Name: 더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 배우세요 비방사성 현장에서 하이브리다이제이션을 이용하여 신선한 동결 뇌 섹션에서 두 개의 전사체를 단일 세포 해상도로 동시에 검출하는 방법을. 이 기술은 신경회로의 분자 조직 연구에 활용됩니다.

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이 프로토콜은 이전에 뇌 조직 1-7에 하나 또는 두 개의 사본 수종을 감지하는 우리와 다른 사람에 의해 개발된 표준 방사선이 아닌 방사선 원위치 하이브리드화 방법에 따라 개발 및 정제되었다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 최종 사용자가 선택한 절차 중단의 수에 따라 2 ~ 3 일 총 길이있다. 아래의 자세한 모든 단계가 riboprobe의 하이브리드화 단계 및 사후 하이브 리다이 제이션 세척을 제외하고, 상온에서 실시하는 것입니다. 이 방법에 관련된 모든 단계에 필요한 솔루션 및 버퍼는이 프로토콜의 끝 부분에서 찾을 수 있습니다. 1. 조직 준비 및 Sectioning <ol><li> 참살 빠르게 주제의 두뇌를 추출하고, 적절한 크기의 플라스틱 금형에 넣습니다. </li><li> 조직 테크의 포함 매체와 두뇌를 커버하고 빠르게 빠른 냉동 dry-ice/alcohol 목욕탕에서 플라스틱 금형을 놓으십시오. 냉동 조직은 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 청구 Superfrost 플러스 슬라이드에 슬라이드 당 2 ~ 3 두뇌 섹션을 수집합니다. 섹션의 두께는 10-12 μm의해야합니다. 슬라이드는 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 프로브 정제에 대한 Sephadex G50 열 준비 "Sephadex 컬럼이 상용 소스에서 구입할 수 있지만, 우리는 프로브 정화를 위해 필요합니다 컬럼의 생성을 위해 아래 저가의 대안을 제공합니다. <ol><li> 상온에서 RNase 무료, DEPC - 처리된 물 (예를 들어, DEPC - 처리된 물 100 ML에 분말 2g), 혼합 솔루션 간략하고 저장과 Sephadex G50 분말의 하이드 레이트 적절한 금액 초과 Sephadex G50을 촉진합니다. </li><li> Sephadex G50 강수량 다음 (물을 상위 계층) 뜨는 제거합니다. </li><li> 5 회 - 3 위의 과정을 반복합니다. </li><li> 최종 세척 후 사용까지 4 Sephadex G50 TE 버퍼 (1:1 비율)에 솔루션 및 저장 ° C를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 이곳은 살균 한 ML 주사기로 글라스 울을 autoclaved하고 하단에 소형 레이어를 만들기 위해 플런저로 압축하고 15 ML 팔콘 튜브에 주사기를 놓습니다. </li><li> 잘 TE에 Sephadex G50의 솔루션을 섞는다. 이 솔루션과 함께 주사기 / 열을 채웁니다. </li><li> 1,000 rpm으로 30 초에 대한 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 칼럼이 거의 Sephadex G50 비즈 가득 때까지이 절차를 반복합니다. </li><li> 그 결과 해당 컬럼에 대한 컬럼 세척 버퍼 200 μl를 적용하고 1000 rpm으로 2 분을 위해 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 그 결과 해당 컬럼에 대한 열의 차단 버퍼 200 μl를 적용하고 1000 rpm으로 2 분을 위해 스핀. 열 평형이 단계 4-5 번 반복합니다. ° C까지 사용 Parafilm와 봉인하면 열이 4 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. Riboprobes의 라벨링 및 정제 우리가 상세 한 riboprobe의 생성 및 정화를 아래. dFISH 각 프로브의 준비 프로브 중 하나가 비오틴 - 태그 UTP와 다른 반면 digoxigenin (발굴) 태그 UTP이 표시됩니다 것을 제외하고, 동일한 방법론을 포함합니다. <ol><li> 감각 (제어) 또는 안티 센스 riboprobes 중 하나를 생성하는 관심 집중 (&gt; 150 NG / μl)와 정화 선형 cDNA 솔루션을 준비합니다. </li><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 cDNA 템플릿, 배 프로브 라벨링 버퍼 2 μl, 10X 파다 1 μl (또는 비오틴) - 라벨 믹스, RNasin 0.5 μl하고 적절한 RNA 효소 1 μl를 정화의 0.5-1 μg을 추가 그리고 RNAse없는 (DEPC - 처리) 물 10 μl로 솔루션의 최종 볼륨을 가지고. </li><li> 37 물 목욕에있는 솔루션 ° 2 시간 C를 품어. </li><li> 솔루션 및 열 차단 버퍼 39 μl, tRNA 1 μl (20 μg / μl 주식)를 추가합니다. </li><li> 프로브 정화를위한 Sephadex G50 컬럼을 준비합니다. 이를 위해, 열 50 μl 차단 버퍼를 추가하고 1,000 rpm으로 10 초을 위해 스핀. 열 (즉, 그 결과 해당 컬럼에 적용되는 전체 50 μl가 원심 분리의 사이클 이후에 회복된다) 평형이 단계에게 2-3 번 반복합니다. </li><li> Sephadex G50 칼럼, 위치 칼럼의 하단에 새로운 microfuge 튜브에 프로브 솔루션을 적용하고, riboprobe 솔루션의 정화 50 μl를 얻기 위해 1,000 rpm으로 3 분을 위해 스핀. </li><li> 중 표준 포름 알데히드 - 아가로 오스 겔 RNA, 또는 분광 광도계를 사용하여 레이블 riboprobe의 품질 및 수율을 평가합니다. </li></ol> 4. 포스트 - 고정, 아세틸화 및 하이브리드화 <ol><li> -80 ° C의 냉장고에서 섹션을 제거하고 평형에 실내 온도에 대한 허용합니다. 그 후, 5 분 추위, 갓 만들어진 3 % paraformaldehyde 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 간략 P의 부분을 씻어hosphate 두 번 호수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 표준 알코올 시리즈 (70, 95, 및 100 %, 2 분마다)를 통해 섹션을 탈수하고, 그들이 공기 건조하게. </li><li> 10 분 아세틸화 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 2X SSPE에 섹션 3 번 린스. </li><li> 표준 알코올 시리즈 위에서 설명한을 통해 다시 한번 섹션을 탈수하고, 그들이 공기 건조 수 있습니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션의 적절한 볼륨을 준비하고 솔루션 (프로브 농도 : 각 프로브 1 NG / μl)를 모두 riboprobes를 추가합니다. 하이브 리다이 제이션 솔루션의 총 부피는 (섹션당 하이브 리다이 제이션 용액 16 μl) hybridized 수 섹션의 개수에 따라 결정됩니다. </li><li> 그 공기 방울 오버레이에게 조직을 보장하지 조직 및 coverslip 슬라이드에 하이브 리다이 제이션 솔루션의 적절한 볼륨을 적용합니다. </li><li> 이곳은 금속 슬라이드 홀더에 슬라이드. 미네랄 오일 욕조에 담가 소유자 ° C 야간 65으로 설정합니다. 그 coverslips (즉, 슬라이드 소유자의 측면은 미네랄 오일 컨테이너의 하단에 접촉해야합니다) 위쪽으로 직면하고 있는지 확인합니다. </li></ol> 5. 포스트 하이브 리다이 제이션 씻는다 <ol><li> 다음날, 조심스럽게 미네랄 오일 목욕에서 슬라이드 홀더를 제거하고 간단히 슬라이드에서 여분의 기름을 제거하기 위해 클로로포름에 린스. </li><li> 플레이스 5-10 분 2X SSPE 솔루션 슬라이드. Coverslips은 용액 중에 슬라이드에서 분리해야합니다. </li><li> 새로운 2X SSPE 솔루션에 슬라이드를 전송하고, 실온에서 1 시간 그들을 유지. </li><li> 2X SSPE 플러스 50 %의 포름 아미드를 포함하는 솔루션으로 섹션을 전송합니다. 이 솔루션의 온도는 야간 하이브 리다이 제이션 절차에 사용되는 온도를 일치해야합니다. 1.5 시간이 용액에 슬라이드를 유지. </li><li> 0.1X SSPE 솔루션 하이브리드화 단계의 동일한 온도로 미리 예열 섹션을 전송합니다. 30 분이 솔루션 섹션을 품어. 추가 30 분에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol> 6. Riboprobes의 감지 및 시각화 <ol><li> 어느하기 위해 0.3 % 과산화수소가 10 분 동안 추가되었습니다 TNT 버퍼에 슬라이드를 전송합니다. </li><li> TNT 버퍼, 3 회 (각 10 분)에 섹션을 씻으십시오. </li><li> DAKO 펜 사용하여 두뇌 섹션을 포함하는 주변 잘 그려. 중요한주의는 해당 섹션 건조하지 않도록하기 위해 행사되어야합니다. </li><li> 각 슬라이드에 TNB 버퍼 150 μl를 적용하고, 습기 챔버에서 30 분이 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 틸팅 슬라이드로 초과 TNB 솔루션을 제거합니다. </li><li> 2 시간의 습기가 실내에 퍼옥시데이즈 - 복합 백신 발굴 항체 및 저장 슬라이드가 포함된 TNB 솔루션 150 μl을 적용합니다. 항체 농도 전에 dFISH을 수행하기 위해 관심의 각 사본에 대해 개별적으로 결정되어야합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 알렉사 각 슬라이드 594 - 복합 tyramide 작업 솔루션을 150 μl를 적용하고, 1 시간에 습기 챔버에 저장합니다. 이 솔루션은 제조 업체의 지시에 따라 준비되어야합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 30 분 - TNT 버퍼에 품어 섹션 어느 위해 0.3 % 과산화수소 10에 추가되었습니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 슬라이드 당 TNB 버퍼 150 μl를 적용하고, 30 분 습한 실내에 보관하십시오. </li><li> 틸팅 슬라이드로 초과 TNB 솔루션을 제거합니다. </li><li> 2 시간의 습기가 실내에 퍼옥시데이즈 - 복합 안티 - 비오틴 항체 및 저장 슬라이드가 포함된 TNB 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 알렉사 150 μl 488 - 복합 슬라이드 1 시간을 위해 품어 섹션 tyramide 작업 솔루션을 적용합니다. 이 솔루션은 제조 업체의 권고에 따라 준비되어야합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 섹션 Hoechst 솔루션 (TNT 버퍼에 1:1000) 150 μl를 추가 2 분 습한 챔버에 보관하십시오. </li><li> TNT 버퍼에 섹션을 씻어, 3 회, 5 분마다. </li><li> 형광 호환 설치 매체 (예 : Vectashield 또는 antifade을 연장)와 Coverslip 섹션. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 우리는 여기 얼룩말 핀치 두뇌에서 얻은 대표 dFISH 결과를 보여줍니다. caudomedial nidopallium (NCM), 포유류의 청각 피질의 송버드 아날로그에서 얻은 photomicrographs 있습니다 표시됩니다. 뇌 섹션은 parvalbumin (A), 억제 신경의 하위 인구 마커에 대한 감독 biotinylated riboprobe와 hybridized 및 ribo 파고 - 라벨이 붙지만탐사선이 활동에 의존 유전자 zenk (B), 노래 위주의 뉴런에 안정적인 마커에 대한 감독. (A)와 (B) 청각 경험에 의해 활성화됩니다 억제 뉴런의 인구를 보여줍니다의 C) 중첩. 화살표와 화살촉이 두 riboprobes의 각 독점적으로 표시된 셀을 표시하고, 별표 관심의 두 사본을 공동 표현 대표 뉴런을 보여줍니다. 스케일 바 = 25 μm의.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 척추 두뇌가 neurochemically 및 기능 구성 방법 연구, 어떻게 behaviorally - 관련 감각 자극에 미치는 영향 성인 뇌 8-10에서 뉴런의 게놈 기기 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 마우스, 쥐 그리고 노래하는 새는에서 뇌 조직에서이 방법을 사용하지만,이 프로토콜은 척추 동물의 배열, 그리고 아마도이 아닌 신경 조직에서 얻은 뇌 부분에 쉽게 적용할 수있을 것으로 예상했습니다. 신뢰할 수있는 결과와 최적의 신호를 취득하는 데 필요한 키 컨트롤의 그룹을 다른 11, 12에 의해 광범위하게 자세한되었습니다.

솔루션 <ol><li> 칼럼 세척 버퍼 : 50 ML DEPC - 처리된 물 10 MM 트리스 - HCL, 0.15 M NaCl, 0.05 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 50 μg / μl tRNA, 0.1 % SDS. </li><li> 열 차단 버퍼 : 50 ML DEPC - 처리된 물 10 MM 트리스 - HCL, 50 MM NaCl, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </li><li> TNT 버퍼 : 60 ML 1 M 트리스 - HCL, 5 M NaCl 18 ML과 트리톤의 1.8 ML DEPC - 처리된 물 600 ML에서 X - 100. </li><li> TNB 버퍼 : 100 MM 트리스 - HCL, 8.3 μg / μl BSA, 0.15 M NaCl 3 % 트리톤 DEPC - 처리된 물에 X - 100. </li><li> TE 버퍼 : 10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5 플러스 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.5. </li><li> 아세틸화 솔루션 : triethanolamine 플러스 DEPC - 처리된 물 200 ML에 아세트산 무수물 0.5 ML의 2.7 ML. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션 : 50 % 포름 아미드, 2X SSPE, 2 μg / μl tRNA, 1 μg / μl BSA 및 1 μg / DEPC - 처리된 물에 μl 폴리. 이 섹션마다 16리터이 필요합니다. </li></ol>

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

여기서 우리는 두 형광의 수정된 버전을 설명<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브 리다이 제이션 (dFISH) 메소드 신선한 냉동 뇌 부분에 대한 관심의 두 mRNAs 검출에 최적화된. 우리 그룹은 성공적으로 유전자 공동 규제를 공부하기 위해이 방법을 사용하고 있습니다. 더 구체적으로, 우리는 단세포 해상도의 해부 조직 neurochemical 특성, 및 중앙 감각 회로의 감각적 경험의 영향을 탐험이 dFISH 방법을 사용했습니다. 이 프로토콜은 쥐, 쥐 및 노래하는 새는에서 뇌 조직에서 검증된되었지만 쉽게 다른 척추 종 적용할뿐만 아니라 이외의 신경 조직의 배열로 될 예정입니다. 이 영화에서 우리는이 절차의 주요 단계에 대한 자세한 데모를 제공합니다.

이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함<em&gt; 원위치</em척추 두뇌의 얇은 부분에서, 단일 셀 해상도로 두 사본 종의 동시 확인 가능&gt; 하이브 리다이 제이션 절차.

여기서 우리는 신선한 조직 내 두 가지 표적 mRNA를 검출하기 위해 최적화된 이중 형광 인시튜 하이브리다이제이션(double fluorescence in situ hybridization, dFISH) 방법의 수정 버전을 설명합니다...

안녕하세요, 저는 로체스터 대학교(University of Rochester) AL 도움 실험실의 박사후 연구원 JA입니다. 이번 영상에서는 단일 세포 해상도로 두 가지 mRNA 전사체를 동시에 검출하기 위해, 신선 동결 뇌 절편에서 수행하는 Process Institute 하이브리드 소화를 보여드리겠습니다. 이 방법은 뇌 회로의 해부학적, 기능적, 분자적 및 신경화학적 조직에 관한 연구와 같이 신경과학 분야의 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 방법은 AV 뇌의 뉴런 내 유전자 응집에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 설치류와 같은 다른 시스템이나 다양한 신경 조직에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 적절한 양의 SDX G 50 분말을 물을 이용하여 RNA와 함께 수화시키십시오.용액을 가볍게 혼합하고 상온에서 2~5분 동안 보관합니다. 이 단계는 Sedex G 50 침전 후 시판 sedex 분말에 포함된 덱스트로스로부터 SDX 비드를 분리하는 과정입니다. 상층액을 제거하고 최종 세척 단계까지 이 과정을 3~5회 반복합니다. 이후 SX G 50 용액을 TE 버퍼에 비드 부피 대비 버퍼 비율 1:1로 재현탁하여 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다.다음으로 컬럼을 준비합니다. 멸균된 1 mL 주사기에 오토클레이브 처리된 글라스 울을 넣고, 플런저로 압착하여 바닥에 조밀한 층을 형성합니다. 그런 다음 주사기를 15 mL 팰컨 튜브에 넣습니다.C 0 6 5 0 고정각 로터가 장착된 Beckman 원심분리기를 사용하여 1000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 컬럼을 Sedex G 50 용액으로 채웁니다. 원심분리 후, 각 컬럼에 200 µL의 컬럼 세척 완충액을 넣고 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세척합니다.이전과 동일하게 진행합니다. 마지막으로 각 컬럼에 200 µL의 컬럼 블로킹 버퍼를 가하고 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 평형화하기 위해 이 단계를 4~5회 반복합니다.준비된 컬럼을 4 °C에 보관하며, RIBA 프로브의 표지가 완료되어 정제 준비가 될 때까지 대기합니다. 여기에 제시된 이중 형광 in situ 하이브리디제이션(C2 hybridization) 또는 D FISH 절차를 위해 두 종류의 RNA 프로브를 준비하며, 하나는 digoxigenin 또는 DIG로 표지하고 다른 하나는 biotin으로 표지합니다. ribo 프로브 표지 용액을

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Jolly, S., et.al. 이중 형광 In situ hybridization과 면역 라벨링을 결합하여 마우스 뇌 섹션에서 3개의 유전자 발현을 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016). 이 비디오는 이중 형광 in situ hybridization을 사용하여 마우스 뇌 섹션에서 두 RNA 표적의 발현을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 사용하여 RNA를 순차적으로 검출한 다음 효소 신호 증폭을 통해 감도를 향상시키는 것을 포함합니다. 그 결과 생성된 형광은 조직 내 표적 RNA의 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다.

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections(쥐 뇌 절편에서 유전자 발현을 검출하기 위한 이중 형광 혼성화)

출처: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization(고해상도 현장 혼성화를 사용한 뇌 절편에서 축삭 국소화 mRNA 검출).  J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형광 현장 혼성화 및 항체 염색을 사용하여 고정 마우스 해마 절편의 콜린성 축삭 내에서 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 콜린성 뉴런에서 프로브 태그가 지정된 mRNA와 콜린 아세틸전이효소의 공간적 국소화를 보여줍니다.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.

자유 부유 조직 절편을 사용한 조직학적 기반 염색

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

이 연구는 참수, 고정, 동결 절제, 형광 염색, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 조직 처리를 위한 단순화된 프로토콜을 제시하며, 이는 공초점 및 다광자 이미징으로 확장될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 해부에 필적하는 효능을 유지하며 고급 운동 기술의 필요성을 우회합니다. 정량적 이미지 분석은 광범위한 조사 잠재력을 제공합니다.

향상된 뇌 형광 염색 및 면역 염색을 위한 초파리 머리의 직접 동결 절편

배우세요 비방사성 현장에서 하이브리다이제이션을 이용하여 신선한 동결 뇌 섹션에서 두 개의 전사체를 단일 세포 해상도로 동시에 검출하는 방법을. 이 기술은 신경회로의 분자 조직 연구에 활용됩니다.

더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션

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