더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션

안녕하세요, 저는 로체스터 대학교(University of Rochester) AL 도움 실험실의 박사후 연구원 JA입니다. 이번 영상에서는 단일 세포 해상도로 두 가지 mRNA 전사체를 동시에 검출하기 위해, 신선 동결 뇌 절편에서 수행하는 Process Institute 하이브리드 소화를 보여드리겠습니다. 이 방법은 뇌 회로의 해부학적, 기능적, 분자적 및 신경화학적 조직에 관한 연구와 같이 신경과학 분야의 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 방법은 AV 뇌의 뉴런 내 유전자 응집에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 설치류와 같은 다른 시스템이나 다양한 신경 조직에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 적절한 양의 SDX G 50 분말을 물을 이용하여 RNA와 함께 수화시키십시오.

용액을 가볍게 혼합하고 상온에서 2~5분 동안 보관합니다. 이 단계는 Sedex G 50 침전 후 시판 sedex 분말에 포함된 덱스트로스로부터 SDX 비드를 분리하는 과정입니다. 상층액을 제거하고 최종 세척 단계까지 이 과정을 3~5회 반복합니다. 이후 SX G 50 용액을 TE 버퍼에 비드 부피 대비 버퍼 비율 1:1로 재현탁하여 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다.

다음으로 컬럼을 준비합니다. 멸균된 1 mL 주사기에 오토클레이브 처리된 글라스 울을 넣고, 플런저로 압착하여 바닥에 조밀한 층을 형성합니다. 그런 다음 주사기를 15 mL 팰컨 튜브에 넣습니다.

C 0 6 5 0 고정각 로터가 장착된 Beckman 원심분리기를 사용하여 1000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 컬럼을 Sedex G 50 용액으로 채웁니다. 원심분리 후, 각 컬럼에 200 µL의 컬럼 세척 완충액을 넣고 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세척합니다.

이전과 동일하게 진행합니다. 마지막으로 각 컬럼에 200 µL의 컬럼 블로킹 버퍼를 가하고 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 평형화하기 위해 이 단계를 4~5회 반복합니다.

준비된 컬럼을 4 °C에 보관하며, RIBA 프로브의 표지가 완료되어 정제 준비가 될 때까지 대기합니다. 여기에 제시된 이중 형광 in situ 하이브리디제이션(C2 hybridization) 또는 D FISH 절차를 위해 두 종류의 RNA 프로브를 준비하며, 하나는 digoxigenin 또는 DIG로 표지하고 다른 하나는 biotin으로 표지합니다. ribo 프로브 표지 용액을 조제하고 표지 반응물을 37 °C 항온수조에서 2시간 동안 인큐베이션하여 프로브 표지를 시작합니다. 2시간의 인큐베이션이 끝나면, 각 표지 반응물에 20 µg/µL tRNA 1 µL와 컬럼 블로킹 버퍼 39 µL를 첨가합니다.

그 다음, 각 컬럼에 블로킹 버퍼 50 µL를 추가하고 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 프로브 정제를 위한 EDEX G 50 컬럼을 준비합니다. 컬럼을 평형화하기 위해 이 단계를 2~3회 반복합니다. 컬럼 준비가 완료되면, 컬럼 하단에 새로운 EEND orph 튜브를 배치합니다.

프로브 용액을 Sedex G 50 컬럼에 적용하고 2000 rpm으로 3분 동안 원심 분리합니다. 정제된 50 µL의 Ribo 프로브 용액을 얻기 위해, 표지 및 정제된 ribo 프로브의 품질과 수율을 평가합니다. 크라이오스탯을 사용하여 하이브리다이제이션을 진행하기 전, 전하 처리된 super frost plus 슬라이드에 뇌 조직 절편 2~3개를 수집합니다.

절편의 두께는 10~12 microns여야 합니다. 슬라이드는 사용 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 새로 제조한 차가운 3% para formaldehyde 용액에 절편을 5분 동안 반응시킵니다.

그 다음 절편들을 PBS로 짧게 두 번 헹굽니다. 이어서 70, 95, 100% 에탄올 용액의 표준 알코올 시리즈를 통해 각 용액에서 2분씩 절편들을 탈수시킵니다. 절편의 탈수가 끝나면, 새로 조제한 아세틸화 용액에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음 절편을 2배 SSPE로 3회 헹군 뒤, 앞서 보여드린 표준 알코올 계열을 통해 아세틸화 후 다시 한번 절편을 탈수시킵니다. 이제 ribo probe를 이용한 하이브리드화를 시작합니다. 조직에 적절한 양의 하이브리드화 용액을 도포하고, 슬라이드를 커버슬립으로 덮은 뒤 금속 슬라이드 홀더에 넣습니다.

홀더를 65 °C로 설정된 미네랄 오일 배스에 담가 하룻밤 동안 유지합니다. 다음 날, 슬라이드 홀더를 미네랄 오일 배스에서 조심스럽게 꺼내고 클로로포름으로 짧게 헹구어 슬라이드에 남은 과잉 오일을 제거합니다.

커버 슬립을 제거하기 위해 슬라이드를 2배 SSPE 용액에 5~10분 동안 담급니다. 커버 슬립을 제거한 후, 슬라이드를 새로운 2배 SSPE 용액으로 옮겨 실온에서 1시간 동안 유지합니다. 이 배양 단계가 시작될 때, 2배 SSPE 및 50% formamide 용액을 하이브리다이제이션 단계와 동일한 온도로 미리 가온합니다. 1시간의 배양이 완료되면 다음 단계로 넘어갑니다.

슬라이드를 미리 데워둔 2배 SSPE 마이드 용액으로 옮기고 1.5시간 동안 인큐베이트합니다. 이 인큐베이션 단계가 시작될 때, 0.1배 SSPE 용액을 하이브리드화 단계와 동일한 온도로 미리 데워둡니다. 슬라이드를 미리 데워둔 0.1배 SSPE 용액으로 옮겨 30분 동안 인큐베이트하여 하이브리드화 후 세척 과정을 마무리합니다.

이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 이제 뇌 절편은 하이브리드화된 ribo 프로브의 검출 및 시각화 준비가 완료되었습니다. TNT 버퍼에 0.3% hydrogen peroxide를 첨가하고, 슬라이드를 이 용액에 10분 동안 반응시킵니다. 그런 다음 deco pen을 사용하여 TNT 버퍼로 슬라이드를 10분씩 세 번 세척합니다.

뇌 절편이 포함된 영역 주변에 웰(well)을 그립니다. 각 슬라이드에 150 µL의 TNB 버퍼를 처리하고, 절편을 이 용액에서 30분 동안 배양합니다. 이 단계 동안 절편이 마르지 않도록 주의하십시오.

다음으로, peroxidase가 결합된 anti-DIG 항체가 포함된 TT NB 용액 150 µL를 처리하고 슬라이드를 습윤 챔버에 2시간 동안 보관합니다. 2시간의 배양이 끝나면, 섹션을 TNT 버퍼로 10분씩 3회 세척합니다. 매회 각 슬라이드에 Alexa 594가 결합된 T IDE 작동 용액 150 µL를 처리하고 슬라이드를 습윤 챔버에 1시간 동안 보관합니다.

1시간이 지나면, TNT 버퍼로 섹션을 10분 동안 3회 세척합니다. 매 세척 시마다 TNT 버퍼 용액에 포함된 0.3% hydrogen peroxide에서 섹션을 10~30분 동안 반응시킵니다. hydrogen peroxide 용액에서의 반응 시간은 mRNA 풍부도에 따라 달라지므로, D fish 이전에 테스트하여 결정해야 합니다.

그런 다음 TNT 버퍼로 10분씩 세 번 세척합니다. 슬라이드당 150 µL의 TMB 버퍼를 도포하고 슬라이드를 습윤 챔버에 30분 동안 보관합니다. 슬라이드를 기울여 과량의 TMB 용액을 제거합니다.

peroxidase가 접합된 anin 항체가 포함된 TMB 용액 150 µL를 첨가하고, 슬라이드를 습윤 챔버에 2시간 동안 보관합니다. 그 다음 TNT 버퍼로 절편을 10분씩 3회 세척합니다. 매회 Alexa 488이 접합된 mite 작업 용액 150 µL를 슬라이드에 도포하고 절편을 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 절편을 TNT buffer로 10분씩 세 번 세척합니다. 두 ribo probe가 모두 항체로 표지되었으므로, 절편을 host solution 150 µL에 넣고 2분 동안 배양합니다. 이후 절편을 TNT buffer로 5분씩 세 번 세척하고, vector shield 또는 prolonged antifa와 같은 형광 호환 마운팅 매질을 절편에 첨가한 뒤 커버 슬립으로 덮고 형광 현미경으로 관찰합니다.

이 대표적인 광학 현미경 사진들은 제브라 핀치 뇌 절편, 특히 포유류의 청각 피질에 해당하는 송버드의 NCM 영역을 대상으로 한 D fish 실험 결과입니다. 뇌 절편은 두 가지 프로브로 하이브리드화되었습니다. 하나는 억제성 뉴런의 하위 집단 마커인 par albumin에 대응하는 비오틴화 리보 프로브(biotinylated ribo probe)이며, 다른 하나는 노래 유도 뉴런의 신뢰할 수 있는 마커인 활동 의존성 유전자 zinc에 대응하는 DIG 표지 리보 프로브(DIG labeled ribo probe)입니다. 두 이미지의 오버레이는 청각적 경험에 의해 활성화된 억제성 뉴런의 세포 집단을 보여줍니다.

화살표 머리는 par에 대한 ribo 프로브로만 표지된 세포를 나타냅니다. Albumin 화살표는 zinc에 대한 RIBA 프로브로만 표지된 대표적인 뉴런을 나타냅니다. 관심 있는 두 전사체를 모두 발현하는 공존 세포는 별표로 표시하였습니다. 이 절차를 수행할 때는 실험대를 청결하게 유지하고, 오염되지 않은 용액, 플라스틱 및 유리 기구를 사용하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 쥐 뇌의 유전자 공동 조절을 연구하기 위해 신선 동결 뇌 절편에서 단일 세포 해상도로 두 종류의 MA 종을 동시에 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 영상을 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.