마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

본 실험 절차의 전반적인 목적은 약물, 바이러스 벡터 또는 세포 이식을 위해 뇌 심부 구조에 매우 정밀한 미세 주입을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 루멘 크기가 50 µm인 유리 모세관 바늘을 제작합니다. 절차의 두 번째 단계는 모세관 현상을 통해 바늘의 50%를 미네랄 오일로 채우고, 튜브의 가장 넓은 끝단으로 플런저를 삽입하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 주입하려는 물질이나 세포 현탁액을 바늘에 채우는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 바늘 끝을 삽입하여 뇌 심부 구조에 매우 낮은 유속으로 물질을 주입하는 것입니다. 궁극적으로, 유리 모세관을 이용한 미세 주입을 통해 뇌의 매우 정밀한 표적에 물질을 주입한 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 멕시코 콜리마 대학교 심리학과 신경과학 연구소의 Oscar Gonzalez입니다. 오늘은 유리 모세관을 사용하여 마우스 뇌에 약물을 전달하는 미세주입 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 성체 신경줄기세포를 연구하기 위해 연구실에서 이 절차를 사용하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 루멘 크기가 50 µm인 유리 모세관 바늘을 사용하여 뇌에 미세 주입을 수행하면 뇌 손상을 현저히 줄이고, 약물의 수동 확산을 최소화하며, 설치류 뇌의 정밀한 타겟팅이 가능합니다. 미세 주입을 수행하기 전, 먼저 유리 바늘을 제작해야 합니다.

먼저 마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)의 고저항 전극에 모세관 유리관을 배치합니다. 다음으로 마이크로 피펫 풀러의 전극을 켭니다. 유리관의 중간 부분을 가열하여 국소적으로 연화시키기 위해, 유리관을 길이 방향으로 3~5 mm 정도 초기 거리만큼 늘려 해당 국소 부위의 유리관 직경이 감소하도록 합니다.

유리관이 부러질 때까지 계속해서 늘려줍니다. 이 단계들을 반복하여 동일한 단일 배럴 바늘 두 개를 제작합니다. 이제 유리 바늘을 마이크로 포지(micro forge)에 넣습니다.

팁을 비스듬하게 깎으려면 30도 각도면 충분합니다. 마지막으로, 바늘들을 현미경 아래에 두고 두 바늘 모두 내경이 정확한지 확인하십시오. 대부분의 친수성 약물의 경우, 제작된 바늘의 내경이 30 to 50 micrometer일 때 이상적입니다.

미세 주입에 이를 어떻게 사용하는지 살펴보겠습니다. 우선, 제작된 바늘의 가장 넓은 끝부분부터 미네랄 오일을 채웁니다. 미네랄 오일이 모세관 현상에 의해 모세관 튜브 길이의 약 50%까지 도달하도록 둡니다.

니들의 가장 넓은 끝부분에 고진공 그리스를 바르고 플런저를 삽입합니다. 유리 니들의 팁 끝으로 미네랄 오일이 한 방울 조금 나올 때까지 조심스럽게 밀어냅니다. 이제 마이크로 인젝터의 홀더에 니들을 고정하고 주사를 위해 동물을 준비합니다.

먼저, 동물의 체온을 유지하기 위해 정위 고정 동물 홀더에 가열 패드를 배치합니다. 37 °C에서 마취된 마우스의 머리 털을 깎은 후, 정위 고정 장치에 배치하고 고정합니다. 이어바와 치아 홀더를 사용하여 고정한 상태에서, 수술용 칼로 양쪽 귀에서 람다(Lambda) 두개골 선까지 피부를 절개합니다.

면봉으로 두개골을 닦아 건조시키고 수술 부위에서 피부를 젖혀 밖으로 뺍니다. 다음으로, 유리 바늘의 끝을 bgma suture의 정점에 맞추고 그 지점을 초기 주입 위치로 설정합니다. 이제 정위 고정 장치의 x축과 Y축을 두개골 위로 이동시켜 천공할 두개골 지점을 설정합니다.

연구용 마이크로 드릴을 사용하여 미세 핀셋으로 선택한 좌표에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 뼈의 가장 깊은 층을 조심스럽게 제거하고 경막(dura mater)을 파쇄합니다. 그러면 뇌척수액이 일부 누출되는 것을 볼 수 있습니다.

바늘이 드릴로 뚫은 구멍을 통과할 수 있는지 확인하기 위해, 정위 고정 장치의 Z축을 사용하여 유리 바늘을 천천히 내립니다. 이제 주입할 약물 1 µL를 피펫으로 취해 작은 파라필름 조각 위에 올립니다. 이 파라필름을 두개골 위에 배치합니다.

마이크로 인젝터 휠을 돌려 약물을 흡입하면서, 현미경을 통해 액체가 유리 니들 안으로 올라가는지 확인하십시오. 파라필름을 제거하고 제로 좌표를 재설정합니다. 이제 니들을 선택한 좌표로 이동시키고, 유리 니들의 끝이 뇌 표면에 살짝 닿을 때까지 홀더를 내린 후 Z.Coordinate를 0으로 설정하십시오.

원하는 깊이까지 유리 바늘을 뇌 실질에 삽입합니다. 약물을 초당 약 1 nL의 속도로 천천히 주입합니다. 원하는 부피만큼 주입이 완료되면, 약물이 실질 내로 확산될 수 있도록 2분 동안 대기한 후 바늘을 부드럽고 천천히 제거합니다.

마지막으로 수술 부위를 접착제로 봉합하고 동물을 정위 고정 장치에서 분리합니다. 마취 회복을 위해 동물을 미리 데워둔 케이지에 넣습니다. 이제 미세주입 결과를 보여드리겠습니다.

유리 바늘에 의한 뇌 손상을 최소화하기 위해, 백질 경로의 탈수초화를 유도하는 Lysophosphatidylcholine 또는 lyin을 뇌량(corpus callosum)에 주입하였습니다. lyin은 20 liters만 주입되었습니다. 탈수초화는 백질 경로에서 myelin basic protein 발현의 소실로 나타나며, 매우 정밀한 주입이 이루어졌으며 매우 가는 바늘 경로를 통해 뇌 손상을 최소화하였습니다.

지금까지 뇌 심부 구조에 미세 주입을 수행하기 위한 유리 바늘 제작 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 수술실에서 바로 사용할 수 있도록 모든 장비와 재료를 미리 준비하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.