Name: 에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에 종양 이미징 및 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 배우세요 면역 적격 마우스를 이용한 묽은 난소암의 정위 모델 구축 및 생체내 이미징 방법을. 이 기법은 종양 미세환경 연구와 면역 반응 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH 부여 P01 AI 068,730 (SNC, NS), NIH 부여 CA016520 / TAPITMAT (NS), Claneil 재단 (NS)에서 민간 자금 및 FCCC 및 펜실베니아 대학에 난소 포자 부여 (지원했습니다 P50 CA83638)와 폭스 체이스 암 센터 코어 그랜트 (P30 CA06927) (DCC). 저자는 펜실베니아 암 대학에서 박사 G. Danet - 데스노여스 감독 줄기 세포 및 이종 이식 코어에서 펜실베니아, 안토니 Secreto 대학에서 박사 EJ Delikatny 감독 광 / Bioluminescence 핵심 시설의 우수 기술 지원을 감사합니다 수술에 도움을 위해 펜실베니아 / OCRC 대학에서 orthotopic 분사 기술과 Denada Dangaj에 훈련 SNC 센터.

1. 세포 배양 <ol><li> orthotopic 사출, 문화 T175 플라스크에 DR26 종양에서 파생된 MOV1 캣 세포는, 그들의 90 %까지 합류하기 전에. 1 또는 2 T175 flasks 필요합니다 주입 당 1-5000000 세포를 이용할 계획입니다. </li><li> 주사 당일, 세포를 수확하고 hemocytometer를 사용하여 휴대폰 번호를 확인합니다. </li><li> 일단 세포 농도는 실온에서 300 X g에서 5 분간 원심 분리하여 세포 펠릿, 결정되었습니다. </li><li> 스핀에 따라, 0.002 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 멸균 PBS 10 microliters 1 만달러에 전지를 resuspend </li></ol> 2. 사전 외과 <ol><li> 이전 수술, PBS EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 microliters에서 1,000,000 MOV1 - 캣 전지와 3/10cc 인슐린 주사기를 입력합니다. </li><li> 가열 패드에 isofluorane anesthetized 마우스를 전송합니다. 눈 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 추가합니다. 그런 다음, 즉시 수술 내내 마취를 제공하기 위해 isoflurane 기화기에 연결된 코 콘 시스템에 동물의 머리를 삽입합니다. </li><li> 알코올 면봉으로 주입 사이트의 소독 후, subcutaneously 3/10cc 인슐린 주사기와 함께, 5 MG / 케토프로펜, 사전 수술 진통제의 kg을 주입. </li><li> 가위를 사용하여 동물의 꼬리의 기본에 thoracolumbar 교차점에서 dorsum의 왼쪽 꼬리 부분을 면도. 완전히 머리를 제거하는 제모 크림을 적용합니다. 그런 다음, 젖은 종이 타월로 여분을 제거합니다. </li><li> 머리가 삭제되면, povidone - 요오드와 알코올 면봉으로 면도 영역을 소독. 그런 다음, 절개의 주변 외과 드레이프를 놓으십시오. </li></ol> 3. 외과 <ol><li> 그냥 수술 전에 1.5 %에 isoflurane 기화기 수준을 조정합니다. </li><li> 동물이 발을 패드 곤란하여 완전히 anesthetized되었는지 확인합니다. </li><li> 다음, 피부에서 비장을 찾습니다. 다음 외과 가위를 사용하면, 비장의 오른쪽 상단에있는 1~2센티미터 길이 dorsolateral 절개합니다. </li><li> retroperitoneum을 해부하다. 마우스 난소를 둘러싼 패드가 관찰됩니다. 마우스 난소를 둘러싼 지방 패드를 파악하고 노출 곡선 집게를 사용하십시오. </li><li> 멸균 PBS의 일부 방울과 수화물 기관. </li><li> 주사에 대한 난소를 파악 철회 ... 위치를 ... 그리고 안전하게 곡선 포셉를 사용하여 </li><li> 단단히 포셉과 난소를 쥐고 있지만, 난소에 MOV1 캣 종양 세포의 10 microliters을 주입. 회사 범위는 유체 병리 현상이나 누설을 방지할 수 있습니다. </li><li> 즉시 주사 다음, 포셉에 의해 끼쳤다 긴장을 풀어주고있다. 난소의 천공은 저절로 취소 및 종료해야합니다. </li><li> 바늘에 연결된 흡수성 Polyglycolic의 산성 봉합사를 사용하여 복고풍 - 복막 상처를 닫습니다. </li><li> 코 콘에서 동물을 놓습니다. </li><li> 피부를 스트레칭하고 조직 접착제의 몇 방울로 dorsolateral 상처 가장자리를 밀봉. </li><li> 마지막으로, 구두로 동물에 항생제 100 microliters을 관리할 수 있습니다. 그런 다음 복구에 대한 케이지와 모니터에 다시 놓으십시오. 일주일 동안 식수의 항생제에 쓰레기야. </li></ol> 4. 생체내 이미징에서 <ol><li> 일주일 MOV1 캣 종양 세포의 orthotopic 주사 후 생체내 이미징에서 수행합니다. 이미지 실로 isofluorane anesthetized 마우스를 전송하여 시작합니다. </li><li> 아래 2 % isoflurane 기화기 수준을 돌립니다. </li><li> 이미징 시스템 제조 업체의 지침에 따라 생체내 이미징에서 수행합니다. 이 비디오에서 루미나 시스템이 사용됩니다. </li><li> 이미지, 생활 이미지 소프트웨어 데스크톱 아이콘을 클릭하십시오. 그런 다음 IVIS 수집 제어판에서 "초기화"를 선택하십시오. 악기 설정은 카메라 설정에 유사한 아르 </li><li> 인수 제어판에있는 악기의 인수 매개 변수를 설정합니다. 형광 들어, "형광"을 선택하십시오. 각각의 이미지 사진을 취득 사진 상자를 클릭합니다. </li><li> 다음, 자동으로 노출 시간을 설정합니다. "픽셀 비닝 또는 CCD 해상도"에서 "보통"을 확인하십시오. 그런 다음 F / 중지하거나 개구에서, 2의 가치를 확인하십시오. 다음, 535 여기 필터와 DsRed 방출 필터를 선택합니다. </li><li> 보기의 분야에서, 이미지 하나의 마우스를보기 B를 클릭하십시오. </li><li> 그런 다음, 이미지 수집을 시작하기 위해 취득을 클릭하십시오. </li><li> 이미지 수집이 완료되면, 관심 지역, 또는 투자 수익 (ROI), 신호의 측정 도구를 사용하십시오. 신호 가치와 영역을 해제하기 위해 측정 아이콘을 클릭합니다. </li><li> 마지막으로, 사용자 폴더에 이미지를 저장하려면 "저장"을 클릭하십시오 </li><li> 이미지가 저장되고 나면, isoflurane의 관리를 중지하고 그 새장에 마우스를 반환합니다. 마우스가 즉시 일어나해야합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 - 사용이 프로토콜을, orthotopic 난소암의의 생체내 성장은 비침습 절차를 사용하여 적어도 3 주 동안 모니터링할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2146/2146fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 대조군으로 MOV1 캣 세포, 또는 PBS는 orthotopically. 이외의 종양 발생하기 쉬운 생쥐 (각각 오른쪽과 왼쪽 동물 동물과)의 난소에 주입했다 생체내 이미징에서 2 주 후에 실시되었다. 난소에 engrafted MOV1 캣 세포에 의해 생성된 형광 방출을 측정하고 대조군 마우스에서 해당과 비교했다. <img src="/files/ftp_upload/2146/2146fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. MOV1 캣 난소 종양의 냉동 섹션은 mAb가 종양 침투 lymphocytes (검은색 화살표)를 감지하는 DAB 기판 (어두운 갈색) 다음 biotinylated 방지 CD4 물들일되었습니다. 세포는 세포 핵 (파란색)를 시각화하는 메틸 녹색과 counterstained되었습니다. 종양 세포는 (빨간색 화살표) T 세포에서 morphologically 뚜렷한되었습니다. 슬라이드 40x 확대 나타납니다.

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<li>Milne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+immune+infiltrates+in+high-grade+serous+ovarian+cancer+reveals+CD20%2C+FoxP3+and+TIA-1+as+positive+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors.</a> , (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

수술과 주사 Orthotopic 난소 부르사에서 Orthotopic 주입은 교육 및 정밀도를 요구합니다. 그러므로 <ol><li> 첫번째 시신과 함께 가난한 수술 경험, 연습의 경우. </li><li> 그들이 nulliparous 여성과 비교 주입 및 증가 생존을 용이하게 시간이 지남에 따라 더 큰 난소 개발에 우선적으로 multiparous 암컷을 (하나 또는 두 개의 새끼)를 사용합니다. </li><li> 마우스 난소 부르사의 작은 크기로 인해, 가장 작은 가능한 바늘 크기의 사용은 적극 권장합니다. </li></ol> 생체내 이미징에 <ol><li> 항상에 대한 참조를 사용하여 이러한 PBS의 1ml 100 μl에 10월 6일부터 10월 7일까지 MOV1 캣 세포로 가득 1.5 ML ependorf 관으로 형광. </li><li> 형광 배경을 줄이기 위해 알팔파없는 ...

<table><tbody><tr><td>DMEM-GLUTAMAX</td><td>Invitrogen</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Deltaphase</td><td>39 DP</td><td></td></tr><tr><td>포비돈 패드</td><td>Dynarex</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>알코올 솜</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>인공눈물 연고</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>17845-153</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3cc/인슐린 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Polyg Polyglycolic Acid 봉합사/바늘 (3/8 19mm)</td><td>Syneture</td><td>9612-31</td><td></td></tr><tr><td>조직 접착제</td><td>Vetbond</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>Vet Bactrim/ 경구 현탁액</td><td>Hi-tech Pharmacal</td><td>840823</td><td></td></tr><tr><td>IVIS-Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>J108013</td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청(FBS), Qualified</td><td>Invitrogen</td><td>10437036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>TurboFP635 포유류 벡터</td><td>Evrogen</td><td>FP721</td><td></td></tr><tr><td>T175 플라스크</td><td>cellstar</td><td>660-190</td><td></td></tr></tbody></table>

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 orthotopic 모델 생체내에</em종양 면역 응답> 종양 이미징 및 모니터링

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

배경 : 난소암은 일반적으로 케이스 / 사망자 비율이 높은 고급 단계에서 진단하기 때문에 미국 여성들 사이 1,2,3 모든 gynecologic malignancies의 가장 치명적인 유적이다. 장액의 종양은 난소암의 가장 광범위한 형태이며, 4,5 TG - MISIIR 태그 유전자 변형은 저절로 종양의 유형을 개발하는 유일한 마우스 모델을 나타냅니다. Mullerian 억제 물질 유형 II 수용체 (MISIIR) 유전자 프로 모터 6 제어하에 TG - MISIIR 태그 마우스 표현 SV40 변환 영역. 추가 형질 라인은 그 표현 SV40 태그 transgene을 확인하고 있지만, 난소 종양을 개발하지 않습니다. 비 - 종양 발생하기 쉬운 쥐들이 C57Bl / 6 마​​우스에 대한 일반적인 수명을 전시하고 비옥한 있습니다. 이 생쥐는 TG - MISIIR 태그 - DR26 생쥐에서 분리된 종양 세포에 대한 syngeneic allograft받는 사람으로 사용할 수 있습니다. 목표 : 종양 이미징 7 가능하지만, 깊은 종양의 조기 발견은 작은 생활 동물에 도전합니다. 장액의 난소암에 대한 immunologically 손상 동물 모델의 잠복기 연구를 활성화하기 위해, 우리는 생체내 이미징, 종양 microenvironment 및 종양 면역 반응의 연구에 허가 난소암의 유형에 대한 syngeneic 마우스 모델을 설명합니다. 방법 : 우리는 먼저 26주 된 DR26 TG - MISIIR 태그의 여성에 수확 자연 난소 종양에서 태그 + 마우스 암 세포주 (MOV1)을 파생. 그렇다면, 우리는 안정 Katushka을 인코딩 TurboFP635 Lentivirus 포유 동물 벡터, 여기 / 635분의 588 nm의 8,9,10에서 방출 맥시멈와 말미잘 Entacmaea quadricolor에서 적색 형광 단백질의 멀리 붉은 돌연변와 MOV1 세포 transduced. 우리는 orthotopically 아닌 종양이 발생하기 쉬운 TG - MISIIR 태그 여성 생쥐의 난소 11,12,13,14에서 MOV1 언니를 심었을 거예요. 종양 진행은 생체내 광학 이미징 및 종양의 microenvironment에 immunohistochemistry에 의해 분석되었다 다음되었다. 결과 : Orthotopically MOV1 캣 세포를 이식은 묽은 난소 종양을 개발했습니다. MOV1 캣 종양은 인간의 난소 암 15 (그림 2)에서 관찰, 최대 주입 후 3 주 (그림 1) 생체내 이미징에 의해 시각 될 수 있으며, leukocytes로 가득 차 있었다. 결론 : 우리는 깊은 조직의 산도 안정 높이 Katushka의 photostability에 의한 초기 종양의 생체내 이미징에 적합한 난소암의 orthotopic 모델을 설명합니다. 우리는 종양 면역 반응과 immunotherapies의 생체내 이미징 연구 및 모니터링을위한 장액의 난소암이 소설 syngeneic 모델의 사용을 제안합니다.

공부하기<em&gt; 생체내에</em&gt; 종양의 성장과 종양의 microenvironment, 우리는 면역 적격 동물 난소암의 syngeneic 및 orthotopic 마우스 모델을 사용합니다. 우리는 Katushka 형광 단백질 (MOV1와 마우스 종양 세포 라인 (MOV1)를 transduced<sup&gt; KAT</sup&gt;)와 우리가 난소 년에 orthotopic 주입을 표시하고<em&gt; 생체내에</em&gt; 이미지.

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에</em종양 면역 응답> 종양 이미징 및 모니터링

배경: 난소암은 일반적으로 사례/치명률 비율이 높은 진행된 단계에서 진단되며, 따라서 모든 ... 중 가장 치명적인 암으로 남아 있습니다.

난소암은 일반적으로 치명률이 높은 진행 단계에서 진단됩니다. 따라서 난소암은 미국 여성의 모든 부인과 악성 종양 중 가장 치명적인 질환으로 남아 있습니다. 본 연구에서는 생체 내 이미징과 종양 미세환경 연구가 모두 가능한 장액성 난소암의 동계 마우스 모델을 설명합니다.우리는 C nmy 유래 형광 단백질 kaka와 MIS two R tag를 발현하는 DR 26 형질전환 생쥐 유래 난소암 세포주를 안정적으로 형질 도입하였습니다. MOV one cat으로 명명된 이 세포들을 종양 발생 성향이 없는 TG MIS two R tag 형질전환 생쥐의 난소에 주입하여 형광성 장액성 난소암으로 성장 및 발달하도록 유도하였습니다. 이후 종양의 진행 상황을 모니터링하기 위해 생체 내 이미징(In vivo imaging)을 수행합니다.그 다음 난소를 절제하고 면역조직화학 염색을 수행하여 종양 미세환경을 분석합니다. 이 동물 모델은 기존의 유전적 모델에 비해 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 마우스에서 환자들에게 가장 빈번하게 나타나는 조직학적 유형인 인간의 장액성 난소암과 유사한 종양이 발생했습니다.두 번째로, 종양 세포는 형광 표지되어 있습니다. 따라서 생체 내(in vivo) 이미징을 통해 종양의 진행 과정을 추적할 수 있습니다. 세 번째로, 마우스가 면역 기능이 활성화된 상태이므로 숙주 백혈구의 종양 침윤을 연구할 수 있습니다.종합적으로, 이러한 특성들은 이 동물 모델을 전임상 연구에 이상적으로 만들었습니다. MU 및 억제 물질 2형 수용체(inhibiting substance type two receptor) 또는 tgm MIS S two R 태그의 전사 제어 하에 SB 40 대형 종양 항원을 발현하는 형질전환 생쥐는 Fox Chase Cancer Center의 Connelley와 Hamilton 박사에 의해 개발되었습니다. 암컷 tgm IS two R tag 생쥐는 인간의 장액성 난소암과 유사한 양측성 상피성 난소암을 자발적으로 발생시켰습니다.IS two R 프로모터는 SV 40 T 항원의 발현을 난소를 포함한 암컷 생쥐 생식관의 상피세포로 표적화합니다. 자궁과 수란관에서도 트랜스진 발현이 검출될 수 있지만, 종양은 오직 난소에서만 발생합니다. 독립적인 TG MIS two R tag 생쥐 라인들이 분리되었습니다.뚜렷한 표현형을 나타내는 이들 마우스는 tgm IS two R tag DR 26에서 트랜스진 발현을 특이적으

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

난소암의 Orthotopic 동물 모델은 더 나은 인간의 질병을 복제하기 때문에 암 진행 및 치료 종양 반응의 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 모델 루시페라제 - 표현 난소 종양 세포의 intrabursal 주사를 받게됩니다. 치료는 경구 gavage를 통해 관리합니다. 종양 성장에 의해...

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

이 비디오는 종양 발달 및 복막 전이를 연구하기 위한 쥐 실험 모델을 만들기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 난소암 모델은 인간 상피 난소암 세포를 암컷 마우스의 난소에 orthotopic 접종하여 생성됩니다.

쥐 난소에 난소암 세포의 정소성 접종: 세포의 복막 전파를 연구하기 위한 난소암 마우스 모델을 설정하는 절차

우리는 난소암의 성장과 재발을 감지, 정량화 및 모니터링할 수 있는 비침습적 동물 이미징 플랫폼을 설명합니다. 이 복막내 이종이식 모델은 난소암 환자의 임상 프로필을 모방합니다.

비 침습적 영상에 대한 생쥐 모델 검색 및 모니터 난소 암 재발

난소암 전이는 수많은 미만성 복강 내 병변을 특징으로 하기 때문에 종양 부담을 시각적으로 정확하게 정량화하는 것이 어렵습니다.  여기에서는 적색 형광 단백질(RFP) 표지 종양 세포 및 광학 이미징을 사용하여 전이성 종양 부담의 현장 및 생체 외 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

복강 내 난소 암 전이의 정량

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

원래 종양 개발의 쥐 실험 모델 및 복막 전이<em&gt;를 통해</em난소 암 세포에&gt; 동소 이식 접종

이 프로토콜은 암컷 C57BL / 6J 마우스의 종양 성장을 모니터링 뮤린 동소 방광 종양의 발생을 설명한다.

쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

여기서는 난소암의 암 진행, 전이 및 치료 반응을 연구하기 위한 복강내 및 점액내 종양 모델을 구축하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 또한, 이 모델들에서 루시퍼레이스 기반 비침습적 생체 내 영상을 사용하여 마우스의 종양 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

전이성 난소암과 마우스의 치료 반응 연구를 위한 임상적으로 적합한 이식 종양 모델

배우세요 면역 적격 마우스를 이용한 묽은 난소암의 정위 모델 구축 및 생체내 이미징 방법을. 이 기법은 종양 미세환경 연구와 면역 반응 분석에 활용됩니다.

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에 종양 이미징 및 모니터링

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