심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

탈세포화된 심낭 및 심근 조직으로 제조된 매트릭스 겔은 다양한 단백질, 펩타이드 및 글리코사미노글리칸을 포함한 천연 세포외 기질 성분을 유지합니다. 이러한 조직 매트릭스는 조직 공학에 활용될 수 있습니다. 본 영상에서는 심낭 조직을 탈세포화하여 무세포 세포외 기질을 생성함으로써 매트릭스 겔을 제작하는 과정을 보여줍니다.

이후 세포외 기질을 처리하여 가용성 액체 형태로 제작합니다. 다음으로, 가용화된 기질을 소동물 모델에 테스트하여 주입 가능한 지지체로서의 타당성을 확인합니다. 조직학 및 면역조직화학 분석 결과, 생체 내에서 주입된 물질이 혈관 세포의 침투를 가능하게 하는 다공성 섬유 지지체를 형성함이 입증되었습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스의 Karen Chrisman 박사님 연구실에서 공부하고 있는 대학원생 Sonia Zeki입니다. 오늘은 탈세포화된 조직으로부터 가용화된 ECM을 제작하고, 이를 심장 조직 공학 응용 분야에 적용하여 in vivo 테스트를 수행하는 방법을 시연하겠습니다.

이러한 기술들은 심부전 치료를 위한 주입형 바이오 소재 치료제 개발에 있어 매우 중요합니다. 심근경색 후의 수술 절차를 저희 실험실의 수의 신경외과 전문의인 Pam shoot McGuffin이 시연하겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

먼저 조직을 탈세포화하여 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)만 남기는 과정으로 이 프로토콜을 시작합니다. 돼지 심낭을 탈이온수 비커에 넣고 실온에서 30분 동안 교반하여 세척합니다. 세척 후, 1% SDS와 1% penicillin streptomycin이 포함된 1배 PBS에 조직을 넣고 실온에서 24시간 동안 계속해서 교반합니다. 다음 날, 조직을 다시 탈이온수에 넣고 5시간 동안 계속 교반하며, 거품이 모두 사라질 때까지 50 mL 튜브에 넣어 흔들어 줍니다.

헤마틴-에오신 염색을 통해 탈세포화된 조직에 핵이 없음을 확인해야 합니다. 탈세포화된 조직의 나머지 부분을 15~50 mL 원심분리관에 넣습니다. 그 다음, 조직을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.

매우 낮은 압력과 매우 낮은 온도에서 동결 건조하여 냉동 시료를 완전히 건조될 때까지 동결 건조하십시오. 사용하는 시스템과 시료의 수분 함량에 따라 12시간에서 72시간 정도 소요될 수 있습니다. 탈세포화된 조직이 완전히 건조되면, 이를 Wiley Minim mill로 옮기십시오.

40 게이지 메쉬를 설치하고 조직을 갈아 고운 분말로 만듭니다. 샘플의 대부분이 필터를 통과하면 수집 용기를 제거합니다. 이 샘플을 이제 세포외 기질 또는 ECM 분말이라고 합니다.

다음 단계로 즉시 진행하지 않는 경우, 이 시점에서 두 번째 동결건조 단계를 수행할 수 있습니다. 이는 ECM을 가용화하기 위해 기록된 무게의 정확성을 보장하기 위함입니다. 멸균된 vial에 원하는 양의 ECM 분말을 정량하여 잽니다.

1 mg/mL 농도의 멸균 여과된 염화수소 용액을 ECM 분말이 들어 있는 신틸레이션 바이알에 첨가하여 ECM 농도가 10 mg/mL가 되도록 합니다. 마그네틱 바를 넣고 바이알을 교반기에 올립니다.

멸균된 WHE 스푼이나 스패튤라로 바이알 벽면을 주기적으로 긁어내며 48~60시간 동안 계속 교반하십시오. 이는 모든 ECM 분말이 완전히 소화되도록 하기 위함입니다. ECM이 소화됨에 따라 용액 상태로 녹아들어 갈 것입니다.

ECM이 가용화되면 샘플을 얼음에 두고 수산화나트륨과 염산을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. pH 조정이 완료되면, 용액의 최종 염 농도가 1배 PBS가 되도록 10배 PBS를 첨가합니다. 예를 들어, ECM 용액이 900 µL인 경우, pH 조정 후 100 µL의 10배 PBS를 첨가해야 합니다.

중화를 위해 첨가한 부피와 pH 테스트를 위해 제거한 부피를 합산하여 가용화된 ECM 용액의 농도를 결정하십시오. 그런 다음, 원하는 최종 농도인 6 mg/mL에 도달하도록 1× PBS를 추가하십시오.

수술 당일에 가용화된 ECM 75 µL를 30 gauge 바늘이 장착된 0.1 mL 주사기에 준비합니다. 기관 삽관을 마친 암컷 Harlan dolly 쥐에게 2.5% isoflurane을 투여하여 마취 상태를 유지합니다. 그 다음, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마취 상태를 확인합니다.

수분 공급을 위해 하복부에 락테이트 링거액 3 mL를 피하 주사합니다. 다음으로, 동물을 수술대 위에 앙와위로 눕히고 사지를 테이프로 부드럽게 고정합니다. 클리퍼를 사용하여 복부의 털을 제거하고, 떨어진 털은 진공청소기로 흡입하여 제거합니다.

검상돌기부터 복부 우하측까지 대각선을 따라 2% lidocaine을 50 µL씩 연속적으로 주입합니다. 그다음 Betadine을 사용하여 중앙에서 바깥쪽으로 세 번 문질러 소독합니다. isopropyl alcohol을 사용하여 동일하게 소독 과정을 반복합니다.

그런 다음 미리 원형 창이 만들어진 수술용 드레이프로 동물을 덮습니다. 수술용 드레이프로 고정합니다. 10번 메스를 사용하여

검상돌기부터 복부 오른쪽 하단까지 3~4 cm 길이로 절개합니다. 검상돌기의 위치를 확인하고 근육을 통해 오른쪽으로 수직으로 절개하며, 이때 오른쪽에 있는 큰 혈관이 손상되지 않도록 주의합니다. 그다음, 가위를 사용하여 근육을 가로 방향으로 절개하여 횡격막을 노출시킵니다.

36인치 길이의 3-0 Vicryl 봉합사와 지혈집게(hemostats)를 사용하여 간을 건드리지 않도록 주의하십시오. 바늘 하나를 검상돌기(xiphoid process)에 통과시킨 후 봉합사를 절반 정도 끌어당깁니다. 봉합사 끝부분을 서로 테이프로 붙여 동물 위쪽 뒤편의 한 지점에 고정하고, 다른 36인치 길이의 3-0 Vicryl 봉합사로 검상돌기를 들어 올려 횡격막을 노출시킵니다.

검상돌기와 가장 가까운 근육을 통해 바늘을 찌른 다음, 다시 바늘을 끌어내어 수술대 오른쪽의 다른 지점에 고정함으로써 수술강을 완전히 노출시킵니다. 다음으로, 작은 쥐치아 미세포셉(rat tooth micro forceps)을 사용하여 횡격막의 중앙을 잡고 밖으로 당긴 후, 둔탁한 가위(blunt scissors)로 매우 작은 절개를 가합니다. 이 구멍이 만들어지면 폐가 수축하며 뒤로 물러나게 됩니다.

심장을 관찰하기 위해 횡격막을 통해 2~3cm 길이로 수직 절개합니다. 그런 다음 강 공동의 왼쪽에 3인치 면봉을 삽입하여 폐를 밀어냅니다. 타월 클램프를 사용하여 면봉을 제자리에 고정합니다.

다른 면봉을 사용하여 우폐를 옆으로 밀어 심낭을 찾습니다. 그다음 마이크로 포셉과 대형 세레이티드 포셉을 사용하여 심낭을 찢어 심장 첨부를 노출시킵니다. 우측 치상 마이크로 포셉으로 심장 첨부를 잡고, 바늘의 사면이 왼쪽을 향하도록 삽입하여 용해된 매트릭스를 주입합니다.

심첨부에서 심외막 표면과 평행하게 상단 1/3 지점에 위치시킵니다. 이때 대심장정맥을 피하도록 주의하십시오. 가용화된 매트릭스 겔을 주입하고, 바늘을 제거하기 전 몇 초 동안 기다립니다.

주사 부위의 조직이 하얗게 변해야 하며, 체강 내의 혈액을 면봉으로 닦아냅니다. 이후 곡선형 미세 지혈鉗(curved micro hemostats)을 사용하여 오른쪽 폐를 고정하고 있던 타월 클램프와 면봉을 제거하고, 30인치 길이의 5-0 proline 봉합사로 첫 매듭을 짓습니다. 그런 다음 쥐 치과용 미세 포셉(rat tooth micro forceps)과 테이퍼 바늘(tapered needle)을 사용하여 횡격막을 연속 봉합으로 완전히 닫습니다. PE 1 60 흡입 튜브를 삽입하고 10밀리리터 주사기를 사용하여 흉강을 비우면서 튜브 주변을 봉합하여 닫습니다.

봉합사를 조이면 횡격막이 오목해져야 합니다. 플루오린 얼음을 1%로 낮추십시오. 강강을 열어두고 있던 세 개의 3-0 Vicryl 봉합사를 모두 제거합니다. 근육에 수분을 공급하고 면봉이나 멸균 거즈로 과도한 수분을 닦아냅니다.

새로운 3-0 봉합사를 사용하여 간헐 봉합으로 근육층을 폐쇄합니다. 그 후 isoflurane 공급을 중단합니다. 해당 부위를 세척하고 스테이플러를 사용하여 피부를 봉합합니다.

그런 다음 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 도포하십시오. 100% oxygen 하에서 쥐가 회복되도록 합니다. 동물이 인공호흡기 주변에서 자가 호흡을 시작하면 기관 튜브를 제거하십시오.

동물이 의식을 회복하여 다시 일어설 수 있게 되면, kg당 0.05 mg의 buprenorphine hydrochloride 진통제를 피하 주사하고 멸균 타월이 깔린 홈 케이지로 돌려보냅니다. 수용성 매트릭스 겔을 주입한 쥐의 심장 조직을 절편화한 후, 다양한 시점에서의 조직 총체 분석을 위해 hematoxylin, eosin으로 염색하였습니다. 수술 초기 시점의 주입 부위는 분홍색 섬유 네트워크 형태로 나타나며, 후기 시점에는 간질로 확산된 모습이 관찰됩니다.

2주 후에 세포 유입이 관찰됩니다. 주입된 매트릭스의 분해가 확인됩니다. 만약 주입 전 ECM에 비오틴을 표지했다면, HRP가 결합된 스트렙타비딘으로 비오틴을 염색함으로써 매트릭스 주입 부위 내의 혈관 내성장 및 형성을 더욱 직접적으로 시각화할 수 있습니다.

여기 제시된 슬라이드는 fitzy로 공동 염색되었습니다. 녹색으로 표시된 결합 선택린(selectin)은 내피세포에 결합하며, 적색으로 표시된 항-smooth muscle actin 항체는 평활근 액틴을 나타냅니다. 주입 부위 근처에서 줄기세포 또한 확인될 수 있습니다.

여기서는 C kit에 대한 면역조직화학 염색을 통해 시각화되었습니다. 이 영상을 시청하신 후, 탈세포화된 조직으로부터 가용성 ECM을 제작하고 이를 심장 조직 공학 응용을 위해 in vivo에서 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 본 영상에서는 심낭 조직을 사용하였으나, 모든 조직원 내에서 사용할 수 있도록 이 일반적인 절차를 수정하여 적용할 수 있다는 점을 기억하십시오.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.