새 Coculture 방법을 사용 액슨 성장에 대한 연구 Glial 세포 이질 영향

이 절차의 전반적인 목표는 글리아 세포의 이질성이 DRG 축삭 성장 및 세포 분산에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 신생 쥐 피질에서 글리아 세포를 분리합니다. 절차의 두 번째 단계는 쥐 배아 DRG 뉴런을 배양하고 정제하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 정제된 DRG 뉴런을 글리아 세포 위에 추가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포 축삭의 돌기 성장을 관찰하고 세포 염색 및 정량 분석을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 결과물을 얻을 수 있습니다.

타임랩스 기록과 면역형광 현미경 분석을 통해 DRG 뉴런의 성장이 불균질한 글리아 세포에 의해 영향을 받는다는 것을 보여드립니다. 안녕하세요, 저는 UCRA 신경과 신경 영상 연구실 소속입니다. 오늘은 새로운 뉴런 배양법을 통해 글리아 세포의 불균질한 영향이 성장에 미치는 영향을 연구하는 절차를 소개해 드리겠습니다.

저희 연구실에서는 뉴런과 glia 세포 사이의 상호작용을 연구하기 위해 이 새로운 방법을 사용합니다. 이제 실험을 진행해 보겠습니다. glia 세포와 후근신경절 뉴런(DRGs)의 공동 배양을 구축하기 위해, 먼저 조직 배양 후드 내에서 glia 세포를 배양하는 것부터 시작합니다. 멸균된 24웰 배양 플레이트 바닥에 멸균된 원형 유리 커버슬립을 배치하고, 6웰 배양 플레이트의 웰 내 커버슬립을 polylysine으로 코팅한 후 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

커버슬립과 배양 플레이트를 증류수로 2회 세척한 후 공기 중에서 건조합니다. 다음으로, 24웰 플레이트 또는 6웰 플레이트의 각 웰에 각각 200 µL 또는 2 mL의 dcos modified eagles medium 또는 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 DMEM을 피펫으로 분주합니다. 다음 날까지 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.

양압 층류 해부 후드를 멸균합니다. UV 램프를 20분 동안 켜둔 다음, 후드 내부의 모든 표면을 70% ethanol로 분무하고 사용 전 15분 동안 기다립니다. 저온 마취시킨 P2에서 P6 단계의 쥐 새끼 두 마리의 머리 부분부터 시작합니다.

그 다음 수술용 가위로 후두공 기저부를 절단하여 머리를 분리합니다. 아이리스 가위를 사용하여 시상봉합선을 따라 두개골을 열고 이를 벗겨냅니다. 전뇌를 제거하여 냉각된 levo wit's L 15 용액에 넣고, 두 번째 머리에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다.

그 후 실체 현미경 하에서 작업을 진행합니다. 뇌를 덮고 있는 경막과 피어 막(peer membranes) 및 혈관들을 조심스럽게 제거합니다. 피질을 분리하고 L 15 배지로 여러 번 세척합니다.

미세수술용 가위를 사용하여 피질을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 0.125% trypsin-EDTA가 포함된 L 15 배지에서 37 °C로 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 조직 블록을 20% FBS가 포함된 DMEM 20 mL가 들어 있는 50 mL 튜브로 옮깁니다.

DS를 최종 농도가 10 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 그다음 화염 멸균한 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 용액을 약 20회 교반하여 세포를 분리합니다. 마지막으로 10% FBS가 포함된 DMEM으로 세포를 1회 세척하고, 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

그 다음 세포를 cm²당 5,000~10,000개 밀도로 분주하고 37°C, 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다. DRG를 분리, 정제 및 배양하기 위해 일주일에 두 번 배지를 교체합니다. 먼저 앞서 설명한 대로 폴리리신(polylysine)이 코팅된 유리 커버슬립을 사용하여 24웰 플레이트를 준비합니다.

각 커버스립에 100 µL의 NVF 배지를 넣고 다음 날까지 37 °C에서 플레이트를 배양합니다. 이전과 동일하게 양압 흄후드를 멸균합니다. 그런 다음, 이산화탄소로 안락사시킨 임신한 쥐의 자궁에서 분리한 E 12에서 E 15 단계의 쥐 배아를 실체 현미경 하에서 준비합니다.

연결된 등쪽뿌리신경절(dorsal root ganglia)이 포함된 척수를 분리하여 냉각된 L 15 배지가 담긴 35mm 디쉬로 옮깁니다. 미세수술용 핀셋을 사용하여, 등쪽뿌리신경절(DRGs)이 손상되지 않도록 척수로부터 연결된 DRGs를 냉각된 L 15 배지 내에서 조심스럽게 박리하고 연결된 축삭을 절단합니다.

척수에서 모든 DRG를 분리했을 때, 일반적으로 척수 하나당 20~30개의 DRG가 분리됩니다. 분리된 모든 DRG를 0.125% trips in EDTA에 넣고 37°C, 5% CO2 조건에서 20분 동안 배양합니다. 20% FBS가 함유된 DMEM으로 세포를 한 번 세척한 후, DNAs를 첨가하고 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 글리아 세포(glial cells) 때와 같이 균일한 세포 현탁액이 되도록 여러 번 피펫팅합니다. MBF 배지로 2차 세척을 수행하고 세포 수를 측정합니다. 그런 다음, 준비된 24웰 플레이트의 커버슬립에 웰당 5,000개의 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양하여 DRG 뉴런을 정제합니다.

파종 후 18~24시간이 지나면, 20 µM 5-fluoro-2'-deoxyuridine이 함유된 neuro basal medium으로 배지를 교체합니다. 72시간 후, 배지의 절반을 FUDR이 없는 neuro basal medium으로 교체합니다.

그 후 배지를 격일로 교체합니다. 글리아 세포를 파종하고 약 20일이 지나면, 세포들이 합류(confluence) 상태에 도달하며, 두 세포 유형을 결합하기 24시간 전에 뉴런과 공동 배양할 준비가 됩니다.

글리아 세포 배지를 MBF 배지로 교체합니다. 이전에 설명한 대로 정제된 DRG의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포 밀도를 측정합니다.

그 다음, 뉴런을 제곱센티미터당 500개의 세포 밀도로 글리아 세포 위에 파종합니다. 글리아 세포 상의 뉴런 부착 및 신경突起 성장은 이미지 분석 소프트웨어와 세포 유형 특이적 항체를 이용한 면역화학법을 통해 다양한 시점에서 분석할 수 있습니다. 여기 글리아 세포와 DRG 뉴런을 각각 단독 배양했을 때와 공동 배양했을 때의 예시가 있으며, 글리아 세포는 20일 후에 합류(confluent) 상태가 됩니다.

배양 상태에서 위상차 현미경으로 관찰했을 때, 서로 다른 글리아 세포 하위 집단들이 뚜렷한 성장 패턴과 형태를 형성하는 것이 분명하게 나타났습니다. 또한 면역세포화학 분석 결과, GFAP 양성 성상세포가 배양 세포의 90% 이상을 차지하는 것으로 확인되었습니다.

72시간 동안 FUDR로 처리하는 당사의 방법을 사용하면, DRG 뉴런의 순도는 6일 이내에 99%까지 도달하며, 뉴런과 글리아 세포의 공동 배양 시 뉴라이트 성장의 높은 밀도와 함께 고유한 형태를 나타내게 됩니다. DRG 뉴런의 부착 및 뉴라이트 성장은 뉴런을 파종한 후 4시간 이내에 글리아 세포 위에서 용이하게 일어났으며, 뉴런의 부착과 뉴라이트 성장은 위상차 현미경 하에서 쉽게 식별할 수 있는 특수한 성장 패턴의 하부 구조를 형성하는 글리아 세포 하위 집단에 의해 영향을 받았습니다. 또한 면역 세포 화학법을 통해 신경 성장에 미치는 글리아 세포 이질성의 영향을 연구하기 위해 DRG 뉴런을 글리아 세포와 어떻게 공동 배양하는지 보여드리겠습니다.

본 세션을 수행할 때는 조직을 매우 세심하게 다루고 세포가 배지 속에 유지되도록 하는 것이 매우 중요합니다. 세포가 공기에 노출되어 건조해지지 않도록 하십시오. 이상입니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.