전자 스핀 공명 산소 매핑에 대한 라이브 종의 마이크로 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 전자 스핀 공명(electron spin resonance) 또는 ESR 현미경법을 사용하여 살아있는 세포의 직접적인 주변 환경 내 산소 농도에 대한 마이크론 규모의 3차원 이미지를 획득하는 것입니다. 본 프로토콜은 일반적인 광합성 세포인 시아노박테리아를 통해 시연될 것입니다. 이는 먼저 ESR 현미경 시료 홀더 내에 시아노박테리아 세포 시료를 준비함으로써 수행됩니다.

안정적인 유기 라디칼 용액에 매립합니다. 샘플 홀더를 이미징 프로브 내부에 배치하고, 이를 ESR 현미경 시스템의 정자기 전자석 내부로 삽입합니다. 이제 ESR 현미경을 사용하여 유기 라디칼 용액의 3차원 ESR 마이크로 이미지를 여러 장 획득합니다.

이는 여러 펄스 시퀀스 변형에 대해 수행되며, 명암 조건과 같은 다양한 외부 조건 하에서 진행되는 경우가 많습니다. 다음으로, 라디칼의 3차원 공간 분해능 이완 시간을 추출하기 위해 컴퓨터로 로우 데이터 이미지를 처리합니다. 이러한 이완 시간은 기존의 캘리브레이션을 통해 산소 농도를 직접적으로 측정할 수 있게 하며, 이를 통해 다양한 외부 조건에서 측정된 샘플의 전체 3차원 산소 맵을 생성합니다.

빛이 없을 때 남조류(cyanobacteria)에 의한 산소 생성이 일어나지 않음을 명확히 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 또한, 빛 조사 하에서는 남조류 세포 근처에 상당한 산소 구배와 산소 불균일성이 형성됨이 나타났습니다. 안녕하세요, 저는 하이파에 위치한 테크니온 이스라엘 공과대학교 화학부 BLA 연구실의 al입니다.

오늘은 초고해상도 현미경을 이용하여 살아있는 세포 주변의 산소 농도를 3차원적으로 고해상도 매핑하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 세포의 산소 소비율과 대사 활동을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

전자 스핀 공명(Electron spin resonance) 또는 ESR은 외부 정자기장 하에 놓인 홀전자를 가진 상자성 종이 특정 주파수의 전자기파를 흡수하는 분광학적 기법입니다. 이는 산소 및 활성 산소 종의 농도를 포함하여, 생체 내 상자성 분자의 환경을 연구하는 강력한 방법입니다. 여기 불균일한 시료에 대해 종양을 가진 마우스의 전형적인 산소 농도 영상이 제시되어 있습니다.

자기장 경사(magnetic field gradients)를 사용하면 ESR 스펙트럼 정보를 공간적으로 분해된 방식으로 얻을 수 있습니다. 안정적인 유리 유기 라디칼을 마우스에 주입하였으며, 이 라디칼의 ESR 특성을 통해 주변 환경의 산소 농도를 측정하였습니다. ESR 기반 결과는 MRI 해부학적 이미지 위에 중첩되었습니다.

지금까지 생체 시료에 대한 이러한 ESR 이미징 기술은 밀리미터 규모의 상대적으로 큰 샘플만으로 수행되었습니다. 고해상도 ESR 현미경 기술은 밀리미터 및 서브 밀리미터 크기의 샘플 측정을 포함하며, 1 µm에 근접하는 해상도의 3차원 ESR 이미지를 제공합니다.

다음은 NNC 60 분말과 리튬 페로사이아나이드 상자성 결정으로 제작된 샘플의 고해상도 마이크론 스케일 ESR 이미지 두 가지 예시입니다. ESR 현미경은 일반적인 ESR 분광계와 유사하며, 정자기장을 생성하는 자석, 스핀 여기 및 신호 검출을 위한 마이크로파 시스템, 샘플을 고정하는 프로브, 그리고 데이터 획득 과정과 데이터 처리를 제어하는 컴퓨터 콘솔로 구성됩니다. 시스템의 기타 구성 요소로는 전자 시스템의 일부인 자기장 구배 드라이버와 이미징 프로브 내에 위치한 구배 코일이 있습니다.

그라디언트 코일에는 시료에 빛을 조사할 수 있도록 하는 개구부가 있습니다. 실험 중 탈수를 최소화하기 위해 온도 조절된 습윤 공기가 시료에 공급됩니다. ESR 현미경의 주요 특징은 프로브와 그라디언트 코일의 크기가 작다는 점, 시스템의 스핀 감도가 높다는 점, 그리고 자기장 그라디언트 드라이버의 강도가 높다는 점입니다. 이 절차를 시작하기 전에 40 mg/mL 농도의 시아노박테리아 현탁액을 준비하십시오.

ESR 마이크로 이미징 시료 준비를 시작하려면, 미세 핀셋을 사용하여 약 400 by 400 microns 크기의 흡수성 종이 조각 몇 개를 집으십시오. 그다음 이를 eppendorf 튜브에 넣으십시오. 이어서 튜브에 1.2 milliliters의 남조류 현탁액을 채우십시오.

그 다음, 마이크로 원심분리기를 사용하여 현탁액을 6,000 RPM에서 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후에는 시아노박테리아의 탈수를 방지하기 위해 약 50 microliters만 남기고 상청액을 완전히 제거합니다. 이 과정을 통해 흡수지의 시아노박테리아 세포가 포화 상태가 됩니다. 다음으로, 특수하게 제작된 컵 형태의 유리 시료 홀더를 준비하고, 미세 핀셋을 사용하여 종이에서 섬유 몇 가닥을 추출해 시료 홀더 바닥에 놓습니다.

그 다음, 서면 프로토콜에 기술된 대로 준비한 3mM의 tridel 및 BG 11 용액을 주사기를 사용하여 가합니다. 그런 다음 유리 샘플 홀더의 가장자리와 그에 맞는 커버 글라스 조각 사이에 UV 경화성 접착제를 도포하여 샘플 홀더를 밀봉하되, 작은 공기 배출구는 열어둡니다. 마지막으로, UV 광선으로 2초 동안 접착제를 경화시킵니다.

이미징 실험을 시작하려면 ESR 마이크로 이미징 시스템의 전원을 켜고 이미징 프로브 내부에 위치한 공진기에 시료를 삽입하십시오. 이제 컴퓨터 제어 소프트웨어를 사용하여 시스템을 튜닝 모드로 설정하고, ESR 측정에 사용할 프로브의 공진 마이크로파 주파수를 찾으십시오. 그 다음, 인가된 마이크로파 주파수와 일치하는 값으로 정자기장을 설정하십시오.

펄스 시퀀스의 타이밍 파라미터를 설정하고 ESR 신호를 관찰하여 시스템이 제대로 작동하는지, 샘플이 잘 준비되었는지 확인하십시오. 그다음 픽셀 수, 그래디언트 강도, 그래디언트 펄스 길이와 같은 이미징 파라미터를 필요한 값으로 설정하십시오. 설정이 완료되면, 펄스 간 간격 tau 값을 500, 600 및 700 nanoseconds로 하여 Hahn Echo Imaging 펄스 시퀀스로 3D ESR 이미지 3개를 수집하십시오.

이 시점에서, 획득 과정 전반에 걸쳐 실험 조건에 필요한 경우 시료의 광 투사를 켭니다. 데이터는 자동으로 저장됩니다. 데이터 획득 프로세스 이후, MATLAB 소프트웨어 스크립트를 통해 원시 데이터 파일을 처리합니다. 해당 소프트웨어를 사용하여 트릴 라디칼 농도와 이완 시간의 이미지를 생성합니다.

T2 맵을 생성한 후, 산소 농도와 이완 시간을 연결하는 기존의 보정 곡선을 통해 이 이미지들을 산소 농도 이미지로 변환합니다. 여기서 T2 0은 무산소 조건에서 프로브의 스핀-스핀 이완 시간이며, 이는 프로브의 농도 C와 확산 계수 D에 따라 달라집니다. 남조류를 대상으로 수행된 여러 3차원 ESR 이미징 실험의 전형적인 로우 데이터 이미지가 제시되어 있습니다. 이 이미지들은 암조건 또는 명조건 하에서 서로 다른 tau 값으로 획득되었습니다.

암조건 하에서의 결과는 스핀 이완 시간 T₂로 인해 T 값이 클수록 강도가 감소하는 점을 제외하고는 매우 유사합니다. 반대로, 빛을 조사하면 시료 전체에 걸쳐 이완 시간이 달라지므로 이미지 패턴이 변합니다. 이후 이 데이터를 처리하여 해당 이미지로부터 진폭 이미지를 얻습니다.

시아노박테리아가 주로 샘플 홀더의 오른쪽에 위치해 있음이 분명합니다. 두 이미지는 산소 농도와 이완 시간을 연결하는 기존의 검정 곡선을 통해 산소 농도 값으로 변환됩니다. 결과는 빛이 있을 때와 없을 때의 시아노박테리아에 대해 나타내었습니다.

빛에 의해 산소 생성이 시작되어 용액 내 산소 농도가 상당히 증가한다는 점이 분명해졌습니다. 이는 주로 사이아노박테리아가 있는 흡수지 섬유 주변의 복셀에서 라디칼 T2의 감소로 이어집니다. 지금까지 EESR 현미경을 이용한 산소 농도 매핑을 위해 안정적인 자유 라디칼을 포함하는 생세포 시료를 준비하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 신호 변동성을 보장하고 시료의 퇴화를 방지하기 위해 처리 시간을 최대한 짧게 유지하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.