Tol2 Transposon-Mediated Zebrafish Transgenesis: 수정된 제브라피시 배아에 Tol2 시스템을 동시 주입한 후 형질전환 제브라피시를 생성하는 절차

미세사출 금형의 웰에 생존 가능한 단세포 단계 제브라피시 배아를 배치하는 것으로 시작합니다.

Tol2 transposase-encoding mRNA와 transposon donor plasmids를 포함하는 용액을 microinjection 바늘에 로드합니다. 플라스미드는 유비쿼터스 제브라피시 프로모터와 Tol2 트랜스포손 팔 옆에 있는 형광 단백질 인코딩 유전자로 구성됩니다.

미세 주입 용액을 제브라피쉬 배아의 세포질에 조심스럽게 주입합니다. 세포 내에서 Tol2 transposase mRNA는 Tol2 transposase 단백질로 번역되어 핵으로 활발하게 운반됩니다.

donor plasmid의 Tol2 부위는 리포터 유전자 옆에 있는 특정 inverted terminal repeats(ITR)로 구성됩니다. ITR은 짧고 직접적인 반복으로 측면에 있습니다. 트랜스포사제 단백질은 ITR 부위를 인식하고 결합하여 측면 DNA에 헤어핀을 형성합니다. 전이효소(transposase)는 측면 DNA로부터 전이효소 구조를 더 절단하여 플라스미드에서 방출하고 짧고 직접적인 반복을 남깁니다.

트랜스포사제(Transposase)는 체세포 게놈에서 엇갈린 이중 가닥 절단을 생성하고 트랜스포존 구조체를 게놈 부위에 삽입합니다. DNA 중합효소에 의한 엇갈린 말단의 갭 메우기에 이어 흠집의 결찰은 짧고 직접적인 반복을 만듭니다.

결찰은 체세포 게놈으로의 안정적인 전이(transposon) 구조 통합을 유발하고, 프로모터는 형광 단백질 발현을 촉진합니다. 주입된 배아를 배양합니다. 배아 발달 과정에서 체세포는 다양한 세포 유형을 생성하고 형질전환 제브라피시를 생성합니다.