Name: 전자 스핀 공명 산소 매핑에 대한 라이브 종의 마이크로 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 전자 스핀 공명 현미경을 이용한 산소 농도 3차원 이미징 방법을. 시아노박테리아를 대상으로 미크론 스케일 해상도에서 생체 세포 주변 산소 역학을 분석하는 이 기술은 세포 호흡과 광합성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 부분적으로 부여없이 지원했습니다. 이스라엘 과학 재단 (NSF)에서 213/09, 아무 권한을 부여하지 않습니다. BSF 재단에서 2,005,258, 아무 권한을 부여하지 않습니다. 유럽​​ 연구위원회 (ERC)에서 201,665, 그리고 Technion에서 러셀 베리의 나노 테크놀로지 연구소. 우리는 시아노의 공급 및 취급에 관한 Technion에서 화학의 Schulich 학부에서 교수 노암 Adir와 파리스 살라메요의 도움을 인정합니다. Technion 마이크로 나노 가공 장치에서 도움과 스베틀라나 Yoffis의 지원이 크게 감사합니다.

1. ESR 마이크로 이미징 개요 첫째, 우리는 ESR의 간단한 설명, ESR 현미경, 그리고 시스템의 다양한 구성 요소를 제공하고, 다음 우리는 실제 영상 실험에 대해 설명합니다. 전자 스핀 공명은 특정 주파수에서 전자기 방사선이 외부 정적 자기장 (그림 1) 아래에 배치, unpaired 전자 스핀과 분자에 의해 흡수되는 spectroscopic 기법입니다. ESR이 자유 래디 칼의 상자 성체의 센터의 탐지 및 식별 등 화학, 생물학, 물리학, 재료 과학 등 광범위한 과학 분야에 고용됩니다. 그것은 살아 종의 상자 성체의 분자의 환경을 연구위한 강력한 방법이며 산도 (PH), 점도, 산소와 반응 산소 종의 농도 3에 대한 정보를 제공합니다. 이기종 샘플, ESR 스펙트럼 정보는 자기장의 그라디언트 4의 사용을 통해, 공간 해결 방법 (즉, 이미지를 획득하여)에서 얻을 수 있습니다. 이것은 주로 양성자의 스핀을 관찰 자기 공명 이미징의보다 일반적인 방법 (MRI)과 매우 유사합니다. 지금까지 이러한 ESR 이미징 기술은 몇 cm의 비교적 큰 크기와 mm 규모의 해상도에 살고있는 표본에 대해 적용되었습니다. ESR 이미징에서 (예를 들어 기준 5 촬영한 그림 2를 참조하십시오.) 비교적 최근의 개발과 함께 mm 및 하위 mm 크기의 샘플 측정 mm 규모의 해상도 작은 동물을보고로부터 기능의 확장 마이크론 규모의 해상도. 이 필드는 1 미크론 2 (그림 3에 대표적인 예제를 참조) 접근 해상도로 3D ESR 이미지를 제공할 수있는 오늘날 ESR 현미경,로 알려져 있습니다. ESR 현미경은 종래의 ESR 분석기로 본질적으로 비슷합니다. 이것은 인수 과정 및 데이터 처리를 제어하는​​ 정적 필드, 스핀 여기 및 신호 검출을위한 마이크로 웨이브 시스템, 샘플을 보관을위한 탐사 및 전산 콘솔 창출을위한 자석이 있습니다. 다른 구성 요소 독특한 ESR 일반적으로 영상과 ESR 축소 복사도 기존의 이미징 프로브에있는 것을 자성 전자 시스템의 일부 필드 그라데이션 소스, 그리고 경사 코일입니다. 우리가 특정 시스템에 대한 자세한 내용은 프로토콜 영화에 나타난 및 참조 2 설명되어 있습니다. 2. ESR 마이크로 이미징 샘플 준비 이 단계는 ESR 마이크로 이미징 실험을위한 샘플 준비 방법을 설명합니다. 이 단계의 세포의 끝에 trityl 과격한 6 버퍼 솔루션과 함께 특수 준비 유리 ESR 현미경 샘플 컨테이너의 하단에 표시됩니다. 이 프로토콜은 시아노 세포의 측정을 설명하고 있으므로, 세포의 다른 유형에 대한 적절한 조정은 샘플 준비 단계에서해야 할 수도 있습니다. <ol><li> 첫째, 400 ~ 400 μm의 크기의 흡수성 종이 몇 가지 광장은 촬영과 이후 시아노 정지 1.2 ML (40 MG / ML의 농도에서)으로 가득합니다 Eppendorf 튜브에 삽입됩니다. </li><li> 정지 microcentrifuge로 6,000 rpm으로 2 분 centrifuged입니다. </li><li> 이 다음, 표면에 뜨는 버퍼는 완전히 시아노 탈수를 피하기 위해 남아 있습니다 ~ 50 μL를 제외하고 제거됩니다. 이 과정의 결과로, 흡수 종이 이제 시아노 세포에 의해 포화 수 있습니다. </li><li> 고급 핀셋을 사용하여, 몇 섬유 신문사에서 추출 한 잔처럼 특별히 준비한 유리 샘플 홀더 7 바닥에 게재됩니다. BG - 11 솔루션 8, 9 trityl의 3 MM은 (스키마 1 참조) 벌금 주사기의 도움으로 샘플 홀더에 추가되어 다음. 홀더 그런 다음 작은 공기 배출구를 열어두고, UV 치료할 수있는 접착제를 사용하여 밀폐 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 증권 4 </td><td> 증권 3 </td><td> 증권 2 </td><td> 증권 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4 : 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4 : 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> 나이 MG EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2 : 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> 산화철 암모늄 구연 산염의 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4 : 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> 구연산 : 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4 : 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2 : 2 시간 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4 : 2 시간 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 제도 1. BG - 11 중간의 작성. </li></ol> 3. ESR 마이크로 이미징 실험 <ol><li> 이미징 실험을 시작하려면, ESR 마이크로 이미징 시스템 설정 및 이미징 프로브 내부갑니다되는 공진기에 샘플을 삽입합니다. </li><li> 이제 컴퓨터 제어 소프트웨어를 사용하여, "조정"모드에서 시스템을 설정하고 ESR 측정에 사용됩니다 프로브의 공진 마이크로 웨이브 주파수를 찾으십시오. </li><li> 즉, 펄스 시퀀스에 대한 타이밍 파라미터를 설정, 적용 마이크 로파 주파수를 일치하는 값을 정적 자기장을 설정하고 확인 ESR 신호를 관찰할 다음과 같은 것이 아니라 시스템은 기능과 예제는 잘 준비가되어 있습니다. </li><li> 그런 다음, 이러한 픽셀의 숫자로 이미지 매개 변수, 그라디언트의 강도, 그리고 자신의 필요한 값으로 그라데이션 펄스의 길이를 설정합니다. </li><li> 설정에 따라 interpulse 분리,  500, 600의 가치, 그리고 700 NS와 안 에코 영상 펄스 시퀀스 (그림 4)에서 세 3D ESR 이미지를 수집합니다. </li><li> 샘플에 투사된 빛이 필요한 실험 조건에 따라 또는 해제되어 있습니다. </li><li> 수집하는 동안, 데이터는 자동으로 저장됩니다. 논문 원시 데이터 파일은 다음 trityl 급진적인 집중과 휴식 시간을 기존의 교정을 통해 산소 농도 이미지로 번역된 T이지도의 이미지를 제공하기 위해 Matlab 소프트웨어 스크립트를 통해 처리됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 실험의 결과는 다른 τ 값에 기록된 여러 가지 입체적인 ESR 마이크로 - 이미지입니다. 일반적인 원시 데이터 이미지는 그림 5에서 제공됩니다. 어두운 조건 하에서 측정된 세 가지 이미지, 신호 강도의 감소를 제외하고 매우 비슷합니다. 반면에, 표본의 다른 부분에서 다른 휴식 시간에 따라 빛의 조사에서 이미지 패턴 변경됩니다. 이 데이터는 그림 6에 표시되며 또한 휴식 시간, T 2 (그림 7)의 이미지, 진폭 이미지를 얻기 위해 1을 처리할 수 있습니다. T이 이미지는 방정식을 통해 휴식 시간에 산소 농도를 연결하는 기존의 교정 곡선을 통해 산소 농도 값으로 변환됩니다 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="방정식 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 1"> 여기, T 2 0은 프로브의 스핀 - 스핀 완화 시간은 anoxic 조건 (프로브의 농도, C, 및 확산 계수, D에 따라 다름) 이하이며, K는 비례 상수이다. 대부분의 경우, 확산 계수는 (필요한 경우, 그것이 원칙적으로 직접 ESR 6, 10도 평가할 수 있지만) 라이브 샘플 많이 다릅니다하지 않으며, 스핀 농도는 이미징 과정에서 얻을 수 있습니다. 따라서이 관계를 직접 산소 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 6로 돌아가고, 그것은 시아노 세포가 주로 시료 홀더의 오른쪽에있는 것을 진폭 이미지에서 분명하다. 또한, 그림 7에 따라, 그것은 빛이 O 2의 생산을 시작하고 주로 시아노 근처 voxels에 솔루션의 O 2 농도의 상당한 증가를 일으키는 분명하다. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 전자 스핀 공명의 에너지 수준. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 종양 베어링 마우스의 일반적인 산소 농도 이미지. 왼쪽의 이미지는 MRI 이미지에 따라 해부 학적 정보를 보여줍니다. 안정적인 무료 유기 라디칼은 마우스를 주입하고 ESR 특성은 환경에서 산소 농도 (오른쪽)를 제공했습니다. ESR 기반 결과는 MRI 해부 이미지를 겹쳐 있습니다. 볼 분야는 32mm입니다. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 고해상도 마이크로 스케일 ES의 두 가지 예로N @ C 60 분말 (왼쪽)와 LiPc 상자 성체의 크리스털로 photolithographically 생성된 샘플의 R 이미지 (오른쪽) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 :. 전자렌지 (MW)를 표시하고 그라데이션, G X, G Y와 G Z 펄스 전형 안 이미징 펄스 시퀀스 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 : 전형적인 원시 - 데이터 ESR 마이크로 이미지 : A, B 및 C는 = 500600700 NS 각각 τ에 대한 측정없이 밝은 조명과 함께 Cyanobacterium 샘플의 원시 데이터입니다. 항목 D, E와 A, B 및 C로하지만 빛의 조명과 동일합니다. 강도는 임의의 규모 꾸몄다 (그런데 세 어둡거나 밝은 원시 데이터 이미지의 각 집합 내에서 일치)입니다 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6 : 솔루션에서 급진적인 농도 (임의의 크기)에 해당하는 진폭 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7 : T이 이미지와 해당 [O 2] 어두운 (왼쪽)와 빛 (오른쪽) 조건 값.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
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<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 ESR 마이크로 이미징 사는 작은 샘플 근처의 산소 농도를지도에 적용할 수있는 방법을 보여줍니다. ~ 30 X 30 공간적 해상도는 X 100 μm의는 거의 micromolar 산소 농도 감도와 voxel 당 하위 femtomole 절대 산소 감성으로 증명됩니다. 세포 근처에 산소 매핑에 대한 ESR 마이크로 이미지의 사용은 마이크로 전극 또는 인광 / 형광에 따라 현재 사용 가능한 기술을 보완합니다. 또한, 적절한 상자 성체의 프로브와 함께, 그것은 세포내 산소 마이크로 이미징, 다른 방법은 달성하기 매우 어려운 찾기 기능을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 가까운 미래에 우리는 슈퍼 산화물 농도, 산도 (PH), 프로브 확산 계수, 그리고 물론, 산소 농도 등 대비 매개 변수를 제공, 더욱 몇 미크론의 해상도와 함께 살고 샘플 이미지를 제공하기 위해이 방법을 개선하는 계획이다. 이러한 기능은 대비 유형의 측면에서 또한 샘플 특성 (어떤 경우에는 예를 들어이 아닌 투명 두께 샘플, 세포 대 세포 측정)의 모두 현재의 광학 기반의 방법론을 보완하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>원심분리기</td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>전중수소화 트리아릴메틸(trityl) 라디칼</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>참고문헌 &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;에 기술된 방법으로 Novosibirsk에서 합성됨.</td></tr><tr><td>BG-11 완충액</td><td></td><td></td><td>제조 지침은 Scheme 1 및 참고문헌 8, 9를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>자외선 경화제</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 또는 NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

전자 스핀 공명 산소 매핑에 대한 라이브 종의 마이크로 이미징

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

이 프로토콜은 마이크론 규모의 해상도를 1 살 세포의 즉각적인 환경에서 산소 수준의 세 차원 매핑에 대한 전자 스핀 공명 (ESR) 마이크로 이미징 방법을 설명합니다. 산소 삶의주기에서 가장 중요한 분자 중 하나입니다. 그것은 mitochondria에서 산화 인산화의 터미널 전자 수용체 역할을하고 반응 산소 종의 생산에 사용됩니다. 산소의 측정은 mitochondrial과 신진 대사 기능, 신호 경로, 다양한 자극, 멤브레인 투자율, 그리고 질병 분화의 효과 연구를 위해 중요합니다. 산소 소비 따라서 전체 생물로 세포 mitochondria에서 다양한 생물 학적 시스템에 광범위하게 적용 세포 대사의 정보를 마커입니다. 그 중요성으로 인해, 많은 방법이 사는 시스템에 산소의 측정에 개발되었습니다. 고해상도 산소 이미징을 제공하기 위해 현재 시도는 주로 광학 형광 그들이 높은 사진 독성과 낮은 산소 감도와 프로브를 채용으로 만족스러운 결과를 제공하지 인광 방법을 기반으로합니다. 예제에서 외인성 상자 성체의 프로브의 신호를 측정 ESR은, 산소 농도는 매우 정확한 측정을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 일반적인 경우, ESR 측정 프로브의 lineshape 확대 및 / 또는 지역 산소 농도에 직접 연결된 휴식 시간 단축을지도. (산소는 상자 성체의이며 따라서 외인성 상자 성체의 프로브와 충돌하면 그 휴식 시간을 곤란.) 전통적으로, 실험 이러한 유형의 낮은 해상도, 작은 동물 이미징을위한 밀리미터 규모의 ESR과 함께 진행하고 있습니다. 여기 ESR 영상도 작은 라이브 샘플 시험 마이크론 규모에서 진행 될 수있는 방법을 보여줍니다. ESR 마이크로 이미징은 상온이 1 미크론 접근 해상도 공간 - 해결 ESR 신호의 획득을 가능하게 비교적 새로운 방법이다. 이 프로토콜 종이의 주요 목적은이 새로운 방법은, 새로 개발된 산소에 민감한 프로브와 함께, 작은 라이브 샘플에서 산소 수준의 매핑에 적용할 수있는 방법을 보여줍니다. ~ 30 X 30 공간적 해상도는 X 100 μm의는 거의 micromolar 산소 농도 감도와 voxel 당 하위 femtomole 절대 산소 감성으로 증명됩니다. 세포 근처에 산소 매핑에 대한 ESR 마이크로 이미지의 사용은 마이크로 전극 또는 인광 / 형광에 따라 현재 사용 가능한 기술을 보완합니다. 또한, 적절한 상자 성체의 프로브와 함께, 또한 세포내 산소 마이크로 이미징, 다른 방법은 달성하기 매우 어려운 찾기 기능을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 전자 스핀 공명 현미경 살아있는 세포의 즉각적인 환경에서 산소 농도의 미크론 스케일 입체 영상을위한 방법을 설명합니다.

본 프로토콜은 ... 주변 환경의 산소 농도를 3차원적으로 매핑하기 위한 전자 스핀 공명(ESR) 마이크로 이미징 방법을 설명합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 전자 스핀 공명(electron spin resonance) 또는 ESR 현미경법을 사용하여 살아있는 세포의 직접적인 주변 환경 내 산소 농도에 대한 마이크론 규모의 3차원 이미지를 획득하는 것입니다. 본 프로토콜은 일반적인 광합성 세포인 시아노박테리아를 통해 시연될 것입니다. 이는 먼저 ESR 현미경 시료 홀더 내에 시아노박테리아 세포 시료를 준비함으로써 수행됩니다.안정적인 유기 라디칼 용액에 매립합니다. 샘플 홀더를 이미징 프로브 내부에 배치하고, 이를 ESR 현미경 시스템의 정자기 전자석 내부로 삽입합니다. 이제 ESR 현미경을 사용하여 유기 라디칼 용액의 3차원 ESR 마이크로 이미지를 여러 장 획득합니다.이는 여러 펄스 시퀀스 변형에 대해 수행되며, 명암 조건과 같은 다양한 외부 조건 하에서 진행되는 경우가 많습니다. 다음으로, 라디칼의 3차원 공간 분해능 이완 시간을 추출하기 위해 컴퓨터로 로우 데이터 이미지를 처리합니다. 이러한 이완 시간은 기존의 캘리브레이션을 통해 산소 농도를 직접적으로 측정할 수 있게 하며, 이를 통해 다양한 외부 조건에서 측정된 샘플의 전체 3차원 산소 맵을 생성합니다.빛이 없을 때 남조류(cyanobacteria)에 의한 산소 생성이 일어나지 않음을 명확히 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 또한, 빛 조사 하에서는 남조류 세포 근처에 상당한 산소 구배와 산소 불균일성이 형성됨이 나타났습니다. 안녕하세요, 저는 하이파에 위치한 테크니온 이스라엘 공과대학교 화학부 BLA 연구실의 al입니다.오늘은 초고해상도 현미경을 이용하여 살아있는 세포 주변의 산소 농도를 3차원적으로 고해상도 매핑하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 세포의 산소 소비율과 대사 활동을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.전자 스핀 공명(Electron spin resonance) 또는 ESR은 외부 정자기장 하에 놓인 홀전자를 가진 상자성 종이 특정 주파수의 전자기파를 흡수하는 분광학적 기법입니다. 이는 산소 및 활성 산소 종의 농도를 포함하여, 생체 내 상자성 분자의 환경을 연구하는 강력한 방법입니다. 여기 불균일한 시료에 대해 종양을 가진 마우스의 전형적인 산소 농도 영상이 제시되어 있습니다.자기장 경사(magnetic field gradients)를 사용하면 ESR 스펙트럼 정보를 공간적으로 분해된 방식으로 얻을 수 있습니다. 안정적인 유리 유기 라디칼을 마우스에 주입하였으며, 이 라디칼의 ESR 특성을 통해 주변 환경의 산소 농도를 측정하였습니다. ESR 기반 결과는 MRI 해부학적 이미지 위에 중첩되었습니다.지금까지 생체 시료에 대한 이러한 ESR 이미징 기술은 밀리미터 규모의 상대적으로 큰 샘플만으로 수행되었습니다. 고해상도 ESR 현미경 기술은 밀리미터 및 서브 밀리미터 크기의 샘플 측정을 포함하며, 1 µm에 근접하는 해상도의 3차원 ESR 이미지를 제공합니다.다음은 NNC 60 분말과 리튬 페로사이아나이드 상자성 결정으로 제작된 샘플의 고해상도 마이크론 스케일 ESR 이미지 두 가지 예시입니다. ESR 현미경은 일반적인 ESR 분광계와 유사하며, 정자기장을 생성하는 자석, 스핀 여기 및 신호 검출을 위한 마이크로파 시스템, 샘플을 고정하는 프로브, 그리고 데이터 획득 과정과 데이터 처리를 제어하는 컴퓨터 콘솔로 구성됩니다. 시스템의 기타 구성 요소로는 전자 시스템의 일부인 자기장 구배 드라이버와 이미징 프로브 내에 위치한 구배 코일이 있습니다.그라디언트 코일에는 시료에 빛을 조사할 수 있도록 하는 개구부가 있습니다. 실험 중 탈수를 최소화하기 위해 온도 조절된 습윤 공기가 시료에 공급됩니다. ESR 현미경의 주요 특징은 프로브와 그라디언트 코일의 크기가 작다는 점, 시스템의 스핀 감도가 높다는 점, 그리고 자기장 그라디언트 드라이버의 강도가 높다는 점입니다. 이 절차를 시작하기 전에 40 mg/mL 농도의 시아노박테리아 현탁액을 준비하십시오.ESR 마이크로 이미징 시료 준비를 시작하려면, 미세 핀셋을 사용하여 약 400 by 400 microns 크기의 흡수성 종이 조각 몇 개를 집으십시오. 그다음 이를 eppendorf 튜브에 넣으십시오. 이어서 튜브에 1.2 milliliters의 남조류 현탁액을 채우십시오.그 다음, 마이크로 원심분리기를 사용하여 현탁액을 6,000 RPM에서 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후에는 시아노박테리아의 탈수를 방지하기 위해 약 50 microliters만 남기고 상청액을 완전히 제거합니다. 이 과정을 통해 흡수지의 시아노박테리아 세포가 포화 상태가 됩니다. 다음으로, 특수하게 제작된 컵 형태의 유리 시료 홀더를 준비하고, 미세 핀셋을 사용하여 종이에서 섬유 몇 가닥을 추출해 시료 홀더 바닥에 놓습니다.그 다음, 서면 프로토콜에 기술된 대로 준비한 3mM의 tridel 및 BG 11 용액을 주사기를 사용하여 가합니다. 그런 다음 유리 샘플 홀더의 가장자리와 그에 맞는 커버 글라스 조각 사이에 UV 경화성 접착제를 도포하여 샘플 홀더를 밀봉하되, 작은 공기 배출구는 열어둡니다. 마지막으로, UV 광선으로 2초 동안 접착제를 경화시킵니다.이미징 실험을 시작하려면 ESR 마이크로 이미징 시스템의 전원을 켜고 이미징 프로브 내부에 위치한 공진기에 시료를 삽입하십시오. 이제 컴퓨터 제어 소프트웨어를 사용하여 시스템을 튜닝 모드로 설정하고, ESR 측정에 사용할 프로브의 공진 마이크로파 주파수를 찾으십시오. 그 다음, 인가된 마이크로파 주파수와 일치하는 값으로 정자기장을 설정하십시오.펄스 시퀀스의 타이밍 파라미터를 설정하고 ESR 신호를 관찰하여 시스템이 제대로 작동하는지, 샘플이 잘 준비되었는지 확인하십시오. 그다음 픽셀 수, 그래디언트 강도, 그래디언트 펄스 길이와 같은 이미징 파라미터를 필요한 값으로 설정하십시오. 설정이 완료되면, 펄스 간 간격 tau 값을 500, 600 및 700 nanoseconds로 하여 Hahn Echo Imaging 펄스 시퀀스로 3D ESR 이미지 3개를 수집하십시오.이 시점에서, 획득 과정 전반에 걸쳐 실험 조건에 필요한 경우 시료의 광 투사를 켭니다. 데이터는 자동으로 저장됩니다. 데이터 획득 프로세스 이후, MATLAB 소프트웨어 스크립트를 통해 원시 데이터 파일을 처리합니다. 해당 소프트웨어를 사용하여 트릴 라디칼 농도와 이완 시간의 이미지를 생성합니다.T2 맵을 생성한 후, 산소 농도와 이완 시간을 연결하는 기존의 보정 곡선을 통해 이 이미지들을 산소 농도 이미지로 변환합니다. 여기서 T2 0은 무산소 조건에서 프로브의 스핀-스핀 이완 시간이며, 이는 프로브의 농도 C와 확산 계수 D에 따라 달라집니다. 남조류를 대상으로 수행된 여러 3차원 ESR 이미징 실험의 전형적인 로우 데이터 이미지가 제시되어 있습니다. 이 이미지들은 암조건 또는 명조건 하에서 서로 다른 tau 값으로 획득되었습니다.암조건 하에서의 결과는 스핀 이완 시간 T₂로 인해 T 값이 클수록 강도가 감소하는 점을 제외하고는 매우 유사합니다. 반대로, 빛을 조사하면 시료 전체에 걸쳐 이완 시간이 달라지므로 이미지 패턴이 변합니다. 이후 이 데이터를 처리하여 해당 이미지로부터 진폭 이미지를 얻습니다.시아노박테리아가 주로 샘플 홀더의 오른쪽에 위치해 있음이 분명합니다. 두 이미지는 산소 농도와 이완 시간을 연결하는 기존의 검정 곡선을 통해 산소 농도 값으로 변환됩니다. 결과는 빛이 있을 때와 없을 때의 시아노박테리아에 대해 나타내었습니다.빛에 의해 산소 생성이 시작되어 용액 내 산소 농도가 상당히 증가한다는 점이 분명해졌습니다. 이는 주로 사이아노박테리아가 있는 흡수지 섬유 주변의 복셀에서 라디칼 T2의 감소로 이어집니다. 지금까지 EESR 현미경을 이용한 산소 농도 매핑을 위해 안정적인 자유 라디칼을 포함하는 생세포 시료를 준비하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 신호 변동성을 보장하고 시료의 퇴화를 방지하기 위해 처리 시간을 최대한 짧게 유지하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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