심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조
2010년 12월 20일
decellularized 조직에서 주사용 매트릭스 젤을 준비하고 밀고 myocardium에 주입을위한 방법 생체내에 설명되어 있습니다.
탈세포화된 조직, 심낭 및 심근 조직에서 생산된 기질 겔은 다양한 단백질, 펩타이드 및 글리코사미노글리칸을 포함한 천연 세포 외 기질 구성 요소를 유지합니다. 이러한 조직 매트릭스는 조직 공학에 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서 기질 겔은 무세포 세포외 기질을 생성하기 위해 심낭 조직을 탈세포화하여 제작됩니다.
그런 다음 세포외 기질을 처리하여 가용화된 액체 버전을 만듭니다. 다음으로, 가용화 매트릭스를 작은 동물 모델에서 테스트하여 주사 가능한 골격으로서의 타당성을 결정합니다. 조직학적 및 면역조직화학적 분석은 생체 내에서 주입된 물질이 혈관 세포 침투를 허용하는 다공성 섬유 골격을 형성한다는 것을 보여줍니다.
안녕하세요, 제 이름은 소니아 제키입니다. 저는 캘리포니아 대학교 샌디에이고의 카렌 크리스먼 박사 연구실에서 재직 중인 대학원생입니다. 오늘 우리는 탈세포화된 조직으로부터 용해된 ECM을 제작하고 심장 조직 공학 응용 분야를 위한 생체 내 테스트를 시연할 것입니다.
이러한 기술은 심부전 치료를 위한 주사 가능한 생체 재료 요법의 개발에 중요합니다. 수술 절차를 보여주는 심근 경색 후 Pam, shoot McGuffin, 우리 실험실의 수의학 신경 외과 의사. 시작하겠습니다.
조직을 탈세포화하여 세포외 기질 또는 ECM만 남기고 먼저 돼지 심낭을 탈이온수 비커에 넣고 실온에서 30분 동안 저어 세척하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 세척 후 1% SDS와 1% 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 PBS에 조직을 넣고 실온에서 24시간 동안 계속 교반합니다. 다음날 조직을 탈이온수에 다시 넣고 5시간 동안 계속 저어주고 모든 거품이 사라질 때까지 50ml 튜브를 흔듭니다.
Hematin 및 eoin 염색은 탈세포화된 조직에 핵이 없음을 나타내야 합니다. 탈세포화된 조직의 나머지 부분을 15-50밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 조직을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다.
완전히 건조될 때까지 매우 낮은 압력과 매우 낮은 온도에서 동결 건조하여 냉동 샘플을 동결 건조합니다. 사용된 시스템과 샘플의 수분 함량에 따라 12시간에서 72시간까지 소요될 수 있습니다. 탈세포화된 조직이 완전히 건조되면 Wiley Minim mill로 옮깁니다.
40 게이지 메쉬로 설정하고 조직을 미세한 가루로 갈아냅니다. 대부분의 샘플이 필터를 통과하면 수집 용기를 제거합니다. 이 샘플은 이제 세포외 기질 또는 ECM 분말이라고 합니다.
제2 동결건조 단계는 다음 단계로 바로 진행하지 않는 경우, 이때 수행될 수 있다. 이는 ECM을 용해시키기 위해 기록된 중량의 정확성을 보장합니다. 원하는 양의 ECM 분말을 멸균 바이알에 넣습니다.
밀리리터당 1밀리그램을 함유한 멸균 여과된 염화수소 용액을 추가합니다. ECM 분말과 함께 섬광 바이알에 Pepcid를 넣어 ECM의 농도가 밀리리터당 10밀리그램이 되도록 합니다. 교반 막대를 추가하고 교반 플레이트에 바이알을 놓습니다.
48-60시간 동안 계속 저어주고 멸균된 WHE 숟가락이나 주걱으로 주기적으로 바이알의 측면을 긁어냅니다. 모든 ECM 분말의 소화를 보장하기 위해. ECM이 소화되면 용액으로 들어갑니다.
ECM이 용해되면 샘플을 얼음 위에 놓고 수산화나트륨과 염산을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. pH가 조정되면 용액의 최종 분류 농도가 PBS의 1배가 되도록 PBS의 10배를 추가합니다. 예를 들어, 900마이크로리터의 ECM 용액이 있는 경우 pH 조정 후 PBS의 10배인 100마이크로리터를 추가해야 합니다.
pH를 테스트하기 위해 중화하기 위해 추가된 부피와 제거된 부피를 집계하여 용해된 ECM 용액의 농도를 측정합니다. 그런 다음 여기에서 원하는 최종 농도에 도달하기 위해 PBS를 1회 첨가합니다. 밀리리터당 6밀리그램.
수술 당일, 30게이지 바늘이 달린 0.1ml 주사기에 75마이크로리터의 가용화된 ECM 주사를 준비합니다. 2.5%의 불소가 함유된 삽관된 암컷 Harlan dolly 쥐의 마취를 유지하십시오. 눈을 추가한 다음 발가락 꼬집기를 수행하여 마취를 확인합니다.
수분 공급을 위해 하복부에 피하 주사로 3ml의 젖산 링거 용액을 투여합니다. 다음으로, 동물을 수술대에 누운 자세로 눕히고 팔다리를 부드럽게 테이프로 감습니다. 이발기를 사용하여 복부의 털을 제거하고 깨끗한 머리카락을 진공 청소기로 청소합니다.
xiphoid 과정에서 복부의 오른쪽 하단까지 대각선을 따라 2% 리도카인을 50마이크로리터 연속 주사합니다. 그런 다음 Betadine이 중간에서 시작하여 바깥쪽으로 이동하면서 세 번 문지릅니다. isop 프로파일 알코올로 스크러빙을 반복합니다.
그런 다음 미리 만들어진 원형 창문이 있는 수술용 드레이프를 사용하여 동물을 덮습니다. 수술용 드레이프로 고정합니다. 숫자 10 메스를 사용합니다.
시포이드 돌기에서 복부의 오른쪽 아래까지 3-4cm를 절개합니다. xiphoid process를 찾아 오른쪽에 있는 큰 혈관을 피하도록 주의하면서 오른쪽 근육을 통해 수직으로 해부합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 횡격막을 노출시키는 근육을 옆으로 자릅니다.
36인치 길이의 3개의 제로 Vicryl 봉합사와 한 쌍의 지혈제를 사용하여 간을 피하도록 주의하십시오. xiphoid 과정을 통해 하나의 바늘을 삽입하고 봉합사를 중간에 당깁니다. 봉합사의 끝을 함께 테이프로 붙이고 동물 위와 뒤의 지점에 고정하고 xipoid를 들어 올리고 36인치 길이의 3개의 제로 Vicryl 봉합사로 다이어프램을 노출시킵니다.
xiphoid process에 가장 가까운 근육을 통해 바늘을 밀어 넣고 다시 끝을 수술대 오른쪽의 다른 지점으로 당겨 고정하여 수술강을 완전히 노출시킵니다. 그런 다음 작은 쥐 이빨 마이크로 집게를 사용하여 횡격막의 중심을 잡고 당겨 빼낸 다음 뭉툭한 가위로 아주 작게 절개합니다. 이 구멍이 생기면 폐가 수축합니다.
횡격막을 통해 수직으로 2-3cm 절개를 만들어 심장을 시각화합니다. 그런 다음 구멍 왼쪽에 3인치 면봉을 삽입하고 폐를 밖으로 밀어냅니다. 수건 cl을 사용하여 면봉을 제자리에 고정합니다.amp.
다른 면봉을 사용하여 오른쪽 폐를 바깥쪽으로 움직여 심낭 자루를 찾습니다. 그런 다음 한 쌍의 마이크로 집게와 한 쌍의 큰 톱니 모양의 집게를 사용하여 심낭 자루를 찢어 심장의 정점을 드러냅니다. 오른쪽 치아 마이크로 집게로 심장의 정점을 잡고 바늘을 삽입하여 가용성 매트릭스 비스듬한 가장자리를 왼쪽으로 주입합니다.
심외막 표면과 평행한 정점에서 위로 3분의 1 정도입니다. 대심장 정맥을 피해야 한다. 가용화 된 매트릭스 젤을 주입하고 바늘을 제거하기 전에 몇 초 동안 기다립니다.
조직은 주사 부위에서 하얗게 변해야 하고, 구멍에서 혈액을 면봉으로 닦아내고, 구부러진 미세 지혈기를 사용하여 오른쪽 폐를 잡고 있는 수건 클램프와 면봉을 제거하고, 30인치 길이의 5개의 제로 프롤린 봉합사로 초기 매듭을 만들어야 합니다. 그런 다음 쥐 이빨 마이크로 집게를 사용하여 완전히 닫히기 전에 연속 봉합사와 테이퍼 바늘로 횡격막을 닫습니다. PE one 60 흡입 튜브를 삽입하고 10ml 주사기를 사용하여 흉강을 비웁니다.
봉합사가 조여질 때 다이어프램은 오목해야 합니다. 불소 얼음을 1%로 낮추십시오.캐비티를 열고 있는 세 개의 제로 Vicryl 봉합사를 모두 꺼냅니다. 근육에 수분을 공급하고 면봉이나 멸균 거즈로 여분의 근육을 닦아냅니다.
간헐적 봉합사로 근육층을 봉합하기 위해 새로운 길이의 3 제로 봉합사를 사용합니다. 그런 다음 불소를 끕니다. 해당 부위를 청소하고 스테이플을 사용하여 피부를 닫습니다.
그런 다음 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 바릅니다. 쥐가 100% 산소 미만에서 회복되도록 합니다. 동물이 인공호흡기 주변에서 숨을 쉬기 시작하면 기관관을 제거합니다.
동물이 다시 일어서면 부프레노르핀 염산염 진통제 1kg당 0.05mg을 피하 주사하고 멸균 수건에 담아 가정용 케이지로 되돌려 놓습니다. 용해성 매트릭스 겔을 주입한 쥐의 심장 조직을 절편하고 hemat, toin 및 eoin으로 염색하여 다양한 시점에서 총 조직 분석을 수행했습니다. 초기 시점에서의 수술 후, 주입된 부위는 나중에 틈새가 퍼진 분홍색 섬유질 네트워크로 나타납니다.
세포 유입은 2주 후에 관찰됩니다. 주입된 매트릭스의 열화가 보입니다. 주입하기 전에 ECM을 비오틴으로 라벨링한 경우, HRP 복합 스트렙타비딘으로 비오틴을 염색하여 기질 주입 영역의 혈관 성장 및 형성을 시각화하여 보다 직접적으로 시각화할 수 있습니다.
여기의 슬라이드는 fitzy로 공동 염색되었습니다. Conjugated는 녹색으로 표시된 내피 세포에 결합하는 selectin과 antis 평활근입니다. 적색 줄기 세포에 나타나는 액틴 항체는 주사 부위 근처에서도 확인할 수 있습니다.
여기에서는 C 키트에 대한 면역조직화학 염색으로 시각화되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 탈세포화된 조직에서 가용화된 ECM을 생성하고 심장 조직 공학 응용 분야를 위해 생체 내에서 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리가 심낭 조직을 사용하는 동안, 이 일반적인 절차는 수정되어야 하며, 모든 조직 공급원과 함께 사용되어야 한다는 것을 잊지 마십시오.
지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 기사는 탈세포화 조직으로부터 주사 가능한 매트릭스 젤의 준비 및 생쥐 심근 내 in vivo 응용에 대해 설명합니다. 본 연구는 조직 공학에 중요한 매트릭스 젤 내 천연 세포외 매트릭스 성분의 유지를 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 조직 공학
- 심혈관 연구
- 재생 의학
배경
- 탈세포화 조직은 필수 세포외 매트릭스 성분을 유지합니다.
- 매트릭스 젤은 조직 재생을 위한 스캐폴드로 기능할 수 있습니다.
- 이러한 젤의 특성을 이해하는 것은 in vivo 응용에 중요합니다.
- 이전 연구에서는 조직 재생을 촉진하는 무세포 매트릭스의 잠재력을 보여주었습니다.
연구 목적
- 탈세포화 심장낭 조직으로부터 매트릭스 젤을 제조합니다.
- 이러한 젤의 주사 가능한 스캐폴드로서의 타당성을 평가합니다.
- 소형 동물 모델에서 주사된 물질의 in vivo 거동을 평가합니다.
사용된 방법
- 무세포 세포외 매트릭스를 생성하기 위한 심장낭 조직의 탈세포화.
- 세포외 매트릭스를 용해된 액체 형태로 처리합니다.
- 용해된 매트릭스를 생쥐 심근으로 주사합니다.
- 스캐폴드 특성을 평가하기 위한 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 합니다.
주요 결과
- 주사된 물질은 in vivo에서 다공성 섬유질 스캐폴드를 형성했습니다.
- 스캐폴드 내에 혈관 세포 침윤이 관찰되었습니다.
- 매트릭스 젤은 주요 세포외 매트릭스 성분을 유지했습니다.
- 이 연구는 매트릭스 젤이 조직 공학 스캐폴드로서의 잠재력을 보여주었습니다.
결론
- 탈세포화 조직으로부터의 매트릭스 젤은 심장 응용에 유망합니다.
- in vivo 연구는 주사 가능한 스캐폴드로서의 사용을 지지합니다.
- 임상 응용을 위한 특성을 최적화하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables the generation of injectable extracellular matrix (ECM) scaffolds from decellularized tissue for myocardial tissue engineering, addressing the need for biomaterials that support vascularization and tissue integration post-infarction. The method provides a reproducible workflow to produce solubilized ECM gels that retain native protein and glycosaminoglycan content, facilitating preclinical evaluation of scaffold-host interactions in vivo. By enabling intramural injection and histological tracking in rodent models, the approach supports mechanistic de-risking of ECM-based therapeutics in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ECM-mediated host responses and vascular infiltration in a physiologically relevant cardiac microenvironment.
- Operational Value: Provides a standardized, tissue-derived scaffold system for consistent in vivo testing across study groups.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histological outputs such as fibrous network formation and vessel ingrowth for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined injection volumes, pH-adjusted solubilization, and biotin-labeling for detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from acellular ECM production to in vivo scaffold persistence and host tissue remodeling.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of degradation, cellular infiltration, and vascularization at defined time points post-injection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by providing a biologically derived scaffold for early-stage validation of ECM-based therapeutics prior to lead optimization and preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding ECM composition effects on cellular infiltration and tissue integration.
- Screening: Enables reproducible preparation of injectable gels for side-by-side comparison of tissue sources or processing variables.
- Analytics: Generates histological and immunohistochemical readouts (e.g., DAB staining, CD31, α-SMA) to quantify vascular and fibrous tissue formation.
- Translational Research: Connects biomaterial properties to functional outcomes like vessel formation, supporting translational biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-compatible workflow adaptable to multiple tissue sources (e.g., pericardial, myocardial) for broad application in cardiovascular regenerative medicine.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by demonstrating retention of native ECM components and promotion of vascular network formation in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization, lyophilization, enzymatic digestion, and pH adjustment steps.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing early evidence of scaffold biocompatibility and tissue integration capacity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ECM-based candidates based on histological validation of fibrous porosity and vascular infiltration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile processing, and small animal surgical techniques.
- Dependent on lyophilization equipment, precision mills for powder generation, and pH-controlled digestion systems.
- Necessitates standardized histology and immunohistochemistry infrastructure for consistent scaffold visualization and analysis.
- Adaptation across tissue sources requires validation of ECM retention and solubilization efficiency.
- Practical limitations include variability in decellularization completeness and potential batch-to-batch differences in ECM yield.
