포 표면에 TIRF하며, (C) 스피닝 디스크 공촛점 현미경 세포 체내. 공촛점 이미지가 3 차원 스택의 최대 투사로 표시됩니다. AFM과 TIRF 또는 방적 디스크 공촛점 이미지 사이 좋은 중복은 (D)와 (E), 각각에 표시됩니다. 이미지 크기는 64 X 50 미크론이다. <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 굴지 - mRFP와 transfected VSMC는 기계 AFM에 의해 자극과 회전 디스크 공촛점 현미경으로 몇 군데했다 화살표 그 굴지의 섬유를 나타냅니다. (A) 진하게 / 중합, (B) depolymerize / 사라, 또는 (c) 때문에 함께 번들 굴지의 구조 조정합니다. 화이트 점선 라인은 세포 위에 AFM 팁을 나타냅니다. 이미지 크기 91 X 91 미크론.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Cytoskeleton 70-10과 초점 adhesions가 11-16, 조립 분산 및 세포가 마이 그 레이션 또는 기계적 강제로 17 답변으로 넘겨 역동적인 구조입니다. 그들은 세포 성장, 생존, 그리고 유전자 발현을 조절에 중요​​한 기능을합니다. 그들의 구체적인 유통 및 역학을 아는 것은 세포가 모체와 자신 사이의 의사 소통 방법에 대한 이해를 제공합니다. 이 새로운 현미경 시스템은 자기편 살 세포의 분자 역동적인 연구 광범 광범위하게 적용됩니다. 통합 현미경은 빠른 하위 세포 변화의 양적 모니터링을 가능하게하고 기계적인 강제에 대한 응답으로 세포 리모델링의 기본 과정을 이해하기위한 중요한 새로운 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>AFM 팁</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>2 micron 보로실리케이트 비드, 0.01N/m, 비오틴 표면</td></tr><tr><td>avidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>DPBS 내 1mg/mL</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>평활근 세포용 Amaxa transfection kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Mattek 유리 바닥 디쉬</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>유리 바닥 커버슬립 no. 1.5가 포함된 멸균 60mm Falcon 디쉬</td></tr></tbody></table>

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

살아있는 세포가 기계적 힘을 감지하는 메커니즘을 이해하기 위해서는, 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 하위 세포 수준에서 세포의 행동을 조사할 수있는 그들이 반응하고 환경에 적응하는 방법, 새로운 기술하는 것은 개발되었습니다. 따라서, 원자 힘 현미경 (AFM)은 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 고속 회전하는 디스크 (FSD) 공촛점 현미경과 통합되었습니다. 통합 시스템은 실시간으로 기계 자극에 세포 반응의 직접적인 광학 이미징을 허용, 모든 자기편 라이브 세포에서 분자 역동적인 연구 광범 광범위하게 적용됩니다. 굴지의 필라멘트와 초점 adhesions의 중요한 다시 정리하기는 인해 세포 체내 세포 구조로 변화를 유도하는 혀끝의 세포 표면에서 로컬 기계 자극을 표시했다. 이러한 혁신 기술은 기계적 강제에 대한 응답으로 사는 셀 구조 조정과 역학을 이해하는 새로운 정보를 제공합니다. 상세한 프로토콜과 대리인 데이터는 기계적 자극에 표시 라이브 셀 응답이 제공되는 설정합니다.

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

살아있는 세포가 기계적 힘을 감지하는 메커니즘과 이에 반응하여 환경에 적응하는 방식을 이해하기 위해, ...할 수 있는 새로운 기술이

기계적 자극에 대한 세포의 실시간 반응 연구는 우선 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포를 유리 바닥 배양 접시에서 24시간 동안 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 AFM 팁을 비오틴화된 피브로넥틴으로 코팅하는 것입니다. 그런 다음, 기능화된 AFM 팁을 세포 표면에 접촉시켜 AFM 팁 주변에 강력한 국소 접착이 형성되도록 하며, 이를 통해 피브로넥틴이 코팅된 팁과 세포 사이의 매트릭스-인테그린-액틴 연결을 통해 액틴 세포골격을 직접 조작할 수 있게 합니다.마지막 단계는 AFM 팁을 제어된 상향 이동시켜 살아있는 세포를 기계적으로 자극함으로써, 강한 초점 접착(focal adhesion)을 파괴하지 않고 세포 접촉 지점에 수직력을 가하는 것입니다. 결과적으로, 실시간 형광 광학 이미징으로 기록된 바와 같이, 세포는 기질에 대한 부착을 강화하고 액틴 세포골격 재구성을 유도함으로써 기계적 자극에 반응하는 것으로 나타났습니다. 안녕하세요, 저는 Texas A&amp;M Health Science Center 시스템 생물학 및 중개 의학과의 조교수 Andrea Trake입니다.안녕하세요, 저는 Texas A&amp;M Health Science Center 시스템 생물학 및 중개 의학과의 박사후 연구원 Sum Lim입니다. 오늘은 기계적 자극에 따른 세포의 적응적 리모델링을 연구하는 절차를 보여드리겠습니다.본 연구실에서는 살아있는 혈관 평활근 세포의 실시간 세포골격 재구성(cytoskeletal remodeling)을 조사하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이러한 연구를 위해 CSU 22 Yokogawa 스캐닝 헤드가 결합된 전반사 형광(total internal reflection fluorescence, TIRF) 장치가 장착된 Olympus IX 81 도립 현미경이 사용됩니다.Bio scope SZ 원자간력 현미경이 도립 광학 현미경 상단에 장착되어 있습니다. 전체 시스템은 연구용 광학 테이블 위에 설치되었으며, 이에 대한 상세한 내용은 이전에 설명된 바 있습니다. 이 통합 현미경은 두 대의 quant EM 전자 증배 전하 결합 소자 또는 E-M-C-C-D 카메라를 사용합니다.하나는 터프 이미징(turf imaging)용이고, 다른 하나는 공초점 이미징(confocal imaging)용입니다. 스피닝 디스크 스캐너, 외부 필터 휠, 그리고 E-M-C-C-D 카메라로 구성된 공초점 어셈블리는 진동 감쇠에

live-cell-response-to-mechanical-stimulation-studied-integrated

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

여기는 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 평가 하기 위한 방법에 설명 합니다. 현미경 기반 분석 결과에서 우리 전단 흐름 간략 한 자극에 따라 붙일 표시 된 바이오 센서의 지역화를 검사 합니다. 우리는 또한 화학적 심각한 기계적인 자극에 응답에 대 한 관심의 다양 한 단백질의 활성화를 테스트합니다.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

이 글은 브릴루앵 미세 분광법을 이용한 3D 매트릭스 내 살아있는 구형체의 기계적 특성 규격 프로토콜을 설명합니다. 이 전광학 방법은 미시적 해상도와 정량적 기계적 특성을 가진 구형 시각화를 가능하게 합니다. 이 접근법은 기계적 표현형 분석에 영향을 미칩니다; 예를 들어, 3D 미세환경 내에서 종양 구상체의 병리학적 상태를 결정하는 일이 있습니다.

브릴루앵 분광법을 이용한 구체의 기계적 매핑

배우세요 기계 자극에 대한 라이브 세포 반응을 원자 힘 현미경과 광학 현미경을 통합하여 연구하는 방법입니다. GFP 융합 단백질을 발현하는 세포를 사용하여 실시간으로 세포골격 재구성을 관찰할 수 있습니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

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