Name: 장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 학습하세요 로테논 경구 투여로 장용 신경계에서 알파-시누클레인 축적을 유도하는 방법을. 이 기법은 파킨슨병 병태생리학 연구와 신경독성 메커니즘 규명에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

페드로 드 라 바리 마자 재단은이 작품을지지했습니다.

Rotenone 1) Intragastric 관리 <ol><li> 동물의 무게를. </li><li> 필요한 rotenone / 자동차 솔루션의 전체 볼륨을 계산합니다. 동물 중량 g 당 이러한 경우에는 0.01 ML. </li><li> 이전에 계산 rotenone 솔루션의 볼륨 (0.625 MG / ML rotenone, 4 % carboxymethylcellulose 및 1.25 %의 클로로포름) 또는 차량 용액 (4 % carboxymethylcellulose 및 1.25 %의 클로로포름)와 ​​1 ML의 주사기를 부과합니다. 이 경우는 5 MG / kg rotenone 선량에 해당합니다. </li><li> 마우스를 들고, 한 손으로 마우스의 꼬리를 들고, 다른 한편의 첫 번째와 두 번째 손가락으로 당겨 목 피부를 스트레칭. </li><li> 머리가 두 손가락 사이에 고정되면, 손바닥에 대해 그것을 엎드려서 거꾸로 그것을 켜십시오. 네 번째와 다섯째 손가락을 사용하여 꼬리를 수정. </li><li> 뒤로 향해 머리를 유지, 마우스의 입을 열 미각을 누르십시오. 부드럽게 입안에 gavage을 소개합니다. gavage 바늘이 아닌 일반 바늘을 사용하는 것이 중요합니다. 천천히, 멀리 위 방향으로 gavage 이동합니다. 이것은 폐에 받고 자료를 막을 수있을 겁니다. </li><li> 부드럽게 색전증을 눌러 rotenone 솔루션이나 차량을 관리할 수 있습니다. 완료되면, 천천히 gavage 압축을 풉니다. </li><li> 한 케이지에서 모든 동물이 완료되기 전까지 다른 새장에있는 동물을 돌려 놓습니다. </li></ol> 2) Immunostaining 절차 <ol><li> 치료 후, 마우스는 Ketamin 100 MG / kg 놀이 Xylazin 10 MG / kg IP 및 intracardially PBS의 4 % Paraformaldehyde로 perfused를 사용하여 anesthetized 있습니다. </li><li> 배짱은 다음 절개로 추출하고, 야간 15 % 자당에 배치됩니다. 그 다음날은, 조직은 30 % 자당에 전송하고 4 박 다시 incubated 있습니다 ° C. </li><li> 조직은 다음 조직 테크에 위치하고 사용할 때까지 -80 ° C의 냉동고에 저장됩니다. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 20 마이크론 소장 교차 섹션은 Superfrost 슬라이드로 전송됩니다. </li><li> 안티 βIII - tubulin 및 안티 알파 synuclein 항체를 사용하여 프로 시저를 차단하고 immunostaining 것은 다음 앞에서 설명한 9로 수행됩니다. </li></ol> 3) 알파 synuclein의 포함 이미지 분석 그것은 이미지가 '원산지 모르고 외부 사람이 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 따라서, 데이터는 codified해야합니다. 이미지 분석 피지 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. <ol><li> 공촛점 이미지 파일을 엽니다. 그것이 개별적으로 각 채널에서 작동이 가능합니다 그래서 그 다음, 채널을 분할. </li><li> 사용하고 Analyse&gt; 규모를 설정하고 1 픽셀 크기를 설정을 선택하지 않을 이들 채널을 닫습니다. 0.13 (이것은 객관적이고 사용되는 해상도에 따라 달라집니다)로 알려진 거리를 설정하고 세계 클릭하십시오. 이미지의 크기는 현재 미크론으로 표시됩니다. </li><li> 알파 synuclein 채널을 선택하고 신경절을 선택, 선택이 모든 조각에 신경을 encloses 있는지 확인하십시오. </li><li> 보도 자료 이미지&gt; 이미지를 복제하는 중복. 신경절을 선택한 단지 이미지는 신경절의 크기가 중복됩니다. </li><li> 보도 편집&gt; 지우기 밖에. 선택 영역 밖으로 이미지의 부분은 검정색이 될 것입니다. </li><li> 프로 시저 간 얼마나 잘 나중 단계에서 확인하기 위해 이미지를 다시 복사. 배경 노이즈 비율에 높은 신호를 가지고 이미지는 이미지 분석을 위해 사용하지 않아야합니다. </li><li> 이미지&gt; 조정&gt; 임계값을 선택하고 다음 MaxEntropy 선택합니다. 그런 다음 프로 시저가 잘 된 것을 보장하기 위해 자른 이미지와 원래의 하나의 슬라이스를 통해 이동합니다. entropic 임계값은 이미지의 히스토그램이 임계값 이상의 농도가 검정색 이미지 위에 흰색에 표시됩니다에서만 해당 픽셀에 따라 강도 신호 레벨을 선택합니다. </li><li> 프로세스를 선택한 다음, 부드러운 클릭하십시오. 이 단계는 매끄러운 가장자리에있는 이미지의 pixeled 가장자리를 변환합니다. </li><li> 프로세스를 선택한 다음 바이너리를 클릭하고, 바이너리를 만들기를 선택합니다. 이미지가 이미지 위에 흰색 검정색으로 표시됩니다. </li><li> 중복 이미지 다음 단계를 수행하는 이미지를 중복. </li><li> 분석&gt; 분석 입자를 클릭하십시오. 그런 다음 표시를 선택 : 개요하고 요약을 클릭합니다. 설정의 나머지 부분은 기본에 잎이 달린해야합니다. 이 함수는 신호와 함께 그룹화하는 기능과 픽셀의 총 개수를 인식합니다. 신호 플러스 픽셀 그룹의 수와 평균 크기가 픽셀의 전체 표면은보고됩니다. </li><li> 잘 조정 가장 큰 조각을 비교하고 선택합니다. 슬라이스가 표시됩니다. </li><li> 총 알파 synuclein 표면, 흠도의 수와 평균 입자 크기의 데이터 테이블을 복사합니다. Excel 스프레드 시트 또는 다른 주석에 데이터를 붙여 넣습니다. </li><li> 피지 (으)로 돌아가기와 β - tubulin 채널에서 이전에 선택한 슬라이스를 찾아, 그것을 선택합니다. </li><li> 신경절 영역을 선택하고을 클릭 다음 측정을 선택 분석. 또 다른 테이블을 보여주는가 나타납니다신경절 총 표면. </li><li> 알파 synuclein 측정 근처 엑셀 시트로 테이블에서 데이터를 추출하거나 다른 곳에서 내려 복사합니다. </li><li> 엑셀 사용 신경절의 크기로 정규화 총 알파 synuclein의 표면 및 포함 번호를 얻으려면 신경절 표면으로 알파 synuclein 측정에서 얻은 여러 가지 매개 변수를 나눕니다. </li></ol> 4) 대표 결과 gavage 관리 프로토콜이 올바르게 수행하면 동물에 대한 불편을 최소화하고 있습니다. rotenone의 농도를 사용하는 치료는 혈액에 rotenone 수준없이 팔에 rotenone의 로컬 효과를 가능하게하고 근육이나 뇌 mitochondrial 콤플렉스없이 억제 나 역시 치료의 1.5 개월 (그림 1 참조) 후. 이미지 분석이 올바르게 수행하는 경우 알파 synuclein 패턴의 엄격한 분석이 가능하여야한다. 그것은 알파 - synuclein (총 표면), 알파 - synuclein의 셀에 패턴 (흠도의 수)와 알파 synuclein의 흠도의 존재 (포함 크기) (그림 2)의 총액에 대한 신뢰할 수있는 데이터를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. rotenone의 모터 장애는 혈액이나 CNS에 rotenone의 검출없이 쥐를 치료. 표준 (50 NG / ML) 20 10 5 MG / kg 취급 생쥐의 두뇌 샘플에서 크로마토 그램. B와 C, rotenone 혈액의 수준 (B) 및 CNS (C)의 양을 정함. B, 혈액 레벨 1 , 치료 후 2, 3 시간. 마우스가 세 그룹 (N = 3)에 나누어 2.5, 5, 10 및 20 MG / kg rotenone 취급했다 (N = 3), 혈액 300 μL는 rotenone 관리 후 1, 2, 3 시간 추출하여 함께 풀링되었습니다 5 (N = 3), 10 (N = 3) 및 20과 함께 하루 (N = 1) MG / kg rotenone, 두뇌 및 brainstem가 2 시간 후에 1을 추출하고 있었다 한번 HPLC 분석. C는 생쥐 한 주 동안 치료를했다 마지막으로 관리 및 HPLC 분석. D, mitochondrial 콤플렉스 I 1.5 개월 치료를 생쥐의 근육과 두뇌 샘플의 활동 준비에 들어갔다. <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 로컬로 관리되는 rotenone은 팔의 신경에 gliosis와 알파 synuclein의 인산화, 축적 및 집계를 유도. (스케일 바 20 μm의). A, B, C, 안티 βIII - tubulin, 알파 synuclein과 십이지장에서 DAPI의 얼룩 (B)과 회장 (이 A, C) 부분. 3 개월 제어 (A)에 비해 B의 화살표는, 1.5 개월 치료 장용 신경계의 신경 내부 증가 알파 synuclein 작은 반점이있는 패턴을 유도. C에서 화살표, 큰 알파 synuclein의 함유 (ø&gt; 6 μm의)의 3 개월 치료를 유발 형성. D, 안티 - 알파 - synuclein, Thioflavine S 및 DAPI를 사용하여 immunofluorescence 염색법. D에 화살표, 오직 삼개월 취급 쥐가이 큰 알파 synuclein의 축적의 집합을 보여주었다. E, E ', E', 이미지 분석 부량 단계. E, 팔의 신경절을 보여주 부량에 사용되는 이미지의 예를 보여주는 알파 synuclein에 대한 immunostained 다른 흠도. E ', 이미지 분석 프로토콜 후 얻은 이미지의 예. E', 원래 흠도 (녹색)와 프로토콜 (노란색 선)을 수행한 후 얻은 표현의 일부 사이에 중복됩니다. FG에 표시된 실험 부량 AC는 자동으로 세분화 및 엔트로피 기반 thresholding 방법을 사용하여 만들어졌다. 단일 별표, P &lt;0.05, 두 번 별표, P &lt;0.01. F, 각 열의 총 알파 synuclein의 표면 / 신경절 표면을 나타냅니다. G, 각 컬럼은 알파 synuclein의 함유 / 신경절 표면의 총 수를 나타냅니다. 모든 그래프는 ± SEM을 의미 표시

<ol><li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li>
<li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li>
<li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+lesions+in+dorsal+horn+layer+I%2C+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li>
<li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+development+of+Parkinson%27s+disease-related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li>
<li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+Parkinson%27s+disease+with+exposure+to+pesticides%2C+farming%2C+well+water%2C+and+rural+living%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li>
<li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li>
<li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li>
<li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Parkinson%27s+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li>
<li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li>
<li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li>
<li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate%2C+a+chemical+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li>
</ol>

프란 시스코 판 - Montojo이 동물 모델 (신청 번호 PCT / EP 2009/005688)에 대해 보류중인 특허 출원 있습니다.

Intragastric 관리는 이전에 12을 수행하고 있습니다. 그러나, 0.5 % carboxymethylcellulose 나트륨 소금 (CMSS) 혼자 인덴의 원고에 따르면, rotenone가 실시되었다 해산. Rotenone는 높은 liphophylic 물질입니다. 따라서, rotenone 혼자 0.5 % CMSS에 녹아 수 없습니다 그래서 할 경우에는 침전됩니다. 클로로포름의 사용은 강수량을 피한 균등하게 분산 rotenone 서스펜션을 만듭니다. 또한, CMSS에서 살충제의 높은 농도로 인해, 관리 솔루션의 최종 볼륨도 크게 감소합니다. 따라서 행정의 합병증을 감소. 우리는 곧장 gavages의 사용을 권장합니다. 마우스의 식도는 직접 복부의 한쪽 끝, 직선이다. 따라서, 직선 gavages이 작업을 위해 더 적합합니다. 공촛점 이미지의 이미지 분석 피지 소프트웨어를 사용하여 이루어졌다. 본 소프...

<table><tbody><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>독일</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>독일</td></tr><tr><td>카르복시메틸셀룰로오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td>독일</td></tr><tr><td>가바지 튜브 1.2 mm x 60 mm</td><td>Unimed</td><td></td><td>스위스</td></tr><tr><td>LSM 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://pacific.mpi-cbg.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 gavage 및 이미지 분석을 사용하여 rotenone의 구강 관리

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

파킨슨병 (PD) 환자에서 연관된 병리 인터 알리아 장용 신경계 (팔) 1,2, 후각 망울 (OB), 미주 (DMV) 3 등의 모터 핵, intermediolateral 관련된 특성 패턴을 따릅니다 척수 4와 substantia 니그라의 핵, 4,5 질병의 neuropathological 준비를위한 기초를 제공합니다. 팔과 OB가 가장 노출된 신경 구조와 영향을 가장 먼저 사람입니다. 흥미롭게도, PD는 농약 노출 6-8 관련된되었습니다. 여기 세부에서 우리의 이전 연구 9에 사용되는 두 가지 방법을 보여줍니다. 팔에서 로컬로 연기 rotenone의 효과를 분석하기 위해, 우리는 한 세 C57/BL6 마우스로 gavage를 사용하여 rotenone을 관리. Rotenone 강력 mitochondrial 복잡한에게 I 10을 억제 널리 사용되는 살충제이다. 그것은 매우 lipophylic과 저조한 위장관 11 흡수됩니다. 우리의 결과는 5 MG / rotenone의 kg의 행정부가 mitochondrial 복잡한 I 근육이나 두뇌의 활동을 억제하지 않았 것으로 나타났다. 따라서, 우리의 관리 방법 rotenone을 사용하면 hepatoportal 시스템을 교차하지 않았고 오직 팔에 행동 것을 제안. 여기서 우리는 엔터 프라이즈 네트워크에 알파 synuclein의 축적에 살충제의 효과를 분석하는 데 사용하는 gavage 및 이미지 분석 프로토콜을 사용하여 살충제를 관리하는 방법을 보여줍니다. 첫 번째 부분은 원하는 정확한 농도의 살충제 (rotenone)의 intragastric 관리를 허용하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 엔터 프라이즈 네트워크에 알파 synuclein의 축적을 분석 반자동 이미지 분석 프로토콜을 보여줍니다.

파킨슨병은 살충제에 대한 노출과 관련된되었습니다. 여기서 우리는 원하는 농도와 장용 신경계의 알파 synuclein의 축적에서 효과를 분석하는 방법에 위장 튜브를 사용하는 살충제를 전달하는 방법을 보여줍니다.

장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

파킨슨병(PD) 환자에서 관련 병리는 특히 장신경계(ENS)를 포함하는 특징적인 패턴을 따릅니다 1,2, ...

운동 및 언어 기능 장애를 포함한 파킨슨병의 증상은 뇌 내 도파민 분비 세포의 활성 감소로 인해 발생합니다. 장 신경계와 후각구는 가장 노출되기 쉬운 신경 구조이며 가장 먼저 영향을 받는 부위입니다. 파킨슨병은 살충제 노출과 연관이 있는 것으로 알려져 있습니다.살충제가 장신경계에 미치는 영향을 분석하기 위해, 마우스에게 살충제 roone을 경구 투여합니다. 그 후, 마우스의 심장 내에 4% paraform aldehyde를 관류시켜 뇌와 장신경계를 고정합니다. 조직을 추출 및 준비한 후, PD 관련 단백질에 대해 면역염색을 실시합니다.공초점 현미경으로 획득한 Beta three tubulin 및 alpha synuclein 이미지는 살충제에 노출된 동물의 장신경계 뉴런 내에 alpha synuclein이 축적됨을 보여줍니다. 로테논(rotenone)의 전신 투여와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 로테논의 효과가 장신경계에만 국한되도록 보장한다는 점입니다. 이 방법은 파킨슨병의 병인 및 진행 기전과 같은 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 함의는 파킨슨병의 치료 및 진단까지 확장되는데, 이는 새로운 치료 표적과 진단 방법의 개발을 가능하게 하기 때문입니다. 이 방법은 파킨슨병의 병태생리에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 장벽뿐만 아니라 장성, 교감 및 부교감 신경계에 미치는 다른 환경 독소의 영향 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 개인은 가바지(gavage)법을 숙달하는 데 시간이 걸리므로 어려움을 겪을 수 있습니다.저는 살충제와 파킨슨병 사이의 연관성에 관한 글을 읽었을 때 처음으로 이러한 방법들에 대한 아이디어를 얻었습니다. 또한 2005년 베를린에서 열린 세계 파킨슨 회의(World Parkinson Congress)에서 CORAs 컨퍼런스를 참관한 것이 도움이 되었습니다. 이 방법의 평화로운 시연이 필요합니다.마우스는 인간과 해부학적 구조가 다르기 때문에 존데(gavage)를 통해 ol을 투여하는 방법은 어렵습니다. 한편, 이미지 분석은 이러한 이미지들에 맞게 최적화된 단계별 과정으로 수행되었습니다. 먼저 동물의 무게를 측정하여 프로토콜을 시작하십시오. 이후 로테논(rotenone)의 적절한 투여량을 계산하십시오.동물 체중 1g당 0.01mL가 필요하며, 이는 kg당 5mg의 roone 용량에 해당합니다. 1mL 주사기에 roone 용액을 채운 다음, 두 번째 주사기에 vehicle 용액을 채웁니다. 마우스를 잡고 한 손으로 마우스의 꼬리를 잡습니다.다른 쪽 손의 검지와 중지를 사용하여 목 피부를 당겨 펴줍니다. 머리가 두 손가락 사이에 고정되면, 손바닥에 기대어 머리를 아래로 돌립니다. 꼬리를 고정합니다.네 번째와 다섯 번째 손가락을 사용하여 머리를 뒤쪽으로 고정한 상태에서 입천장을 눌러 마우스의 입을 엽니다. 존대를 입안으로 조심스럽게 삽입합니다. 존대의 전체 길이가 삽입될 때까지 위장 방향으로 천천히 밀어 넣습니다.물질이 폐로 들어가는 것을 방지하기 위해, 엠볼루스를 가볍게 눌러 roone 용액 또는 용매를 투여하십시오. 투여가 완료되면 가바지를 천천히 추출하고, 한 케이지의 모든 동물에 대한 처리가 끝날 때까지 해당 동물을 다른 케이지에 넣으십시오. 처리 후 마우스는 4% paraform aldehyde로 심장 내 관류를 실시합니다.PBS 내에서 해부를 통해 장을 적출한 후 15% sucrose에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 조직을 30% sucrose로 옮겨 4°C에서 다시 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후 조직을 -80°C 냉동고에 넣어 사용할 때까지 보관합니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 장 조직을 20 µm 두께로 절편합니다.횡단면을 frost 슬라이드로 옮긴 후, 블로킹 및 면역염색 과정을 거칩니다. 이어서 anti beta three tubulin 및 Antifa synuclein 항체를 사용하여 염색을 수행합니다. 데이터의 분석은 외부 인원이 맹검법으로 수행할 것을 권장합니다.분석을 시작하려면 Fiji 소프트웨어를 실행하십시오. 공초점 이미지 파일을 엽니다. 그 다음, 각 채널을 독립적으로 작업할 수 있도록 채널을 분리하십시오.사용하지 않을 채널은 닫고, 분석(analyze) 및 설정(set)을 선택한 후, 스케일(scale)에서 픽셀 크기를 1로 설정하십시오. 알려진 거리(known distance)를 0.13으로 설정하고 global을 클릭하십시오. 이제 이미지 크기가 마이크론(microns) 단위로 표시됩니다.alpha synuclein 채널을 선택하고 신경절을 선택합니다. 선택 영역이 모든 슬라이스에서 신경절을 포함하고 있는지 확인하십시오. 신경절만 선택된 상태에서 이미지를 복제하면 신경절 크기만큼의 이미지만 복제됩니다.편집(edit)을 누르면 선택 영역 외부의 이미지 부분이 검게 변합니다. 절차가 얼마나 잘 수행되었는지 확인하기 위해 이미지를 다시 복제하십시오. 신호 대 배경 잡음비(signal to background noise ratio)가 낮은 이미지는 이미지 분석에 사용해서는 안 됩니다.이미지 조정 임계값(adjust threshold)을 선택합니다. 그런 다음 최대 엔트로피(max entropy)를 선택하십시오. 이후 크롭된 이미지와 원본 이미지의 슬라이스들을 살펴보며 절차가 제대로 수행되었는지 확인합니다.트로픽 임계값(tropic threshold)은 이미지 히스토그램을 기반으로 강도 신호 레벨을 선택하며, 이 임계값보다 강도가 높은 픽셀만 검은색 배경의 흰색 이미지 선택 프로세스에 표시됩니다. 그런 다음 smooth를 클릭하십시오. 이 단계는 이미지의 픽셀화된 가장자리를 부드러운 가장자리로 변환하는 선택 프로세스입니다.그런 다음 binary를 클릭하고 Make binary를 선택합니다. 이미지가 흰색 배경에 검은색으로 표시됩니다. 복제된 이미지에서 다음 단계를 수행하려면 analyze를 클릭하고 analyze particles를 선택하십시오. 그런 다음 show outlines를 선택하고 summarize를 클릭합니다.나머지 설정은 기본값으로 유지하십시오. 이 기능은 신호가 있는 전체 픽셀 수와 신호가 있는 픽셀들이 함께 그룹화된 전체 표면적을 인식합니다. 또한 픽셀 그룹의 수와 평균 크기가 보고됩니다.가장 잘 조정되었으며 총 면적이 가장 넓은 슬라이스를 비교하여 선택하십시오. 선택된 슬라이스는 표시됩니다. 총 alpha synuclein 표면적, inclusion 수 및 평균 입자 크기가 포함된 데이터 표를 복사하십시오.데이터를 Excel 스프레드시트에 붙여넣거나 다른 곳에 기록하십시오. Fiji로 돌아갑니다. beta tubulin 채널에서 이전에 선택한 슬라이스를 찾아 선택하십시오.신경절 영역을 선택하고 analyze를 클릭하십시오. 그런 다음 measure를 선택하십시오. 그러면 신경절의 총 표면적이 표시되는 또 다른 표가 나타납니다.표의 데이터를 alpha synuclein 측정값 근처의 Excel 스프레드시트로 추출하거나 Excel을 사용하여 다른 곳으로 복사하십시오. ganglion 표면적으로 alpha synuclein 측정에서 얻은 서로 다른 파라미터들을 나누어, 장신경계에 국소적으로 작용하는 rotenone의 효과를 분석하기 위해 ganglion 크기로 정규화된 총 alpha-synuclein 표면 및 inclusion 수를 구하십시오. 1세 된 C 57 black six 마우스에 살충제인 rotenone 5 mg/kg을 경구 투여하였습니다. 여기에 표시된 크로마토그램은 투여 1시간 후 rotenone 피크의 존재를 보여줍니다. 대조군 마우스는 20 mg/kg의 rotenone과 5 mg/kg의 rotenone으로 처리되었습니다.여기에 표시된 바와 같이 HPLC를 통해 혈액, 뇌 및 뇌줄기 추출물의 rotenone 수치를 측정하였습니다. 5 mg/kg의 rotenone을 경구 투여했을 때, HPLC로 측정한 결과 투여 1, 2 또는 3시간 후의 혈액 내 수치는 측정 가능한 수준으로 나타나지 않았습니다. 이 그래프는 처치된 마우스의 뇌와 뇌줄기 내 rotenone 수치를 보여줍니다.kg당 10mg 이하의 rotenone을 추출물과 함께 투여한 지 1시간 후, 뇌 또는 뇌줄기 샘플에서 rotenone 수치가 검출되지 않았습니다. 투여 1시간 후, 1.5개월 동안 처리된 마우스의 근육 및 뇌 샘플에서 미토콘드리아 complex I 활성을 평가하였습니다. 그룹 간에 유의미한 차이가 없었으며 미토콘드리아 complex I의 억제가 나타나지 않았으므로, 해당 부위에 rotenone이 없었음이 확인되었습니다.rone 투여 후 파킨슨병의 루이 소체 성분인 alpha synuclein을 분석하면, alpha synuclein의 총 표면 양, alpha synuclein 봉입체의 존재 여부 및 세포 내 alpha synuclein 패턴을 신뢰성 있게 결정할 수 있습니다. 이 그림은 여기에서 볼 수 있듯이 십이지장 및 회장 절편의 anti beta three tubulin, alpha synuclein 및 DAPI 염색 결과를 보여줍니다. 1.5개월 동안 roach known으로 처리했을 때, 3개월 대조군과 비교하여 장 신경계 신경절 내에서 alpha synuclein의 점상 패턴이 증가한 것이 확인되었습니다.이러한 패턴은 회장과 십이지장 모두에서 관찰될 수 있습니다. 3개월의 처리 후, anti alpha synuclein을 이용한 면역 형광 염색 결과 더 큰 alpha synuclein 봉입체의 형성이 확인되었으며, theof, flavin 및 DPI를 이용한 염색에서는 3개월 시점에서만 더 큰 alpha synuclein 응집체의 집적이 나타났습니다. 이 실험은 자동 분할 및 엔트로피 기반 임계값 설정법을 사용하여 분석되었습니다.왼쪽 그래프에서 각 열은 신경절 표면 대비 총 alpha synuclein 표면을 나타냅니다. 오른쪽 그래프에서 각 열은 채취한 신경절 표면당 alpha synuclein 봉입체의 총 개수를 나타냅니다. 종합하면, 이러한 데이터는 rotenone의 국소 투여가 장신경계 신경절에서 gliosis와 함께 alpha synuclein의 인산화, 축적 및 응집을 유도함을 시사합니다. 숙련된 경우, 정확하게 수행한다면 동물 한 마리당 1분 내에 이 기술을 완료할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때는 가바주(gavage)를 부드럽게 삽입하는 것이 중요하며, 장애물이 느껴질 경우 이를 제거한 후 다시 절차에 따라 삽입하는 것이 좋습니다. HPLC, 면역 염색 및 이미지 분석과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다. 이를 통해 다른 부위를 분석하거나, 물질의 효과, 또는 투여 후 혈액 내 물질의 존재 여부를 분석할 수 있습니다.이 기술은 신경과학자들이 장 신경계에 미치는 환경 신경독소의 영향을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 게이지를 올바르게 적용하고 면역화학 분석을 통해 얻은 이미지를 분석할 수 있어야 합니다. 부패한 시료를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.따라서 본 절차를 수행하는 동안 장갑과 마스크를 착용할 것을 권장합니다.

oral-administration-rotenone-using-gavage-image-analysis-alpha

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 신경 염증을 유도하기 위해 알파-시누클레인 피브릴을 마우스에 주입하는 방법을 보여줍니다. 원섬유는 돌연변이된 알파-시누클레인 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에 복강내로 주입됩니다. 중추신경계에 도달하면, 원섬유는 뉴런으로 들어가 돌연변이된 단백질의 응집을 유도합니다. 응집체는 인접한 뉴런, 미세아교세포 및 성상세포로 퍼집니다. 응집체의 인식은 미세아교세포를 유발하여 신경 염증을 유발하여 뉴런을 손상시킵니다.

알파 Synuclein 섬유의 주입을 통해 쥐에 있는 neuroinflammation의 감응작용

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

이 원고는 바이러스 벡터 매개 국소 유전자 전달이 어떻게 중추 신경계에서 전이 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공하는지 설명합니다.  이 프로토콜은 파킨슨병에 대한 바이러스 벡터 기반 동물 모델을 개발하기 위해 쥐의 흑질에 바이러스 벡터 주입을 수행하기 위한 모든 중요한 단계를 설명합니다.

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

이 기사에서는 7점 득점 시스템을 사용하여 C. elegans의도파민성 뉴런 원간 형태에 대한 변경 사항을 일관되게 정량화하는 방법을 소개합니다. 이 시스템은 유전, 화학 및 신경 퇴행성 질환의 노화 기반 모델을 활용한 도파민성 신경 변성 분석의 분석을 위한 것입니다.

Caenorhabditis elegans에서 도파민인체학 뉴런 형태 학적 변경 및 변성의 수준을 정량화

이 연구는 파킨슨 병의 전임상 모델에서 신경 염증, 신경 변성 및 운동 장애를 유도하는 데 필요한 벡터 용량과 노출 시간을 분석합니다. 인간 α시누클레인을 코딩하는 이들 벡터는 파킨슨병과 관련된 시누클레인 병리를 재분석하기 위해 흑질로 전달된다.

인간 α-시누클레인을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터에 의해 유도된 파킨슨병 마우스 모델 분석

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 편리한 중력 공급 관류 방법이 제시된다. 인산화된 α시누클레인의 면역형광 검출은 파킨슨병의 마우스 모델에서 입증된다. 이 연구는 또한 심질 관류, 해부, 조직 동결 / 임베딩 및 냉동 절개 단계를 포괄적으로 설명합니다.

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

본 프로토콜은 α-synuclein 응집체의 비강 내 투여 방법을 설명합니다. 이 방법은 파킨슨병에서 후각 점막에서 후각구까지 α-synuclein 전파에 대한 통찰력을 제공합니다.

α-Synuclein 응집체의 비강 내 투여 기법

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

학습하세요 로테논 경구 투여로 장용 신경계에서 알파-시누클레인 축적을 유도하는 방법을. 이 기법은 파킨슨병 병태생리학 연구와 신경독성 메커니즘 규명에 필수적입니다.

장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

더 많은 동영상 탐색