Name: 심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 배우세요 심근 조직 공학을 위한 생물학 유래 주사용 재료 제조 방법을. 탈세포화 심막 조직에서 추출한 세포외기질을 가용화하여 쥐 심근에 주사하고, 다공성 섬유성 스캐폴드 형성 및 혈관 세포 침윤을 평가합니다.

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이 연구는 부여 번호 1 - DP2 - OD004309 - 01을 통해 NIH 원장의 새로운 이노 보너스 프로그램, 의학 연구에 대한 NIH 로드맵의 일부에 의해 부분적으로 지원되었다. SBS - N. 대학원 연구 활동에 대한 NSF 감사하고 싶습니다.

1. 사전 처리 조직 준비 <ol class="lalpha"><li> 이 프로토콜을 사용하기 전에, 하나는 이미 선택의 조직을 decellularized 있어야합니다. 이 예를 들어, 신선한 돼지의 인간 심장막 샘플 deionized (DI) 물과 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)에 hypotonic 및 hypertonic rinses를 사용 decellularized 있습니다. </li><li> 특히, 최초 30 분 DI 물에 돼지의 심낭을 씻고, 다음 인산염의 1% SDS에서 지속적으로 저어 호수 (PBS)는 5시간 DI 워터 린스 다음, 24 시간 동안 버퍼. 인간 pericardia 경우, 먼저 하루 DI 린스 다음, 60~65시간 위해 PBS에 1퍼센트 SDS에서 지속적으로 저어 후, 30 분 디 물에 헹굼. 그들의 최종 해결책 '에서 모든 생명체를 제거하고 DI 물 1을 실행 아래에서 다시 린스. </li><li> decellularization를 확인하려면, 10 월 동결 매체에 고정 신선한, 작은 조각을 제거 및 10 μm의 조직 섹션에게 histological 분석을 통해 시험을 위해 샘플을 통해 모든 100 μm의을뿐 이전에 34-36을보고했다. </li><li> 핵의 부재에 대한 조직 검사 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E) 얼룩을 사용합니다. 하나는 또한 H &amp; E 결과를 확인하기 위해 DNA에 대한 형광 Hoescht 33,342 얼룩 (1.0 μg / ML) 사용할 수 있습니다, 짧게, 섹션을 수정 rehydrate하고 물에 씻어 10 분 얼룩 후 잘 씻어 어둠 속에 저장합니다. 또는, 하나는 샘플의 전체 DNA 내용을 계량하기 위해 설계되었습니다 Qiagen DNeasy의 혈액 및 조직 키트, 같은 키트를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 주사용 ECM의 준비 <ol class="lalpha"><li> Lyophilization <ol class="lroman"><li> 적절한 준비 후, 액체 질소 또는 -80 ° C.에 저장하여 decellularized 샘플을 동결 완전히 건조까지 샘플을 Lyophilize. 시스템 및 샘플의 수분에 따라이은 12 72 시간 동안의 어디서든 걸릴 수 있습니다. </li></ol></li><li> 밀링 <ol class="lroman"><li> 일단 완전히 건조 빌리 미니 밀은 좋은 분말로 건조 ECM을 분쇄하는 데 사용됩니다. 귀하의 목적에 적합한 체 크기를 선택,, 여기 40 게이지 메쉬가 사용됩니다. 샘플의 대다수는 필터를 통해왔다되면, 가공된 ECM 가루와 함께 수집 병을 제거하십시오. 단지 작은 샘플이있다면, 예제의 나머지는 다양한 방법에있는 공장에서 추출 수 있으며, 여기 Q - 팁을은 공장의 정지 블레이드 뒤에 붙어 ECM을 제거하는 데 사용됩니다. </li><li> 항상 공장 깨끗하고 파편 무료되어 있는지 확인합니다. 공장과 샘플 모두 완전히 건조되었는지 확인하는 것도 중요합니다, 남아있는 습기가 성공적으로 밀링 방지, 함께 집계 및 클럼프에 ECM을 일으킬 것입니다. ECM은 공기에서 습기를 데리러 수 있으며 그래서 공장에 lyophilizer 직접 이동해야합니다. </li></ol></li><li> 소화 <ol class="lroman"><li> 주사용 ECM을 형성하려면, 분말 펩신을 소화합니다. 다음 프로토콜은 외, Freyetes에서 바뀌었습니다. (2). </li><li> 그것이 생체내 주입되며 오염 합병증을 일으킬 수 있으므로, 가능한 멸균 제품으로 유지하는 것이 중요합니다. 따라서, 멸균 튜브를 사용하고 숟가락의 무게를 사용하기 전에 모든 솔루션을 필터링합니다. 밀링 후 소화하기 전에 lyophilization 단계는 또한 불임을 유지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 적절한 섬광의 약병에 ECM 분말의 원하는 금액을 나가는거야. 1 ML보다 작은 총 볼륨의 경우, 그것은 당신이 2 ML의 약병을 사용하는 것이 좋습니다 그리고 큰 볼륨, 20 ML의 유리병. 이것은 효과적으로 휘몰아 유리병의 바닥에 충분한 액체있다는 것을 보장합니다. </li><li> 섬광의 약병에 펩신의 원하는 금액을 나가는거야. 펩신 1 MG / ML의 농도에 있습니다 그러한 0.1 M HCL을 추가합니다. 이것은 펩신 솔루션을 vortexing하여 감소된 수있는 사용하기 전에 펩신이 완전히 (없음 입자) 해산되어 있는지 확인하십시오. </li><li> ECM 10 MG / ML의 농도에되도록 ECM 가루와 함께 섬광 약병에 펩신 / HCL 솔루션을 추가합니다. </li><li> 주기적으로 무게는 숟가락이나 주걱으로 유리병의 측면을 근근이 살아가고, 60-65시간에 대한 지속적인 솔루션을 저어. </li></ol></li><li> 산도 조정 <ol class="lroman"><li> 이 단계는 생리적 산도에 액체 매트릭스 자료를 가져 더욱 ECM을 cleaving에서 유지, 펩신을 inactivate로 수행됩니다. 다시 Millipore 물로 만든 필터 솔루션을 사용해야합니다. </li><li> 1 M NaOH 1 / 10 원래 볼륨으로 추가됩니다. 이 시점에서 산도를 테스트하고 원하는 PH (7.4)가 도달되는 NaOH 또는 HCL 소량의 (2-10 μl)을 추가합니다. 중화에 대한 추가하거나 산도 테스트 제거된 모든 소량을 확인합니다. 일단 솔루션이 무력화되어, 10X PBS의 최종 볼륨 (1 / 9 현재 볼륨) 10분의 1로 추가할 수 있습니다. 주사용 ECM의 농도를 결정하고 원하는 최종 공동 도달하는 1X PBS를 추가ncentration, 여기를 6 MG / ML. </li><li> 주사용 ECM의 특성은 SDS - PAGE, Blyscan Colorimetric 개그 분석, 그리고 질량 분광 분석법을 통해 할 수 있습니다. </li><li> 이 시점에서, 매트릭스 재료는 심근 조직 공학을위한 발판을 형성 생체내 주입 수 있습니다. </li></ol></li><li> 비오틴 - 라벨링 <ol class="lroman"><li> ECM은 주입 ECM 쉽게 시각화를위한 사출하기 전에 비오틴 태그 수 있습니다. </li><li> 비오틴의 10mM 솔루션을 준비하고 0.3mg/mg의 비율로 주사용 ECM을 추가할 수 있습니다. ECM은 주사에 원하는 농도에 있어야합니다. MG / ML 6 농도에 주입하면, ECM 1 ML 40 μL 비오틴을 추가합니다. 이전 주사로, 적어도 1 시간 동안 얼음에 비오틴 - ECM 솔루션을 유지. </li></ol></li><li> 모든 처리 단계는 실온에서 수행할 수 있습니다. 겔화에서 주사용 행렬을 유지하려면, 산도 조절 단계는 얼음에서 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 심근 주입 <ol class="lalpha"><li> 사출 준비 <ol class="lroman"><li> 여성의 쥐 (225~250g)가 여기에 사용하는 경우, 산도 7.4 주사용 ECM의 75 μL 주사는 0.1 ML 주사기 30 게이지 바늘로 밀고로 준비되었습니다. 남성 쥐 (3백75-4백그램)를 사용했을 경우, 90 μL을 주입 수 있습니다. </li><li> 모든 수술 소모품 전에 수술로 멸균 처리 해야해, 우리가 필요한 모든 도구가 포함되어 있습니다 autoclaved 외과 팩을 사용합니다. </li></ol></li><li> 수술 당일, 할런 스프 라그 - 돌리 쥐가 5 % isoflurane을 사용 anesthetized입니다 검이경을 사용 intubated, 다음 절차를 통해 isoflurane 2.5 %로 유지. </li><li> 건조하고 머리를 방지하기 위해 동물의 눈에 인공 눈물 연고를 추가합니다. 수술하는 동안 보습을위한 Lactated 링거스 솔루션 3 ML을 관리할 수 있습니다. 이것은 낮은 복부 지역에 피하 주사를 통해 수행되어야합니다. </li><li> 팔다리 아래 수술 테이블에 부드럽게 테이프에 위로 향한 위치에 동물을 배치합니다. 복부 사전 문질러에 진공 무료로 머리에 머리카락을 제거하는 면도기를 사용하십시오. </li><li> zyphoid 프로세스에서 복부의 하단 오른쪽에 대각선을 따라 2 % lidocaine 작은 주사 (약 50 μL 각)의 시리즈를 확인합니다. 그렇다면 중간에서 시작 밖으로 이동 betadine로 세 번 씻어. 70 % 에탄올로 반복합니다. 미리 만들어진 원형 창문 외과 드레이프를 사용하여 동물을 커버, 필요한 경우, 타월 클램프로 고정하십시오. </li><li> 번호 10 메스가 xyphoid 프로세스에서 복부의 하단 오른쪽에 3-4센티미터 절개를 사용합니다. xyphoid 프로세스를 찾아 오른쪽에있는 근육을 통해 수직으로 밑에 절개하다, 오른쪽에있는 큰 그릇을 피하기 위해주의하고. 일단 근육을 통해 해부 있고, 다이어프램을 노출, 근육을 통해 옆으로자를 가위를 사용합니다. 간장을 피하기 위해주의하십시오. </li><li> zyphoid 과정을 통해 3-0 Vicrile 봉합의 36 인치 길이 hemostats 한 켤레, 드라이브 바늘을 사용하고 중간을 통해 치료를 가져옵니다. 테이프가 함께 봉합의 종료와 기본적으로 zyphoid을 올려서 및 피임기구를 노출 위에 동물 뒤에 지점 것을 수정. 3-0 Vicrile 봉합사의 또 다른 36 인치 길이로 xyphoid 프로세스에 가장 가까운 근육을 통해 주사 바늘을 유도하고, 다시 완전히 수술 구멍을 노출, 수술 테이블의 오른쪽에있는 다른 지점으로 끝을 이겨낼 및 수정. </li><li> 이 시점에서, 당신은 횡경막을 통해 마음을 볼 수 있어야합니다. 쥐 치아 microforceps의 작은 쌍을 사용하면, 다이아 프램의 중심을 잡으면 당신을 향한 그것을 꺼내와 무딘 가위로 아주 작은 절개를합니다. 그것은 폐 파고 방지하기 위해 매우 무딘 가위를 사용하는 매우 중요합니다. 이 구멍이 만들어되면 폐 당신이 마음을 시각화하기 위해 횡경막을 통해 수직으로 2~3센티미터 절개를 만들 수 있도록 철회합니다. </li><li> 방식의 폐가를 밀어 구멍의 왼쪽에있는 3 인치 Q - 제보를 넣습니다. 장소에 면봉을 넣었을 확보하기 위해 타월 클램프를 사용합니다. pericardial 색을 찾을 수 있도록하는 방법의 우측 폐를 이동하는 다른 Q - 제보를 사용하십시오. microforceps 한 쌍의 대형 톱니 모양의 집게 한 쌍을 사용하여 심장의 꼭대기를 노출, pericardial 색을 통해 눈물. 동물이 이전에 경색의 절차를 거쳐이있다면, 심낭 이미 결석합니다. </li><li> 쥐의 치아 microforceps있는 마음의 꼭대기를 잡고 꼭대기에서 액체 매트릭스 소재 길을 3 분의 1까지 주입. epicardial 표면에 바늘 병렬를 삽입하고 왼쪽에있는 바늘의 beveled 가장자리로 주입. 위대한 심장 정맥을 방지해야합니다. 바늘을 제거하기 전에 몇 초 정도 기다리십시오. 당신이 주사의 사이트에있는 조직의 미백이 나타납니다. </li><li> 구멍에서 혈액을 정리하고 우측 폐를 들고 있던 수건 클램프 및 Q - 제보를 제거합니다. 곡선 microhemostats와 쥐를 사용하여치아가 횡경막을 닫습니다 microforceps. 초기 매듭을 확인 후 지속적인 치료와 테이퍼 바늘로 피임기구를 닫습니다 톱니 모양의 집게와 microhemostats을 사용합니다. 완전히 닫기 전에, PE160 흡입 튜브를 삽입하고 봉합이 강화므로 흉강을 철수 10 ML의 주사기를 사용합니다. </li><li> 적절하게 대피하고 폐쇄하면 횡경막이 오목해야합니다. 볼록 다이어프램은 캐비티에 아직 공기가 있음을 나타냅니다. </li><li> 이 시점에서 isoflurane는 1 %로 거절 수 있습니다. </li><li> 캐비티가 열려 들고 모두 3-0 Vicrile 봉합을 가져가라. Q - 팁 또는 멸균 거즈로 멀리 초과 닦아, 수화 근육에 멸균 물을 사용하십시오. 간헐 봉합과 근육 레이어를 닫습니다 3-0 봉합사의 새 길이를 사용합니다. </li><li> 이 시점에서, isoflurane을 해제할 수 있습니다. </li><li> 클린 무균 물과 피부를 닫습 사용 스테이플 공간. 스테이 플스가 공부를 방해한다면, 5-0 프롤린 봉합사도 사용할 수 있습니다. 이 경우, 간헐적인 봉합으로 피부를 닫습니다 반대로 절단 (RC) 바늘을 사용합니다. 두 경우 모두 폐쇄 절개를 통해 수술 접착제를 현장. </li><li> 트리플 항생제 연고와 절개 사이트를 적셔하는 Q - 팁을 사용하십시오. </li><li> 동물이 100 % 산소 아래에 복구할 수 있습니다. </li><li> 동물 환풍기 주변 호흡을 시작하면, 기관 튜브를 제거합니다. </li><li> 동물 흉골되면 0.05 MG / buprenorphine 하이드로 클로라이드의 kg의 피하 주사를 관리하고 살균 수건 그들의 홈 케이지에게 돌아갑니다. </li><li> 동물 사후 수술 관찰과 치료를 받게해야합니다. </li><li> 관심의 시간 지점에서, 동물은 euthanized되고 마음이 분석을 위해 삭제되었습니다. 짧은 축 크로스 섹션이 촬영되며 총 조직 분석을위한 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E) 물들일 수 있습니다. 짧은 시간 지점에서 주입 지역 interstitially 확산 가진 분홍색, 섬유 네트워크로 나타납니다. 나중에 시간이 지점에서, 하나는 세포의 유입과 2~3주 후 주입 모체의 최종 저하를 준수합니다. ECM을 주입하기 전에 비오틴로 표시된 경우, 그것은 HRP - 복합 streptavidin과 비오틴을 얼룩하여보다 직접적으로 시각하실 수 있습니다. Immunohistochemical 얼룩은 여기 슬라이드가 Alexafluor 보조와 내피 세포와 fluoresces 녹색 및 안티 - 부드러운 근육 굴지 항체에 바인딩 FITC - 복합 isolectin 공동 묻은 있었고, 사출 지역의 특정 셀 또는 구조를 식별하는 데 사용할 수 있습니다 빨간색으로 SMCs보고 항체. </li></ol> 4. 대표 결과 이런식으로 준비 매트릭스 재료의 이전 특성은 macromolecules의 다양한 유지 보여주었다. 특히, 여러 섬유 단백질과 glycoproteins은 질량 분석계 (표 1)를 통해 확인되었습니다. 이 프로토콜에 따라 처리 매트릭스 자료 macromolecules의 복잡한 배열을 포함하지 더 이상 찾을 수있다면, 그것은 고용 decellularization 프로토콜이 너무 거친 것을 수 있습니다. 일단 완전히 동결 건조된, 마른 pericardial ECM은 매우 뻣뻣한, 구겨진 종이처럼 보인다. 다른 조직 유형은 땅콩을 포장 유사합니다. 잘 가공된 경우, ECM은 체를 넘어 져야하고 하단에있는 항아리에 수집합니다. 수분 샘플 거기에 남아있다면, ECM 함께 덩어리를하고 밀링 챔버에 달라 붙 는게 좀 그렇지. 소화 후, ECM 솔루션은 밀키 보이는 색상과 입자의 완전히 자유로워 져야한다. 또한 HCL 혼자보다 약간 더 점성 것입니다. ECM이 잘 소화되지 않는 경우 여전히 병을 큰 입자가있을 것입니다, 또한, ECM은 솔루션의 밖으로 중단될 수 있습니다. 산도 조정 후,이 용액에 눈에 띄는 변화가없는, 그리고 ECM 아직​​도 흐림, 균질 액체이다. 그것이 젤 시작하면, 점도가 증가하고 이것은 주사기로 자료를 세우도록 어렵거나 불가 능할 것이다. 이런 문제가 발생하면, 미리 차게 솔루션으로, 얼음에 산도 조정 단계를 수행합니다. 주사가 준비되고 나면, 사용까지 얼음에 있습니다. 주입이 성공하면, 바늘 끝 주변 지역 whitens과 작은 볼러스가 표시됩니다. 이것이 관찰되지 않으면 주사는 챔버로 대신 벽에 갈 수 있습니다. 주사 후 동물을 suturing 때, 피임주의 폐쇄가 가장 중요한 단계입니다. 제대로하면, 횡경막은 폐에 대해 꽉되며, 오목 나타납니다. 폐 안에 남아있는 공기가있다면, 횡경막은 볼록 유지, 또는 밖으로 풍선 영역을 것입니다. 초기 시점 (4 시간 후 주사 30 분)에서 분사 지역의 조직학을 조사하면, 하나는 이것이 재조 립 매트릭스 재료 후 사출 (그림 2)입니다 세포를 찾아볼 수있는 핑크, 섬유 영역을 볼 수 . 네트워크는 종종 interstitially 펼쳐지는 많은 부분에 걸쳐 나타날 수 있습니다. 포스매트릭스 젤만이 매우 작은 영역을 보는 였는데 설명은 주사의 일부가 교내 목표를 놓치고 중 LV 챔버에 주입 또는 분사 위치를 밖으로 유출 되었기 때문입니다. 또한, 겔화 시간에 따라 중간 확산은 다를 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Polyacrylamide 젤 전기 영동 (PAGE) 결과입니다. (A) 분자 무게 기준. solubilized 인간 (C)와 돼지의 (D) pericardial ECM (7 MG / ML)에 비해 (B) 쥐 꼬리 콜라겐 유형 I (2.5 MG / ML). 콜라겐의 존재뿐만 아니라 다른 여러 가지 단백질과 pericardial 매트릭스 샘플에서 펩티드를 적어 둡니다. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. ECM 구성 요소는 질량 분광로 확인. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 심근 주사 :. 생체내의 겔화 인치 H &amp; E는 인간 (A)와 돼지의의 얼룩 (B) 45 분 후에 생체내에 gelled이 pericardial 매트릭스 주사. 화살표는 매트릭스 위치, myocardium보다 묻은 가벼운 핑크색을 나타냅니다. 스케일 바 500 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 혈관 세포 침투. 주입된 인​​간 (AC)과 이주에서 돼지의 (DF) 매트릭스 젤의 선박에 대한 형광 얼룩. 평활근 세포는 빨간색 (B, E)로 분류하는 동안 내피 세포, 그린 (A, D)로 분류됩니다. 병합된 이미지는 C로 표시되며 F. 스케일 바는 100 μm의집니다. 흰색 점선은 H &amp; 인근 구역의 E 분석에 의해 결정 매트릭스 분사 영역을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 매트릭스 사출 지역 내의 세포를 줄기. Hoescht는 핵에 대한 얼룩 (파란색)과 C - 키트 (녹색)은 (A) 인간과 돼지의 (B) 매트릭스 사출 지역에서 줄기 세포를 식별합니다. 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다.

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동물 사용이 연구의 모든 실험은 캘리포니아, 샌디에고 및 실험실 동물 관리의 인증에 대한 미국 협회의 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 출판 지침에 따라 수행되었다.

이 방법은 심근 조직 공학을위한 생물학 파생, 주사용 공사장 공중 발판의 생성을 허용합니다. 이 방법은 처음 제조를 위해 개발되었고 심근 매트릭스 젤 및 pericardial 매트릭스 젤과 함께 제시의 생체내 시험에서이 프로토콜은 다른 조직과 함께 사용하기 위해 적응 수 있지만, 조직이 적절하게 decellularized 수를 제공했습니다. Decellularization이 수행하고 매트릭스 젤의 DNA의 존재가 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수 있으므로, 사전에 이러한 방법의 사용을 확인해야합니다. 이 자료를 decellularize 다양한 방법이 있으며, 몇 가지 좋은 리뷰는 주제 3, 4에 작성되었습니다. 매트릭스 젤을 준비하는 때, 남아있는 습기가 밀링을 방지하므로 시료가 완전히 동결 건조된 것을 중요합니다. 밀링 때 또한, ECM 분말의 흡입을 방지하기 위해, 항상 얼굴 마스크를 착용하십시오. 마지막으로, 매트릭스 겔은 생체...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;시약:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p6887-1G</td><td>동결건조</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21217</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin-HRP</td><td>Thomas Scientific</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;장비:&lt;/strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiley Mini Mill</td><td>Thomas Scientific</td><td>3383L10</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Lyophilizer</td><td>Labconco Corp.</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;수술 용품:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-154-16</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringers Solution</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>003966</td><td></td></tr><tr><td>KY Jelly</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>28658</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine, 2%</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>17767</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine hydrochloride</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>인공누액 연고</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9860843</td><td></td></tr><tr><td>복합 항생제 연고</td><td>Fisher Scientific</td><td>19082795</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>60307-120-25</td><td></td></tr><tr><td>이경</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>008699</td><td></td></tr><tr><td>스톱콕</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>006245</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicrile 봉합사</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>J327H</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Proline 봉합사</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>s-1173</td><td></td></tr><tr><td>역절삭(RC) 바늘</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8684G</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 지혈鉗</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Rat 치아용 마이크로 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11084-07</td><td></td></tr><tr><td>10번 메스</td><td>Fine Science Tools</td><td>10110-01</td><td></td></tr><tr><td>둔단 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>예리한 곡선 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>대형 톱니 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>PE160 흡입 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>427430</td><td></td></tr><tr><td>클리퍼</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>21608</td><td></td></tr><tr><td>피부 스테이플러/스테이플</td><td>Ethicon Inc.</td><td>PRR35</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;일반 용품:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 M HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 mL 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 접착제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 드레이프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>타월 클램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 휴대용 진공 흡입기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

이 프로토콜은 심근 조직 공학 응용 프로그램을위한 주사용 세포외 매트릭스 (ECM) 젤의 준비를 위해 방법을 제공합니다. 간단히, decellularized 조직은 동결 건조된 가공된, 효소 소화하고 생리 산도로 이동합니다. lyophilization은 작은 공장과 함께 좋은 분말로 지상 수있는 건조 ECM의 결과, 조직의 모든 수분을 제거합니다. 밀링 후, ECM 분말은 주사용 매트릭스를 형성하는 펩신과 소화 수 있습니다. 산도 7.4로 조정 후, 액체 매트릭스 자료는 myocardium에 주입 수 있습니다. 이전 특성화 assays의 결과 decellularized pericardial와 심근 조직에서 생산 매트릭스 젤은 다양한 단백질, 펩티드 및 glycosaminoglycans를 포함한 원시 ECM 구성 요소를 유지하는 것으로 나타났습니다. 조직 공학이 자료의 사용을 감안할 때, 생체내 특성화에 특히 유용합니다, 여기에, 왼쪽 심실로 교내 주사를 수행하기위한 방법 (LV) 무료 벽이있는 매트릭스 젤에 대한 호스트 응답을 분석하는 수단으로 제공됩니다 작은 동물 모델. 흉강에 대한 액세스가 격막을 통해 얻은이며 주사는 약간 LV 무료 벽 꼭대기 위에 이루어집니다. 생물 학적 파생된 발판이 주입하기 전에 비오틴 - 라벨로 시각하고 다음 기다려봐 퍼옥시데이즈 - 복합 neutravidin과 조직 섹션을 얼룩하고 diaminobenzidine (DAB) 얼룩을 통해 시각화 수 있습니다. 사출 지역의 분석도 histological과 immunohistochemical 얼룩과 함께 할 수 있습니다. 이런 방식으로, 이전에 검사 pericardial 및 심근 매트릭스 젤은 섬유, 다공성 네트워크를 형성하고 사출 지역 내의 혈관 형성을 촉진하기 위해 표시되었습니다.

decellularized 조직에서 주사용 매트릭스 젤을 준비하고 밀고 myocardium에 주입을위한 방법<em&gt; 생체내에</em&gt; 설명되어 있습니다.

본 프로토콜은 심근 조직 공학 응용을 위한 주입 가능한 세포외 기질(ECM) 겔의 제조 방법을 제공합니다.

탈세포화된 심낭 및 심근 조직으로 제조된 매트릭스 겔은 다양한 단백질, 펩타이드 및 글리코사미노글리칸을 포함한 천연 세포외 기질 성분을 유지합니다. 이러한 조직 매트릭스는 조직 공학에 활용될 수 있습니다. 본 영상에서는 심낭 조직을 탈세포화하여 무세포 세포외 기질을 생성함으로써 매트릭스 겔을 제작하는 과정을 보여줍니다.이후 세포외 기질을 처리하여 가용성 액체 형태로 제작합니다. 다음으로, 가용화된 기질을 소동물 모델에 테스트하여 주입 가능한 지지체로서의 타당성을 확인합니다. 조직학 및 면역조직화학 분석 결과, 생체 내에서 주입된 물질이 혈관 세포의 침투를 가능하게 하는 다공성 섬유 지지체를 형성함이 입증되었습니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스의 Karen Chrisman 박사님 연구실에서 공부하고 있는 대학원생 Sonia Zeki입니다. 오늘은 탈세포화된 조직으로부터 가용화된 ECM을 제작하고, 이를 심장 조직 공학 응용 분야에 적용하여 in vivo 테스트를 수행하는 방법을 시연하겠습니다.이러한 기술들은 심부전 치료를 위한 주입형 바이오 소재 치료제 개발에 있어 매우 중요합니다. 심근경색 후의 수술 절차를 저희 실험실의 수의 신경외과 전문의인 Pam shoot McGuffin이 시연하겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.먼저 조직을 탈세포화하여 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)만 남기는 과정으로 이 프로토콜을 시작합니다. 돼지 심낭을 탈이온수 비커에 넣고 실온에서 30분 동안 교반하여 세척합니다. 세척 후, 1% SDS와 1% penicillin streptomycin이 포함된 1배 PBS에 조직을 넣고 실온에서 24시간 동안 계속해서 교반합니다. 다음 날, 조직을 다시 탈이온수에 넣고 5시간 동안 계속 교반하며, 거품이 모두 사라질 때까지 50 mL 튜브에 넣어 흔들어 줍니다.헤마틴-에오신 염색을 통해 탈세포화된 조직에 핵이 없음을 확인해야 합니다. 탈세포화된 조직의 나머지 부분을 15~50 mL 원심분리관에 넣습니다. 그 다음, 조직을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.매우 낮은 압력과 매우 낮은 온도에서 동결 건조하여 냉동 시료를 완전히 건조될 때까지 동결 건조하십시오. 사용하는 시스템과 시료의 수분 함량에 따라 12시간에서 72시간 정도 소요될 수 있습니다. 탈세포화된 조직이 완전히 건조되면, 이를 Wiley Minim mill로 옮기십시오.40 게이지 메쉬를 설치하고 조직을 갈아 고운 분말로 만듭니다. 샘플의 대부분이 필터를 통과하면 수집 용기를 제거합니다. 이 샘플을 이제 세포외 기질 또는 ECM 분말이라고 합니다.다음 단계로 즉시 진행하지 않는 경우, 이 시점에서 두 번째 동결건조 단계를 수행할 수 있습니다. 이는 ECM을 가용화하기 위해 기록된 무게의 정확성을 보장하기 위함입니다. 멸균된 vial에 원하는 양의 ECM 분말을 정량하여 잽니다.1 mg/mL 농도의 멸균 여과된 염화수소 용액을 ECM 분말이 들어 있는 신틸레이션 바이알에 첨가하여 ECM 농도가 10 mg/mL가 되도록 합니다. 마그네틱 바를 넣고 바이알을 교반기에 올립니다.멸균된 WHE 스푼이나 스패튤라로 바이알 벽면을 주기적으로 긁어내며 48~60시간 동안 계속 교반하십시오. 이는 모든 ECM 분말이 완전히 소화되도록 하기 위함입니다. ECM이 소화됨에 따라 용액 상태로 녹아들어 갈 것입니다.ECM이 가용화되면 샘플을 얼음에 두고 수산화나트륨과 염산을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. pH 조정이 완료되면, 용액의 최종 염 농도가 1배 PBS가 되도록 10배 PBS를 첨가합니다. 예를 들어, ECM 용액이 900 µL인 경우, pH 조정 후 100 µL의 10배 PBS를 첨가해야 합니다.중화를 위해 첨가한 부피와 pH 테스트를 위해 제거한 부피를 합산하여 가용화된 ECM 용액의 농도를 결정하십시오. 그런 다음, 원하는 최종 농도인 6 mg/mL에 도달하도록 1× PBS를 추가하십시오.수술 당일에 가용화된 ECM 75 µL를 30 gauge 바늘이 장착된 0.1 mL 주사기에 준비합니다. 기관 삽관을 마친 암컷 Harlan dolly 쥐에게 2.5% isoflurane을 투여하여 마취 상태를 유지합니다. 그 다음, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마취 상태를 확인합니다.수분 공급을 위해 하복부에 락테이트 링거액 3 mL를 피하 주사합니다. 다음으로, 동물을 수술대 위에 앙와위로 눕히고 사지를 테이프로 부드럽게 고정합니다. 클리퍼를 사용하여 복부의 털을 제거하고, 떨어진 털은 진공청소기로 흡입하여 제거합니다.검상돌기부터 복부 우하측까지 대각선을 따라 2% lidocaine을 50 µL씩 연속적으로 주입합니다. 그다음 Betadine을 사용하여 중앙에서 바깥쪽으로 세 번 문질러 소독합니다. isopropyl alcohol을 사용하여 동일하게 소독 과정을 반복합니다.그런 다음 미리 원형 창이 만들어진 수술용 드레이프로 동물을 덮습니다. 수술용 드레이프로 고정합니다. 10번 메스를 사용하여검상돌기부터 복부 오른쪽 하단까지 3~4 cm 길이로 절개합니다. 검상돌기의 위치를 확인하고 근육을 통해 오른쪽으로 수직으로 절개하며, 이때 오른쪽에 있는 큰 혈관이 손상되지 않도록 주의합니다. 그다음, 가위를 사용하여 근육을 가로 방향으로 절개하여 횡격막을 노출시킵니다.36인치 길이의 3-0 Vicryl 봉합사와 지혈집게(hemostats)를 사용하여 간을 건드리지 않도록 주의하십시오. 바늘 하나를 검상돌기(xiphoid process)에 통과시킨 후 봉합사를 절반 정도 끌어당깁니다. 봉합사 끝부분을 서로 테이프로 붙여 동물 위쪽 뒤편의 한 지점에 고정하고, 다른 36인치 길이의 3-0 Vicryl 봉합사로 검상돌기를 들어 올려 횡격막을 노출시킵니다.검상돌기와 가장 가까운 근육을 통해 바늘을 찌른 다음, 다시 바늘을 끌어내어 수술대 오른쪽의 다른 지점에 고정함으로써 수술강을 완전히 노출시킵니다. 다음으로, 작은 쥐치아 미세포셉(rat tooth micro forceps)을 사용하여 횡격막의 중앙을 잡고 밖으로 당긴 후, 둔탁한 가위(blunt scissors)로 매우 작은 절개를 가합니다. 이 구멍이 만들어지면 폐가 수축하며 뒤로 물러나게 됩니다.심장을 관찰하기 위해 횡격막을 통해 2~3cm 길이로 수직 절개합니다. 그런 다음 강 공동의 왼쪽에 3인치 면봉을 삽입하여 폐를 밀어냅니다. 타월 클램프를 사용하여 면봉을 제자리에 고정합니다.다른 면봉을 사용하여 우폐를 옆으로 밀어 심낭을 찾습니다. 그다음 마이크로 포셉과 대형 세레이티드 포셉을 사용하여 심낭을 찢어 심장 첨부를 노출시킵니다. 우측 치상 마이크로 포셉으로 심장 첨부를 잡고, 바늘의 사면이 왼쪽을 향하도록 삽입하여 용해된 매트릭스를 주입합니다.심첨부에서 심외막 표면과 평행하게 상단 1/3 지점에 위치시킵니다. 이때 대심장정맥을 피하도록 주의하십시오. 가용화된 매트릭스 겔을 주입하고, 바늘을 제거하기 전 몇 초 동안 기다립니다.주사 부위의 조직이 하얗게 변해야 하며, 체강 내의 혈액을 면봉으로 닦아냅니다. 이후 곡선형 미세 지혈鉗(curved micro hemostats)을 사용하여 오른쪽 폐를 고정하고 있던 타월 클램프와 면봉을 제거하고, 30인치 길이의 5-0 proline 봉합사로 첫 매듭을 짓습니다. 그런 다음 쥐 치과용 미세 포셉(rat tooth micro forceps)과 테이퍼 바늘(tapered needle)을 사용하여 횡격막을 연속 봉합으로 완전히 닫습니다. PE 1 60 흡입 튜브를 삽입하고 10밀리리터 주사기를 사용하여 흉강을 비우면서 튜브 주변을 봉합하여 닫습니다.봉합사를 조이면 횡격막이 오목해져야 합니다. 플루오린 얼음을 1%로 낮추십시오. 강강을 열어두고 있던 세 개의 3-0 Vicryl 봉합사를 모두 제거합니다. 근육에 수분을 공급하고 면봉이나 멸균 거즈로 과도한 수분을 닦아냅니다.새로운 3-0 봉합사를 사용하여 간헐 봉합으로 근육층을 폐쇄합니다. 그 후 isoflurane 공급을 중단합니다. 해당 부위를 세척하고 스테이플러를 사용하여 피부를 봉합합니다.그런 다음 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 도포하십시오. 100% oxygen 하에서 쥐가 회복되도록 합니다. 동물이 인공호흡기 주변에서 자가 호흡을 시작하면 기관 튜브를 제거하십시오.동물이 의식을 회복하여 다시 일어설 수 있게 되면, kg당 0.05 mg의 buprenorphine hydrochloride 진통제를 피하 주사하고 멸균 타월이 깔린 홈 케이지로 돌려보냅니다. 수용성 매트릭스 겔을 주입한 쥐의 심장 조직을 절편화한 후, 다양한 시점에서의 조직 총체 분석을 위해 hematoxylin, eosin으로 염색하였습니다. 수술 초기 시점의 주입 부위는 분홍색 섬유 네트워크 형태로 나타나며, 후기 시점에는 간질로 확산된 모습이 관찰됩니다.2주 후에 세포 유입이 관찰됩니다. 주입된 매트릭스의 분해가 확인됩니다. 만약 주입 전 ECM에 비오틴을 표지했다면, HRP가 결합된 스트렙타비딘으로 비오틴을 염색함으로써 매트릭스 주입 부위 내의 혈관 내성장 및 형성을 더욱 직접적으로 시각화할 수 있습니다.여기 제시된 슬라이드는 fitzy로 공동 염색되었습니다. 녹색으로 표시된 결합 선택린(selectin)은 내피세포에 결합하며, 적색으로 표시된 항-smooth muscle actin 항체는 평활근 액틴을 나타냅니다. 주입 부위 근처에서 줄기세포 또한 확인될 수 있습니다.여기서는 C kit에 대한 면역조직화학 염색을 통해 시각화되었습니다. 이 영상을 시청하신 후, 탈세포화된 조직으로부터 가용성 ECM을 제작하고 이를 심장 조직 공학 응용을 위해 in vivo에서 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 본 영상에서는 심낭 조직을 사용하였으나, 모든 조직원 내에서 사용할 수 있도록 이 일반적인 절차를 수정하여 적용할 수 있다는 점을 기억하십시오.시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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Myogenic 엔지니어링된 조직 구조의 제작

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

이 프로토콜은 하이드로겔 시스템과 피브린 기반 접착제를 사용하여 심근 경색의 줄기 세포 치료를 위한 불량한 세포 생착의 한계를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 사용하면 경색 후 세포와 조직의 접촉을 유지할 수 있어 손상 부위에서 유익한 제제의 치료 잠재력을 높일 수 있습니다.

하이드로 겔은 구축 및 쥐 심근 경색 모델에서 치료를 제공하기 위해 접착제 접근을 섬유소 기반.

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

줄기 세포 기지를 둔 치료는 심근 경색 후에 부상당한 심장 조직을 복구하는 능률적인 전략으로 부상했습니다. 우리는 효소적으로 교차 연결 될 수있는 젤라틴 하이드로 겔을 사용하여 줄기 세포 이식에 대한 최적의 생체 내 응용 프로그램을 제공합니다.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

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