Name: 의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 배우세요 해마 오가노타입 슬라이스 배양법을 이용한 신경 손상 모델링 방법을. 포피듐 아이오다이드 염색과 형광 현미경을 통해 CA1, CA3 및 치아영역의 신경사망률을 정량화하여 신경독성 연구에 활용할 수 있습니다.

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NINDS, 미국 심장 협회, 노화 연구에 대한 미국 연방, 천 년 3 월에 의해 투자

1. 준비 시작하기 전에, 필요한 수술 도구, 해부, 문화 미디어, 그리고 칠일 늙은 쥐 또는 마우스 새끼를 조립. 프로토콜은 마우스 및 쥐 준비에 대해 동일합니다. (I) 재료 및 장비 <ul><li> 운영 가위 (직선 길이 6 ", 고양이 # RS6818, Roboz, 게이 더 스버그, MD) </li><li> 마이크로 가위, 해부 (길이 4 ', "고양이 # RS5910합니다. Roboz, 게이 더 스버그, MD)는 </li><li> 카본 스틸 더몬트 족집게 (CAT # RS - 5045.Roboz, 게이 더 스버그, MD) </li><li> 수정 유리 "전송"pipettes (삭제 파스퇴르 피펫의 아래쪽과 가장자리 smoothed) </li><li> Aclar 플라스틱 필름은 광장에서 (하니웰, # 812071, 포츠빌, PA) "X 2"2 컷 </li><li> 3에 의한 스폰지 4 (켄달, 고양이 # 3157, 맨스필드, MA) 커버 </li><li> 30mm Millicell 막 삽입 (0.4 μm의, Millipore, 베드 포드, MA) </li><li> 양날 면도날 (맥일웨인 조직 헬기, Vibratome 회사, 세인트 루이스, MO)와 Mcllwain 조직 헬기 </li><li> CCD 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어와 함께 바뀌 현미경 </li></ul> (2) 해부 매체 (DM, 산도 7.3에서 1리터) <table border="0"><tbody><tr><td> 행크의 균형 소금 </td><td> 1 병에 (95.2 g/1L) (시그마 : H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4.2 ㎜) </td><td> 350 MG </td></tr><tr><td> HEPES (10 ㎜) </td><td> 2.83 g </td></tr><tr><td> 포도당 (33.3 ㎜) </td><td> 6.0 g </td></tr><tr><td> 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (100x) </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> BSA (0.3 %) </td><td> 300 MG </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> 1.44 g </td></tr></tbody></table> (3) 문화 매체 (400 ML) <table border="0"><tbody><tr><td> 멤 (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 ML </td></tr><tr><td> *** 행크의 대차 소금 (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> 호스 혈청 (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 (1 M, Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (100x) </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> *** 문화 매체를하기 전에 500 ML 행크의 밸런스 솔트 12.8 g의 포도당을 추가 </td></tr></tbody></table> (4) 동물 칠일 늙은 쥐 또는 마우스 출생 후의 새끼, 실험마다 일반적으로 하나의 쓰레기. 2. 문화 당일 <ol><li> 모든 해부 도구와 Aclar 영화는 시작하기 전에 30 분 70 % ETOH에 배어 있어야합니다. 절개 후드, 블레이드 및 조직 헬기의 표면은 에탄올로 소독해야합니다. </li><li> (3-4) 여러 여섯 잘 조직 문화 번호판을 준비, 잘 당 1 ML 문화 매체를 추가하고 각 우물에 Millipore 투과 막를 삽입합니다. 37 장소는 6 - 잘 접시 ° 보육 조각을 전송할 준비까지. </li><li> DM 얼음에 장소 몇 가지 (4-​​6) 60mm 플레이트를 준비합니다. </li><li> 신속하게 가위로 목을 베다와 70% ETOH에서 수영을하고, 신속하게 두개골의 saggital 절개로 머리를 노출. 조심스럽게 추위 DM에 즉시 두뇌과 장소를 제거합니다. 두 반구로 그것을 분리 후 2-3 초 동안 표지 스폰지의 각 반구 내측 면을 아래로 놓습니다. </li><li> 부드럽게 조직 헬기에 Aclar 영화 광장과 장소에 반구를 리프트와 장소, 350 μm의 섹션에 coronally 머리를 잘라. 완료되면, 부드럽게 감기 DM에서 sectioned 북반구와 잠수함과 Alcar 광장을. </li><li> 해부 현미경을 사용하여 hippocampal 섹션을 구분합니다. 밀고 들어, 꼬리 해마에 주동이의 스패닝 5 섹션이 있어야하고, 마우스 되려면 3-4 섹션이 있어야합니다. </li><li> 37 ° 조직 문화의 인큐베이터에서 막 삽입과 함께 6 자 번호판을 가져가라. 유리 전송 피펫을 사용하여 투과 세포막에 개별적으로 hippocampal 조각 전송합니다. 너무 DM은 멤브레인에 출시되면, 파스퇴르 피펫과 DM 초과를 제거합니다. 각 막 위에 다섯개의 hippocampal 조각 플레이스. 조건 당 적어도 3 웰스, 15 조각 허용합니다. </li><li> 독성 실험을 시작하기 전에 12-14일에 대한 5 %의 CO humidified 인큐베이터에서 37 °에있는 문화 번호판을 품어. 문화 매체는 일주일에 두 번 변경할 수 있습니다. </li></ol> 3. 슬라이스 문화 Hippocampal의 연결 부상을 유도하고 Quantifying <ol><li> 문화 12~14일 후, 문화 미디어에 5 μg / ML의 propidium 요오드화물의 (PI)를 추가합니다. 이 단계는 시각화와 기저 세포 사망의 부량 수 있습니다. </li><li> 그 다음날, PI를 계량각 hippocampal 슬라이스의 CA1의 subregion (및 / 또는 CA3 또는 이가있는 원하는 경우)의 형광 및 취득은 기저 세포 죽음 (시간라고도 = 0 시간, 또는 T 0) 대표 PI 형광 측정을 의미합니다. 이미지 수집 및 부량 위해, 우리는 OpenLab 소프트웨어 (순발력, 영국),하지만 다른 이미지 인수를 사용하여 분석 소프트웨어는 형광 강도를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 즉시 T 0 PI 형광의 이미지 취득 후, 선택의 방법 (우리의 연결 독성 2,5를 유도 한 시간 10 μm의 NMDA, 산소 - 포도당 박탈, 또는 LPS를 사용한)으로의 연결을 부상을 유발. 독성 자극 후, 5 μg / ML PI를 포함하는 새로운 매체와 매체를 교체하고 야간 조각 유지합니다. </li><li> 일 3, PI 24 시간의 실험 조건의 형광 또는 T 24을 의미 계량. </li><li> 이 이미지 수집 후, 즉시 매체를 변경 및 10 μm의 NMDA 및 5 μg / ML PI와 최대한의 연결을 죽음을 달성하기 위해 밤새 품어 슬라이스를 추가합니다. </li><li> 일 4, T 최대로 정의 최대한의 연결을 죽음의 PI의 형광을 의미 계량. 다음과 같이 %의 세포 죽음을 계산 : (T 24 - T 0) / (T 최대 - T 0). </li></ol> 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. hippocampal와 후속 실험 부상 및 이미지 수집의 세대 (A) 타임 라인. (B) hippocampal basally 조각 (T 0), 10 μm의 NMDA (T 24)에 1 시간 노출 다음 24 시간과 최대한의 연결을 부상 (T 최대)을 구하는 NMDA 추가로 24 시간 또는 10 μm의 이후. 대표 이미지

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

실험을 복제하면 재현할하고 일관된 결과를 보장하기 위해 수행하는 두 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 실험 전에 12-14일에 대한 hippocampal 조각의 시대를하게하는 것이 중요합니다. 슬라이스 절연을 통해 상당한 microglial 응답이 있으며, microglia는 체외에서 3,6 일 10 가지를내는 발생 휴식 상태로 돌아와, 일정 기간 동안 활성 상태로 유지됩니다. 둘째, PI 형광 강도가 부상 세포의 수를 4로 비례 의미합니다. 선형 형광 세 시간 지점에서 측정한다 (I) T 0, NMDA 또는 ​​자연의 연결을 죽음의 기저 수준을 측정하는 OGD 자극하기 전에, (2) T 24, 또는 24 시간 NMDA 또는 ​​OGD 또는 다른 자극과 자극 후 그리고 (iii) T 맥스에서의 연결을 죽음의 최대한의 금액을 생산하는 10 μm의 NMDA와 함께 24 시간 야간 치명적인 치료와 조각의 최종 치료...

의 연결을 부상을 검사에 대한 organotypic hippocampal 슬라이스 문화 모델

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화의 기본 아키텍처와 해마의 구성이 상대적으로 1 보존되어있는 부상의 연결 메커니즘을 검토에서 체외 방식입니다. organotypic 문화 시스템은 astrocytic의 연결 및 microglial 효과 시험은 가능하지만, 전직 생체내 준비로 주변 염증 세포의 혈액 흐름, 또는 모집의 효과를 해결하지 않습니다. 이를 위해,이 문화 방법은 자주 해마의 피라미드 뉴런에 excitotoxic 및 hypoxic 부상을 확인하는 데 사용됩니다뿐만 아니라 염증 반응을 검사하는 데 사용되었습니다. 여기에 우리는 출생 후의 쥐 두뇌에서 hippocampal 슬라이스 문화를 생성의 연결 부상을 유발하는 유해 자극을 관리하고, 시금 및 hippocampal의 연결을 죽음을 quantifying위한 방법을 설명합니다.

organoptypic hippocampal 슬라이스 문화 모델입니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 모델 패러다임의 다양한 부상의 연결을 검사하는 데 사용됩니다. 이 문서에서는, 우리는 슬라이스 문화를 생성하고의 연결 부상을 quantifying위한 방법을 설명합니다.

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

장기배양 해마 절편 배양은 신경 세포 손상 메커니즘을 조사하기 위한 인비트로(in vitro) 방법으로, ...의 기본적인 구조와 조성을 유지합니다.

이 절차의 전반적인 목적은 NMDA, 흥분성 독성 산소, 포도당 결핍 또는 리포폴리사카라이드나 아밀로이드 베타 펩타이드와 같은 염증성 자극을 포함한 다양한 자극에 반응하는 신경세포 손상을 모델링하는 데 사용할 수 있는 기관유사 해마 슬라이스 배양물을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 출생 후의 뇌를 분리하고 각 반구를 절단하여 관상면 절편을 생성합니다. 절차의 두 번째 단계는 해마 영역을 분리하여 6-웰 플레이트의 멤브레인 인서트 위에서 배양하는 것입니다. 절편을 배양한 후, 해당 절편을 프로피듐 아이오다이드로 염색하고 자발적 신경세포 사멸 수준을 계산합니다.마지막으로, 절편에 신경독성제를 처리하고 다시 염색하여 처리에 따른 독성 반응을 측정합니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 이용한 propidium iodide 형광 정량화를 통해 다양한 실험 조건에 따른 해마의 CA1, CA3 및 치상회 영역의 신경세포 사멸률(%) 결과를 얻을 수 있습니다. 일차 신경세포 배양과 같은 기존 방식보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 해마의 기본 구조가 상대적으로 온전하게 유지된 상태에서 신경 손상 기전을 조사할 수 있다는 점입니다.세 번째 유형에는 운동이 포함됩니다. 해부를 시작하기 전, 마이크로그리아(Microglia)와 ROY를 보존합니다. 각각에 밀리포어(millipore) 투과성 막을 삽입하십시오.여러 개의 6-well 조직 배양 플레이트의 각 웰에 배양액 1 mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 37 °C로 플레이트를 가온합니다.생후 7일 된 쥐 새끼의 절단된 머리를 70% ethanol에 짧게 담급니다. 소독 후, 미세 해부 가위를 사용하여 두개골을 따라 시상 절개를 가해 뇌를 노출시킵니다. 핀셋을 사용하여 뇌를 빠르게 제거한 후, 얼음 위에 놓인 60 millimeter 해부 배지가 담긴 접시로 옮깁니다.포셉을 사용하여 뇌를 두 개의 반구로 분리합니다. 각 반구의 내측면이 아래로 향하게 하여 건조한 커버 스펀지 위에 2~3초 동안 올려두어 과도한 수분을 제거합니다. 뇌를 투명 필름 조각으로 옮긴 후 조직 절단기(tissue chopper) 플랫폼에 놓고, 로스랜드(rosland)부터 시작하여 350 micron 두께로 관상면(coronal) 절단을 수행합니다.계속해서 조심스럽게 진행합니다. A clar square를 부드럽게 들어 올려 절편들을 얼음처럼 차가운 해부 배지가 담긴 새 접시에 담급니다. 해부 현미경 하에

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 쉽게 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다 organotypic hippocampal 조각을 준비하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각이 인터페이스를 형성하기 위해 허용되는 구멍이 세포막과 문화 미디어에 누워있다. 이 방법은 최대 문화에 이주하는 해마의 매출 구조를 유지합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

이 비디오는 새끼 쥐의 뇌에서 유기형 해마 절편 배양을 준비하는 방법을 보여줍니다. 해마 절편에서 세포 생존력과 성장을 촉진하여 궁극적으로 유기형 절편 배양을 생성하는 데 필요한 해마 해미 해부 및 배양 조건과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Preparation of Organotypic Slice Cultures from a Rat Pup's Hippocampus(쥐 새끼의 해마에서 유기형 슬라이스 배양 준비)

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다.  이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

여기에서, 우리는 라인 피질-해마 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 혈청의 점진적이고 통제된 박탈에서, 이 조각은 진화하는 간질 같이 사건을 묘사하고 간질 발생의 전 생체 권 모형으로 간주될 수 있습니다. 이 시스템은 자발적인 활동의 역학을 모니터링뿐만 아니라 간질 발생 과정을 통해 신경 염증 기능의 진행을 평가하기위한 훌륭한 도구를 나타냅니다.

라인 피질-해마 오르가노티픽 슬라이스 배양에서 간질 발생의 모델

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

배우세요 해마 오가노타입 슬라이스 배양법을 이용한 신경 손상 모델링 방법을. 포피듐 아이오다이드 염색과 형광 현미경을 통해 CA1, CA3 및 치아영역의 신경사망률을 정량화하여 신경독성 연구에 활용할 수 있습니다.

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

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