장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

운동 기능 및 언어 기능 장애를 포함한 파킨슨병의 증상은 뇌에서 도파민 분비 세포의 활동이 감소한 결과입니다. 장 신경계와 후각구는 가장 많이 노출되는 신경계이며 가장 먼저 영향을 받는 신경계입니다. 파킨슨병은 살충제 노출과 관련이 있습니다.

장 신경계에 대한 살충제의 영향을 분석하기 위해 살충제 룬을 구강 위장으로 마우스에 투여합니다. 그런 다음 마우스는 4%paraform, 알데히드 뇌 및 장 신경계로 관류된 심장 내입니다. 조직을 추출, 준비하여 PD 관련 단백질에 대한 면역 염색

컨포칼 현미경 검사법에 의해 취득된 beta 3 tubulin와 알파 synuclein 심상은 농약에 의하여 드러낸 동물에 있는 장 신경계 신경 세포 안쪽에 알파 synuclein의 축적을 설명합니다. 로테논의 전신 투여와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 로테논의 효과가 장 신경계에 국한된다는 것입니다. 이 방법은 파킨슨병의 병인과 진행의 기저에 있는 메커니즘과 같은 파킨슨병의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 새로운 치료 표적 및 진단 방법의 개발을 허용하기 때문에 타워 요법 및 파킨슨병 진단을 확장합니다. 이 방법은 파킨슨병의 병태생리학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 장, 교감 신경계 및 부교감 신경계와 장 벽에 대한 다른 환경 독소의 영향 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 개비지를 마스터하는 데 시간이 걸리기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

제가 이러한 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 것은 살충제와 파킨슨병의 연관성에 대해 읽었을 때였습니다. 2005년 베를린에서 열린 세계 파킨슨 학회(World Parkinson Congress)에서 높은 CORAs 컨퍼런스를 보는 것도 도움이 되었습니다. 이 방법의 평화적 시위가 필요합니다.

쥐는 반대편에 있는 인간과 다른 해부학적 구조를 가지고 있기 때문에 gavage를 관리하는 방법은 어려우며, 이미지 분석은 이러한 이미지에 대한 맞춤형 단계로 수행되었습니다. 동물의 무게를 잰 것으로 프로토콜을 시작합니다. 로테논의 적정 부피를 계산하십시오.

동물 체중 1g당 0.01밀리리터가 필요하며, 이는 1kg 루온 1kg당 5밀리그램에 해당합니다. Roone 용액으로 1ml 주사기를 충전한 다음 차량 용액으로 두 번째 주사기를 충전하십시오. 마우스를 들고 한 손으로 마우스의 꼬리를 잡습니다.

다른 손의 처음 두 손가락으로 목의 피부를 잡아당겨 목의 피부를 늘립니다. 머리가 두 손가락 사이에 고정되면 손바닥에 기대어 거꾸로 뒤집습니다. 꼬리를 고정합니다.

네 번째와 다섯 번째 손가락을 사용하여 머리를 뒤쪽으로 유지하고 입천장을 눌러 마우스의 입을 엽니다. 간을 부드럽게 입에 넣습니다. 전체 길이가 삽입될 때까지 위 방향으로 간을 천천히 움직입니다.

물질이 폐에 들어가는 것을 방지하기 위해 색전을 부드럽게 눌러 루온 용액 또는 차량을 투여하십시오. 완료되면 천천히 간을 추출하고 한 케이지의 모든 동물이 완료 될 때까지 동물을 다른 케이지에 다시 놓습니다. 치료 후 마우스는 4%의 파라폼 알데히드가 풍부하게 함유된 심장 내입니다.

PBS에서는 해부를 통해 내장을 추출하고 하룻밤 동안 15%자당에 넣습니다. 다음날, 조직을 30% 자당으로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 다시 배양합니다. 그런 다음 조직을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣고 저온 유지 장치 20미크론 장을 사용하여 사용할 때까지 보관합니다.

단면은 rost 슬라이드, 차단 및 면역 염색 절차로 전달됩니다. 그런 다음 안티 베타 3 튜불린 및 안티파 시누클레인 항체를 사용하여 항체를 수행합니다. 외부 사용자가 데이터에 대한 블라인드 분석을 수행하는 것이 좋습니다.

분석을 시작하려면 피지 소프트웨어를 엽니다. 컨포칼 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 가능한 한 각 채널에서 독립적으로 작업할 수 있도록 채널을 분할합니다.

사용하지 않을 채널을 닫고 픽셀 크기를 선택, 분석, 설정, 크기 조정 및 1로 설정합니다. 알려진 거리를 0.13으로 설정하고 전역을 클릭합니다. 이제 이미지의 크기가 미크론 단위로 표시됩니다.

알파 시누클레인 채널을 선택하고 신경절을 선택합니다. 선택 영역이 모든 절편에서 신경절을 둘러싸고 있는지 확인합니다. 신경절이 선택된 이미지를 복제하면 신경절 크기의 이미지만 복제됩니다.

편집 클리어를 누르면 이미지 외부 영역이 검게 변합니다. 이미지를 다시 복제하여 절차가 얼마나 잘 진행되었는지 확인합니다. 신호 대 배경 노이즈 비율이 낮은 이미지는 이미지 분석에 사용해서는 안 됩니다.

이미지 조정 임계값을 선택합니다. 그런 다음 최대 엔트로피를 선택합니다. 그런 다음 자른 이미지의 슬라이스와 원본 이미지 위로 이동하여 절차가 잘 진행되었는지 확인합니다.

트로픽 임계값은 이미지 히스토그램을 기반으로 강도 신호 레벨을 선택하며, 이 임계값보다 강도가 높은 픽셀만 검은색 이미지 선택 프로세스 위에 흰색으로 표시됩니다. 그런 다음 부드럽게를 클릭합니다. 이 단계는 이미지의 픽셀화된 가장자리를 부드러운 가장자리 선택 프로세스로 변환합니다.

그런 다음 바이너리를 클릭하고 바이너리 만들기를 선택합니다. 이미지는 복제 된 이미지에 대해 다음 단계를 수행하고 분석, 입자 분석을 클릭하기 위해 흰색 이미지 복제 위에 검은 색으로 표시됩니다. 그런 다음 개요 표시를 선택하고 요약을 클릭합니다.

나머지 설정은 기본값으로 두어야 합니다. 이 함수는 신호가 있는 픽셀의 총 수와 신호가 있는 픽셀의 총 표면을 함께 그룹화한 픽셀을 인식합니다. 또한 픽셀 그룹의 수와 평균 크기가 보고됩니다.

잘 조정되는 전체 영역이 가장 큰 슬라이스를 비교하고 선택합니다. 슬라이스가 표시됩니다. 총 알파 synuclein 표면, 개재물 수 및 평균 입자 크기가 있는 데이터 테이블을 복사합니다.

데이터를 Excel 스프레드시트에 붙여넣거나 다른 곳에 주석을 추가합니다. 피지로 돌아갑니다. 베타 튜불린 채널에서 이전에 선택한 슬라이스를 찾아 선택합니다.

신경절 영역을 선택하고 분석을 클릭합니다. 그런 다음 측정을 선택합니다. 신경절의 전체 표면을 보여주는 또 다른 표가 나타날 것입니다.

테이블에서 알파 시누클레인 측정 근처의 Excel 스프레드시트로 데이터를 추출하거나 Excel을 사용하여 다른 곳에 복사합니다. 알파 시누클레인 측정에서 얻어진 상이한 매개변수를 신경절 표면에 의해 얻어진 총 알파-시누클레인 표면 및 개재물을 구하여 신경절 크기에 의해 정규화된 총 알파-시누클레인 표면 및 개재물 수를 구하고, 장 신경계에 국소적으로 작용하는 루온의 영향을 분석하기 위해, 알려진 살충제 부패의 킬로그램 당 5밀리그램을 1세 된 C 57 블랙 식스 마우스에게 구강 배당에 의해 투여하였다. 여기에 표시된 크로마토그램은 로테논 10kg 당 20 밀리그램 및 로테논 1kg 당 5 밀리그램으로 처리 된 마우스를 투여 한 지 1 시간 후에 알려진 로탄 피크의 존재를 보여줍니다.

로테논 수치는 여기에 나타난 바와 같이 HPLC에 의한 혈액 및 뇌 및 뇌간 추출에 대해 결정되었습니다. 구강 배당에 의한 썩은 썩은 물 1kg당 5mg을 투여하면 치료 후 1시간, 2시간 또는 3시간 후 H plc에 의해 측정된 혈액 내 측정 가능한 수치가 나타나지 않습니다. 이 그래픽은 치료된 쥐의 뇌와 뇌간의 부패 수준을 보여줍니다.

킬로그램당 10mg 이하의 로테논을 추출한 후 1시간 후에 뇌 또는 뇌간 샘플에서 로톤 수치가 나타나지 않습니다. 미토콘드리아 복합체를 투여한 지 1시간 후, 1.5개월 처리된 마우스의 근육 및 뇌 샘플에서 하나의 활성을 평가했습니다. 미토콘드리아 복합체 1의 억제를 보이지 않는 그룹 간에 유의미한 차이는 없었으며, 따라서 이 영역에는 rone이 없었음을 확인합니다.

파킨슨병의 분석, 론의 투여 다음 루이소체 성분 알파 시누클레인의 분석은 알파 시누클레인의 총 표면 양, 알파 시누클레인 함유물의 존재 및 세포의 알파 시누클레인 패턴의 신뢰할 수 있는 결정을 가능하게 합니다. 이 그림은 여기에서 볼 수 있듯이 십이지장 및 회장 절편에서 항 베타 3 튜불린, 알파 시누클레인 및 DAPI 염색을 보여줍니다. 알려진 바퀴벌레를 가진 1.5 달 처리는 장 신경계 신경절 안쪽에 증가한 알파 synuclein 반점 본을 유도했다, 3 달 대조와 비교된 1개 조차.

이 패턴은 회장과 십이지장 모두에서 볼 수 있습니다. 3 달 후에 더 큰 알파 synuclein 포함의 대형은 반대로 알파 synuclein, theof, flavin를 사용하여 면역 형광 염색을 볼 수 있고, DPI는 3 달에서만 더 큰 알파 synuclein 축적의 응집을 설명합니다. 이 실험은 자동 분할 및 엔트로피 기반 임계값 방법을 사용하여 분석되었습니다.

왼쪽 그래프에서, 각 열은 신경절 표면까지의 총 알파 시누클레인 표면을 나타냅니다. 오른쪽 그래프에서, 각 열은 취해진 신경절 표면당 알파 시누클레인 내포물의 총 수를 나타냅니다. 이러한 데이터는 로테논의 국소 투여가 장 신경계 신경절에서 알파 시누클레인 인산화, 축적 및 신경교증을 동반한 응집을 유도한다는 것을 시사합니다.

이 절차를 시도하는 동안 개비지를 부드럽게 도입하는 것이 중요하며, 장애물이 발견되면 이 절차에 따라 제거하고 다시 도입하는 것이 좋습니다. HPLC, 면역 염색 및 이미지 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 다른 영역, 물질의 영향 또는 발달 후 혈액 내 물질의 존재를 분석 할 수 있습니다.

이 기술은 신경과학자들이 장 신경계에 대한 환경적 신경독의 영향을 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 게이지를 올바르게 적용하고 면역화학에서 얻은 이미지를 분석할 수 있을 것입니다. 썩은 것으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. 그만큼.