Name: RhoC GTPase 활성화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 세포 내 RhoC GTPase 활성 수준을 측정하는 pull down 분석법을 활용한 세포생물학 연구 방법입니다. 이 기술은 GTPase 활성 정량화 및 세포 신호 전달 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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국방학과 W81XWH - 05 - 1-0005, W81XWH - 06 - 1-0495, W81XWH - 08 - 1-0029 및 W81XWH - 08 - 1-0356

1. 준비 GST - 융합 단백질 <ol><li> BamH1/EcoR1 pGEX3x 벡터로 subcloned rhotekin Rho 구속력을 도메인 (RBD)의 첫 번째 N - 터미널 90 아미노산을 포함하는 JM109 관할 세균의 글리세롤 주식이 만들어집니다. 고효율을 보장하기 위해 다음 단계는 각 실험에 대해 수행되어야합니다. 우리의 경험에서 갓 GST - RBD는 강력하고 정확한 GTPase 활성화 분석의 열쇠입니다 준비. </li><li> LB의 A 50 ML에 글리세롤 주식의 (대략, 해동하지 않음) 50 μL 추가 잡고 37 ° C 하룻밤 성장. </li><li> 500 ML LB - A에 1시 10분을 희석 1 H.위한 성장 </li><li> 2 시간에 대한 IPTG 0.1 밀리미터와 GST 단백질 생산을 유도. </li><li> 5000에서 원심 분리기 병 및 원심 분리기, Sorval GSA3 로터에 균일하게 배포 RPM 4 ° C 20 분. </li><li> 원심 분리기 병에 Resuspend 펠렛, 용해 완충액 10 ML *. * 박테리아 용해 완충액 : 20 % 자당, 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 산도 8.0, 0.2 MM 2 S 2 O 5, 2 MM MgCl 2, 2 MM의 DTT 나는 신선한 PMSF, benzamide, aprotinin과 류펩틴을 추가합니다. </li><li> 2-3 분 (이 sonicator의 종류에 따라 다릅니다. 우리는 마르크 6 세트 피셔 소닉 Dismembranator 모델 500, 50 %의 사이클을 사용) Sonicate. </li><li> 4 원심 분리기, Sorvall SS34, 20 분 10,000 RPM ° C. 이 시점에서 작은 나누어지는는 제거 할 수 있습니다 SDS - PAGE에 의해 실행합니다. 겔은 쿠매시 자국이있을 수 있으며, 밴드 46 KDA에서 명확해야합니다. </li><li> 뜨는 제거 50 % glutatione - 세파 로스 4B 슬러리 1 ML를 추가합니다. </li><li> 4 30 분 품어 ° C를 회전. 용해 완충액 3 번 씻으십시오. </li><li> GST - 생선 버퍼와 50 %의 슬러리 (약 1 ML)로 GST-RBD/glutatione-Sepharose 비즈를 Resuspend **. ** GST - 피시 버퍼 : 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 산도 7.4, 100 MM NaCl는, 1 % NP - 4, 2 MM MgCl 2, 신선한 PMSF, benzamide, aprotinin과 류펩틴 추가 </li></ol> 2. GST - 융합은 분석을 내리다 <ol><li> 50-10 X 10 6 세포 / 분석을 사용 </li><li> 일단 얼음 차가운 PBS에서 얼음에 접시를 유지 (우리가 얼음 가득한 평면 유리 접시를 사용)와 0.5 ML GST - 물고기 버퍼 lyse 세포를 씻으십시오. </li><li> 얼음에 5 분 품어, 고무 경찰이나 평면 scrapper를 사용하여 수확 세포는 튜브를 microfuge 4에서 20,000 RPM 5 분 원심 분리기로 전송 ° C. </li><li> 신선한 microfuge 튜브에 뜨는 전송합니다. 총 Rho (예 : GDP + GTP 바운드) 결정 50 μL를 가져가라. </li><li> 0.5 ML의 GST-RBD/glutatione-Sepharose 비즈를 추가하고 4 회전 하룻밤 ° C, 알을 품다. </li><li> GST - 생선 버퍼와 배의 씻으십시오. </li><li> 40 μL 2X - Laemelli 샘플 버퍼에 Resuspend 비즈 이 시점에서 2.4 촬영한 총 Rho 단백질 나누어지는의 농도는 결정 30 μg는 해당 인증 샘플로 젤에서 실행할 수 있도록 준비한다. </li><li> 종기 샘플은 90 ° C에서 5 분, 짧게 원심 분리기 및 뜨는 (예 : 구슬을 피하) 부하를 가지고 12 잘 40~20% 기울기 SDS - PAGE 젤에서 실행됩니다. </li><li> 100 W.의 Towbin 버퍼와 상수가 현재 사용하는 멤브레인로 전송, 아니 높은 150 볼트에서 젤을 실행 </li><li> RhoC - specfic 항체와 함께 5 % 우유 / TBST 솔루션과 프로브와 멤브레인를 차단합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 좋은 결과는 약 22 KDA에서 단일 밴드를 생산한다. 나쁜 결과는 여러 개의 밴드 혹은 높은 배경을 생산하고 있습니다. 이것은 단백질 저하, 샘플 불완전 세척 또는 오래된 GST - RBD의 사용을 나타내는 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. RhoC GTPase의 다른 레벨을 표현하는 세 가지 세포 라인은 활성 및 총 RhoC 활성 및 총 RhoC 높은 수준의 여부 RhoC의 낮은 수준을 보여주는 표시됩니다. 얼룩 그런 다음 옷을 벗긴 채 총 RhoC 단백질에 대한로드 컨트롤 역할을하는 집 지키는 유전자 굴지으로 항체와 reprobed했다. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 여러 밴드 또는 단백질 저하, 샘플의 불완전한 세척 또는 오래된 GST - RBD의 사용으로 높은 배경 결과입니다.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

절차의 가장 중요한 단계는 신선한 GST - RBD의 생성이다. 이 단계에주의하지 않으면 실패에 대한 주요 이유입니다. GST - RBD (1.2)의 세대에서 세포 lysate (2.5)와 함께 밤새 배양하기위한 모든 단계는, 하루에 수행되어야합니다. 또 다른 중요한 단계는 세포 lysates을 생산하기에 충분한 세포가있다는 것을 확실하게하는 것입니다. 세포의 낮은 수준에 존재하는 경향이 RhoC GTPase에서 볼 때 이것은 특히 중요하다.

<table><tbody><tr><td>Gluthione-sepharose 4B 비드</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Criterion 4-20% Tris-HCl 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpase 활성화 분석

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase RhoA GTPase가에 91%의 상동 있습니다. 때문에 세포에 그 유행의 RhoA GTPase 많은 시약 및 기술이 개발되었습니다. 그러나, RhoC GTPase는 상대적으로 낮은 수준에서 전이성 암세포에 표시됩니다. 따라서, 몇 가지 RhoC 특정 시약이 개발되었습니다. 우리는 RhoC GTPase를 감지 Rho 활성화 분석을 적응있다. 이 기술은 활성 RhoC의 GTPase를 빼내 GST - Rho 바인딩 도메인 융합 단백질을 활용합니다. 또한, 우리는 전체의 수준 (GTP와 GDP 바운드) RhoC의 GTPase을 결정하기 위해 분석의 시작 부분에서 총 단백질을 수확 수 있습니다. 이것은 세포에 적극적으로 대 총 RhoC GTPase의 결정을 허용합니다. 이 절차의 여러 상업적인 버전은 그러나 개발되었습니다, 상업 키트 RhoA GTPase에 최적화되어 있으며, 일반적으로 RhoC GTPase를 위해 잘 작동하지 않습니다. 분석의 부품은 RhoC 특정 항체의 개발뿐만 아니라 수정되었습니다.

이 프로토콜은 세포 내에서 활성 RhoC GTPase의 수준을 결정하기 위해 분석 아래로 끌어을 활용합니다.

RhoC GTPase 활성화 분석

RhoC GTPase는 RhoA GTPase와 91%의 상동성을 보입니다. RhoA GTPase가 세포 내에 널리 분포하기 때문에, 이를 위한 많은 시약과 기술들이 개발되어 왔습니다. ...

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기에 제시된 방법은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력을 가진 돌연변이 RhoA GST 융합 단백질을 사용함으로써 교양 세포에서 RhoA 특정 GDP / GTP 교환 요인 (GEFs)의 활성화를 따르도록하는 분석에 대해 설명합니다. GEFs는 서양 모래 바닥과 densitometry에 의해 계량에 의해 감지 세포 lysates에서 시켰던됩니다.

상피 세포 Lysates에서 GST-태그가 돌연변 Rho 단백질을 (GST-RhoA (G17A))를 사용하여 활성 Rho-GEFs의 친화력 강수량

이 동영상은 GTPase 결합 단백질 파트너를 연구하기 위한 경쟁 분석을 보여줍니다. 마그네틱 비드에 고정된 뉴클레오티드 결합 GTPase 단백질을 활용하여 GTPase의 동일한 결합 부위에 대한 두 개의 상호 작용 단백질 파트너 간의 경쟁적 결합을 연구하여 단백질 파트너의 결합 친화성을 평가할 수 있습니다.

경쟁 GTPase 결합 단백질 파트너를 연구하기 위한 경쟁 결합 분석

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

이 프로토콜은 Rac1을 포함한 Rho-family GTPase에 대한 결합 파트너의 상대적 친화도를 비교합니다. 생체 내에서 Rac1 결합 단백질은 단일 결합 계면을 놓고 경쟁하며, 그 형태는 결합된 뉴클레오티드에 의해 결정됩니다. 뉴클레오티드는 중요하면서도 높은 가수분해 속도로 인해 실험적으로 제어하기 어렵습니다.

경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

Guanosine triphosphate (GTP) 결합은 G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) 활성화에서 가장 초기의 사건 중 하나이다. 이 프로토콜은 방사성 표지 된 GTP 유사체 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 결합을 모니터링함으로써 특정 GPCR- 리간드 상호 작용을 약리학 적으로 특성화하는 방법을 설명합니다. 관심있는 리간드에 대한 반응.

무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

여기 prenylation과 guanosine-5'-3 인산 염 (GTP)를 조사 하는 프로토콜 설명-Rho GTPase의 로드. 이 프로토콜 두 가지 상세 방법의 구성, 즉 막 분류 및 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과. Prenylation와 GTP를 측정 하기 위한 프로토콜을 사용할 수 있습니다 다른 작은 GTPases 다른 로드.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

이 보고서는 시각적 GPCR, 로도프신 및 mini-Go와그 복합체를 준비하기위한 다른 세제의 선별을 설명합니다. 정제 동안 다른 단계에서 복합체의 품질을 특성화하는 생화학적 방법이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 그들의 미래 구조 연구를 위해 다른 막 단백질 복합체로 일반화될 수 있다.

성공적인 결정화를 위한 시각적 GPCR-mini-G 단백질 신호 복합체의 전략적 스크리닝 및 특성화

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

당사는 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 모니터링하기 위해 split-luciferase reassembly assay를 확립했습니다. 이 분석을 사용하여 화학적 처리 조건에서 HEK293T 세포에서 이러한 세포 간 결합의 수준을 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다.

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

이 연구는 섬모 형성의 세포 모델에서 SHH 작용제를 사용하여 1차 섬모 매개 음파 고슴도치(SHH) 신호 경로 활성화에 대한 정량적 PCR 기반 분석을 보여줍니다.

섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 분석

배우세요 세포 내 RhoC GTPase 활성 수준을 측정하는 pull down 분석법을 활용한 세포생물학 연구 방법입니다. 이 기술은 GTPase 활성 정량화 및 세포 신호 전달 메커니즘 이해에 필수적입니다.

RhoC GTPase 활성화 분석

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