대기압에서 질량 분석법에 의해 단일 ​​세포의 직접 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 살아있는 세포의 내용을 방출하고, 방출된 생체 분자를 이온화하여 대기압 상태의 질량 분석기로 분석하는 것입니다. 이는 원거리 현미경을 통해 단일 세포를 선택하고, 끝을 날카롭게 가공한 광섬유를 통해 전달되는 2.94 $\mu\text{m}$ 파장의 레이저 펄스로 선택된 세포를 어블레이션(ablation)함으로써 달성됩니다. 단일 세포의 어블레이션은 중성 입자 물질로 이루어진 미세한 플룸(plume)을 형성하며, 이 어블레이션 플룸을 이온화하게 됩니다.

이는 전기 분무에 의해 포착됩니다. 분무에서 발생한 전하 띤 액적들은 세포에서 유래된 어블레이션 플룸의 입자들과 응집됩니다. 그 결과 생성된 액적들에는 세포 유래 분자들이 포함되며, 이로부터 관련 이온들이 생성됩니다.

단일 세포의 질량 분석 스펙트럼 결과가 도출되었습니다. 이 스펙트럼에는 세포의 대사체 및 지질과 관련된 수많은 피크가 포함되어 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지 워싱턴 대학교 화학과 Verese 연구실의 Bin Drester 박사입니다.

오늘은 대기압 질량 분석법을 이용한 단일 살아있는 세포의 직접 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 단일 식물 및 동물 세포의 대사체와 지질을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

레이저 절제-전기분무 이온화 질량분석법(laser ablation electro spray ionization mass spectrometry) 또는 LAESI-MS는 2.94 µm 파장의 5 ns 레이저 펄스에 의해 수행됩니다. 본 연구의 절제 공정에는 네오디뮴 YAG 레이저로 구동되는 가변 파장 광파라메트릭 발진기(tunable optical parametric oscillator)가 사용되었습니다.

먼저 식각된 광섬유 끝단을 마이크로 조작기에 장착하고 이를 세포 표면에 가깝게 가져옵니다. 효율적인 에너지 전달을 위해, 식각되지 않은 광섬유 끝단은 광학 정렬용 베어 파이버 척(bare fiber chuck)으로 고정합니다. 파이버 척은 5축 이동대에 장착되어 있습니다.

평볼록 칼슘 플루오라이드 렌즈 또는 무반사 코팅된 아연 셀레나이드 렌즈를 사용하여 빔을 에칭되지 않은 끝단에 집중시킴으로써 레이저 에너지를 광섬유에 결합합니다. 보호 처리된 금 거울을 사용하여 중적외선 레이저 빔을 집속 렌즈로 유도하십시오. 날카롭게 가공된 광섬유 팁과 세포 표면 사이의 거리를 유지하기 위해, 표면으로부터 측정된 15~30도 각도로 설치된 장거리 비디오 현미경을 사용합니다. 이 시스템은 또한 모니터링 및 이미지 캡처를 위해 CCD 카메라가 장착된 5배 무한 보정 대물렌즈로 구성됩니다.

두 번째 비디오 현미경이 샘플 표면에 수직으로 설치되어 세포를 상단에서 시각화하고 분석할 세포를 선택하는 데 사용됩니다. 이 시스템은 절제 및 분석을 위해 선택된 세포 위로 파이버 팁을 정렬할 수 있도록 시각적 피드백을 제공합니다. 이 시스템은 10배 무한 보정 장작동 거리 대물렌즈와 7배 정밀 줌 광학 피터 및 CCD 카메라로 구성되어 있습니다.

전기 분무 시스템은 전도성 perfluoro elastomer 페룰 피팅, 튜빙, 슬리브 니들 포트, 그리고 FU 실리카 튜빙이 포함된 금속 유니온을 사용하여 구성되었습니다. 권장되는 이미터는 스테인리스 스틸 재질이며 50 µm 직경의 테이퍼 팁을 가지고 있습니다. 전기 분무를 위해 0.1% acetic acid가 포함된 50% methanol 용액을 준비하십시오. 시린지 펌프를 사용하여 용액을 분당 200 to 300 nL의 속도로 펌핑하십시오.

500 µL 시린지를 사용하여, 조절된 전원 공급 장치를 통해 금속 유니온에 2,803,000 V 사이의 고전압을 인가합니다. 안정적인 전기 분무를 생성하려면 모든 전기 연결이 확실하고 차폐재로 보호되었으며 적절히 접지되었는지 확인하십시오. 노출된 고전압에 직접 접촉하면 전기 충격을 받을 수 있습니다. 적절한 소스로부터 생체 조직 또는 세포 샘플을 확보하고, 분석 전까지 권장 사항에 따라 보관하십시오.

본 시연에 사용된 allium seper 구근은 지역 상점에서 구입하였습니다. allium seper 구근 시료를 준비하기 위해, 외과용 메스로 구근을 세로 방향으로 절단하여 양파 구근의 인편에서 약 2cm² 크기의 조각을 절취합니다. 그 다음, 내표피 조직의 온전한 단층을 벗겨냅니다. 표피의 젖은 표면을 이용하여 세척된 유리 현미경 슬라이드 위에 조직을 고정합니다.

위치 조정을 위해 3축 이동 스테이지에 장착된 범용 플레이트 홀더로 슬라이드를 고정합니다. 세포 분해를 방지하기 위해 샘플을 장착한 직후 질량 분석 스펙트럼을 획득하십시오. 먼저 레이저, 전기 분무 장치 및 질량 분석기를 켭니다.

어블레이션 지점과 전기 분무 이미터의 위치를 서로에 대해, 그리고 질량 분석기의 오리피스에 대해 조정하여 레이저 이온원의 기하학적 구조를 최적화하십시오. 최대 이온 강도를 얻으려면 상단 뷰 시각화 시스템을 사용하여 분석하고자 하는 세포를 선택하십시오. 선택 후, 샘플 스테이지를 이동시켜 선택한 세포가 광섬유의 날카로운 팁 바로 아래에 오도록 배치하십시오.

측면 뷰 현미경을 사용하여 팁과 세포 표면 사이의 거리를 약 20 microns로 재조정합니다. 에칭된 섬유 팁을 통해 선택한 세포에 레이저 펄스를 조사하여 정확한 위치를 잡습니다. 이를 통해 세포벽에 천공이 생기며 세포질이 입자 형태로 방출됩니다.

전기 분무에 의한 이온화 후, 생성된 이온은 질량 분석계에 의해 수집되며 질량 스펙트럼이 기록됩니다. 데이터 수집이 완료되면 레이저, 전기 분무 장치 및 질량 분석계를 대기 모드로 전환하거나 전원을 끕니다. 광학 현미경으로 선택적 관찰을 하기 위해 절제된 allium cper 조직 샘플을 보관하십시오. 단일 세포의 절제가 성공적으로 이루어지면 세포벽이 파열되고 명확한 질량 스펙트럼이 수집됩니다.

다음은 대표적인 광학 현미경 이미지와 함께 allium SEPA 구근의 단일 내포 표피 세포에 대한 lazy MS 분석 결과입니다. 세포 샘플링 후 세포벽에 구멍이 뚫리며, 이러한 천공의 범위는 인접 세포와의 경계에 의해 제한됩니다. 인접한 세포들은 손상되지 않은 상태로 보입니다.

세포에서 생성된 대표적인 레이저 질량 분석 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다. 세포당 Allium sea로부터 매우 다양한 이온들이 검출되었으며, 정확한 질량, 동위원소 분포 패턴 및 탠덤 질량 분석 스펙트럼을 바탕으로 이온들을 내인성 대사물질로 세심하게 할당하였습니다. 단일 세포에서 검출된 이온들은 여러 세포를 대상으로 한 기존의 레이저 MS를 통해 동일 조직을 분석했을 때 관찰된 이온들과 유사했습니다.

지금까지 대기압 질량 분석법을 이용해 단일 살아있는 세포를 분석하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 4등급 적외선 레이저에 우발적으로 노출되는 것을 방지하기 위해 반드시 보호 안경을 착용해야 한다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.