Name: 이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 배우세요 혈관내피세포에서 FRET 기반 근접 분석을 이용한 단백질-단백질 상호작용 이미징 방법을. 이 기법은 혈관신생 과정에서 수용체 상호작용을 연구하고 세포 표면에서의 신호전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 공촛점 현미경과 관련하여 도움이 박사 스콧 헨더슨을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 WAB 현미경으로 의학의 매시 암 센터 및 학교 (VCU) VCU - 도서관에서 공연되었다에서 WAB로 건강 1RO1CA127501 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라 파일럿 프로젝트 기금에 의해 지원되었다. 의 신경 생물학 및 NIHNINDS 센터 핵심 부여 5P30NS047463에서 자금 일부 지원 해부 현미경 시설,,,.

프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 포유류의 표현이 아미노 말기 CFP 및 / 또는 YFP의 monomeric 버전 벡터에만 간략하게 논의한다에 관심을 귀하의 유전자의 첫 번째 단계는 복제. 두 번째 및 세 번째 단계, EA.hy926 내피 세포에 벡터 DNA의 transfection과 초조와 공촛점 이미징은 아래에보다 심도있게 설명되어 있습니다. 1. CFP 및 YFP 키메라 수용체의 건설 관심 수용체는 CFP와 YFP의 monomeric 향상된 버전 아미노 말기 복제해야합니다. 안달의 결정은 경험이고 transmembrane이 지역을 걸치는하고 형광단 1 시작 사이의 링커의 길이에 따라 매우 달라집니다. 따라서, 링커의 여러 가지 길이가 조사를 받고 새로운 각 수용체의 쌍에 대한 탐색해야합니다. <ol><li> monomeric C 또는 YFP (이 벡터는 우리 실험실에서 얻을 수있다)이있는 pcDNA3.1 hygro R 또는 네오 R 벡터로, NheI / EcoRI 사이트에 관심을 귀하의 수용체를 복제. * 참고 - 필요한 경우, NheI가 SpeI 및 XbaI 포함한 호환 여러 효소이다. </li><li> 적절한 endA1 recA 능력 세포주 (우리가 정기적으로 Mach1 사용)로 결합 반응을 변환. 삽입의 존재를 화면 식민지는 DNA가 변이의 부재를 확인하는 순서로 따라갔다. </li><li> 성공적인 분자 복제의 형태를 취득시, Qiagen, 또는 그와 유사한, DNA 키트를 사용하여 소독 물 또는 TE에 transfection 학년 벡터 DNA를 준비합니다. UV 분광법을 사용하여 농도 및 순도를 평가합니다. DNA의 일반적인 수확량이 정기적으로 1 μg / μL의 작업 주식에 희석는 100-200 μg의 범위에 있어야합니다. </li></ol> 2. EA.hy 926 셀의 Transfection <ol><li> MatTek coverslip (제 0) 2 ML 매체로 35mm 요리에 완전한 - DMEM 재배 EA.hy 926 세포 4 (DMEM 10% 태아 소 혈청 + Pen. / Strep.) 분할. 당신은 conservatively 15cm 합류 요리에서 ~ 15 요리 (~ 90 % 합류 다음날)을 얻을 수 있습니다. 각 수용체의 표현뿐만 아니라, 각각의 수용체 쌍을 하나의 요리를 평가 한 접시를 준비합니다. </li><li> 세포 37 5 % CO 2 분위기에서 하룻밤 부화 허용 ° C. 다음날, 문화 ~ 70~90%의 합류해야합니다. </li><li> transfection의 날, 미리 예열 OptiMEM 200 μL에 Fugene6 8 μL와 키메라 수용체 벡터 DNA (2 μL) 2 μg을 혼합하여 nucleolipid 단지를 준비합니다. 2 μg의 총 각 수용체 1 μg과 수용체 쌍 들어, transfect (아래 토론도 참조). </li><li> 역전에 의해 부드럽게 섞는다. </li><li> 30 분 상온에서 부화 계속합니다. </li><li> 잠복기 동안 transfection을 위해 세포를 준비합니다. 신선한 미디어를 대기음 항생제없이 두 ML 사전 예열 완료 - DMEM (DMEM + FBS)의 추가되기 전에 따뜻한 PBS로 부드럽게하고 잠시 각각의 접시를 씻으십시오. 그들이 Fugene6 치료 기간 동안 상당히 많은 독성 세포에 있으므로 페니실린과 스트렙토 마이신의 존재를 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 세포 현명 복잡한 드롭을 추가하고 37 추가 20~24시간에 대한 품어 ° 5 % CO 2 분위기에서 C 있습니다. </li><li> 24 시간 후에 조심스럽게 세포에서 미디어를 대기음 항생제와 함께 신선한 완전한 - DMEM을 피펫. transfection에 따라 세포 생존 능력이 상대적으로 높은 유지한다, 아니 부유 세포 거의가 관찰해야합니다 즉. </li><li> 유전자 발현은 추가 48~60시간 포스트 transfection 후 일반적으로 최대한입니다. 그러나, 영상 24 시간처럼 짧은에서는 일반적으로 가능합니다. 최적의 유전자 발현 시간 코스 실험을 실시하여야한다. </li></ol> 3. 공촛점 이미징 및 분석 걱정 라이브 셀 이미징은 청색 다이오드 (405 nm의), 아르곤 (458, 476, 488, 514 NM)이 장착된 Leica TCS - SP2 AOBS 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 수행됩니다. 녹색 HeNe (543 NM), 오렌지 HeNe (594 NM), 그리고 붉은 HeNe (633 NM) 레이저, HCX PI APO 63x/1.3 나 글리세린 - 침지 목표 렌즈, 전동 XY 스테이지 (Märzhäuser) 및 환경 제어 ( 온도, 습도 및 CO 2) 단계 인큐베이터 (PeCon). 실험 컨트롤 형광단 방출 채널뿐만 아니라 평가하는 표현의 문제가 아닌 특정 형광단의 multimerization 사이의 교차 대화를 제거하는 중요하다. 따라서, 단일 형광단의 transfections는 모든 이미지 세션을 설정 활용하고 있습니다. 부정의 배경을 결정하기 위하여 수행되어야합니다 컨트롤을 (알려진 noninteracting 수용체를 사용하는) 걱정하는 것은 이상의 표현으로 인해 발생되는 무서워. <ol><li> CFP와 YFP에 대한 방출 채널 간의 누화를 제거하려면 단계 인큐베이터에 CFP 표현 컨트롤을 놓습니다. 하얀 빛을 사용에 초점을 Z - 플레이트를 조정세포 수 있습니다. </li><li> 465-505 NM 및 YFP 525-600 nm의에로 CFP의 방출 감지 SP 창 설정을 설정합니다. </li><li> 모두 방출 채널을 모니터링하는 동안, 458 nm의에서 CFP를 자극. AOTF를 사용하여 YFP 방출 채널로 CFP 이상의 감지할 수있을 정도의 출혈을 제거하기 위해 레이저 전원을 설정합니다. 이 설정을 저장합니다. </li><li> 단 YFP을 표현 세포에 대한 514 nm의 여기에서 전력을 조정하여 CFP 채널에서 YFP 누화 (YFP 표현 컨트롤을 사용)에 대해 동일한 제어를 수행합니다. 이 설정을 저장합니다. </li><li> 다음 장소 세포 공동 표현 무대 인큐베이터에 CFP와 YFP 있습니다. Leica 공촛점 소프트웨어의 순서 설정을 사용하여 적절한 멤브레인 현지화와 CFP와 YFP 비슷한 수준을 표현하는 세포를 찾습니다. </li><li> Leica 소프트웨어 수용체 사진 표백 프로그램을 사용하여, respectably, 저장된 CFP 및 YFP 설정으로 기증자 및 수용체 설정을 설정합니다. </li><li> 세포에 확대, YFP의 사진 파괴는 세포 막에서 발생하고 프로그램을 시작할 수있는 투자 수익 (ROI)을 (관심 영역) 강조. </li><li> 수용체의 사진 파괴 들면, 514 nm의 100 %에 AOTF를 조정하고 YFP 방출의 70 %가 소진되었습니다 때까지 계속 표백 레이저를 허용합니다. 표백 가속, 로아는 일반적으로 레이저의 래스터 축 (X 축)에 선정되었습니다. </li><li> 사진 표백 동안, 이러한 측정치가 false로 효율성을 걱정 보고할 수 있듯이, 세포 운동을 모니터하고 XY - 비행기에서 감지할 수있을 정도의 운동과 함께 얻은 측정을 거부합니다. </li><li> 사전 및 사후 표백 이미지는 기증자 (CFP)와 수용체 (YFP) 모두에 대한 기록과 효율성이로 계산됩니다 걱정입니다 모든 D 게시&gt; D 미리 D 사전에 대한 EFF = (D 포스트 - D 미리) / D 게시물 걱정 그리고 D 게시하기 전에 각각 photobleaching 후 기증자의 강도입니다. </li><li> JMP 소프트웨어 (SAS)는 실험 다양성의 범위를 결정하는 데 사용됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 Transfection 효율이 30-40% 사이에 일반적으로있다. 다른 이전의 연구 결과에도 불구하고, 우리는 한 벡터의 transfection과 표현이 다른의 좋아하는 것을 보지 못했어요. 사실, 우리는 자주 키메라 또는 다른 하나 형광단의 독점적인 표현을 관찰합니다. 일반은 효율이 수용체 시스템 간의 차이가 무서워. 타이 수용체 시스템, 전형적인 값은 상피 세포에 대한 20-28% 및 내피 세포에 19-23% 있습니다. 부정적인 컨트롤, 전형적인 효율은 다음과 2~3% 있습니다. 다양성의 정도는 경험이 상당히 줄어 듭니다. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. transfected EA.hy 926 세포의 대표적인 이미지. EA.hy 926 세포 monolayer의) DIC 이미지. (A)에 표시되는 세포의 B) 형광 이미지. 의 C) 중첩 (A)와 (B) 시연 ~ 20~30%의 transfection 효율. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 대표 수용체는 EA.hy926 감방에서 CFP와 YFP 사이에 발생하는 걱정의 분석을 사진 표백. CFP 방출 채널 (상단 패널)와 YFP 방출 채널 (아래 두 패널)은 이전에 별도의 모니터링 및 게시물 수용체가 photobleaching되었습니다. Photobleaching 실험로 제한하고 녹색 상자 내의 지역에서 계산된 값을 무서워했다. 안달 효율은 오리 엔테이션을 위해 이미지를 통합 CFP / YFP의 확대 오버레이 부족 (자주색 - 0.0)로 높은 곳에서 절대 범위 (적색 - 1.0)로 표시됩니다.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 그 중 가장 두드러진은 두 키메라 수용체 사이의 표현의 상대적인 수준입니다. 이 문제를 회피하기 위해 하나는 관심의 두 단백질을 표현하는 안정적인 세포 라인을 만들거나 이에 상응하는 표현을 허용하는 벡터 DNA의 최적 비율을 확인할 수 있습니다. 마찬가지로, 요리를 통해 비 균일한 transfection에 의한, 단백질 수준은 거의 세포 사이에 동등되지 않습니다. 따라서, 관심은 &#39;낮음&#39;에서 &#39;높음&#39;expressors를 구별할 지불하셔야합니다. 단백질의 표시 &#39;평균&#39;수준은 일반적으로 안정적이고 재현성 수확량 이들은 효율성을 무서워. 저희 연구소가이 문제를 해소하기 위해 추구가 하나의 방법은 &#39;도&#39;유전자 발현에 adeno 및 lenti - 바이러스를 사용하는 것입니다. 또한, 수용체 사진 표백 결정하는 다른 방법은 효율이 sensitized 방출됩니다 무서워. 실시간으로 단일 세포를 모니터링하는 sensitized 방출의 가능성에도 불구하고, 우리는 수용체 사진 표백 더 민감하고 더 신뢰할 수 발견,하지만. 마지막으로, 단백질 상호 작용을 모니터링하기 위해 안달 사용하여 도전해야하고, 멤브레인 바운드 수용체에 대한 링커 길이에주의 선택이 필요합니다. 또한, C / YFP의 추가는 종종 크게 endoplasmic reticulum과 잠돌군 Zz 장치의 집합의 단백질 발현 수준과 결과에 영향을 미칩니다. 그러나, 과도, 또는 불안 정한 상호 작용에 대한, 초조가 활용할 수있는 이상적인 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 디쉬</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Mach 1 컴피턴트 셀</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

단백질 - 단백질 상호 작용은 모든 필수 세포 프로세스의 특징입니다. 그러나 이러한 상호 작용의 대부분은 이러한 공동 immunoprecipitation과 같은 전통적인 생화 학적 방법을 통해 자신의 식별 및 분석을 방지, 과도, 또는 정력적 약한 있습니다. 이와 관련, 유전자 encodable 형광 단백질 (GFP, RFP 등) 및 형광 스펙트럼이 중복 관련은 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 1-3을 사용하여 생체내의 약한 상호 작용을 모니터링하는 능력을 혁신합니다. 내피 세포 표면에 수용체 - 수용체의 상호 작용을 모니터링 걱정 기반의 근접 분석의 여기, 우리는 세부의 사용을.

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

단백질-단백질 상호작용은 모든 필수적인 세포 과정의 특징입니다. 그러나 이러한 상호작용 중 상당수는 일시적이거나 에너지적으로 약하여...

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 표면에서 단백질-단백질 상호작용의 존재 여부를 평가하는 것입니다. 이를 위해 두 개의 관심 수용체를 클로닝하고, 두 번째 단계로 방출 및 스펙트럼이 겹치는 두 개의 형광 단백질에 각각 접합시킵니다. 수용체 발현을 위해 두 벡터를 혈관 내피세포에 동시에 형질전환시킵니다.이 시점에서 형광 표지는 수용체 국소화뿐만 아니라 전체적인 발현 정도를 평가하는 데 도움을 줍니다. 다음으로, 공초점 현미경을 사용하여 단일 형질전환 세포를 대조군으로 설정하고 이미징 파라미터를 수립합니다. 개별적으로 형질전환된 세포들은 수용체 발현의 상대적 수준과 국소화 상태에 따라 선택됩니다.그런 다음 이 세포 내의 영역들을 이미징하여 FRET 결과의 정도를 평가합니다. FRET 및 공초점 현미경 분석을 바탕으로 혈관 내피 세포 표면에서의 Tie1 및 Tie2 상호작용을 보여주는 결과입니다. 안녕하세요, Virginia Commonwealth University 생화학 및 분자생물학과의 Dr. William Barton 연구실 소속 Tom Seger입니다.오늘은 FRET 기반 공초점 현미경을 이용하여 혈관 내피 세포 내의 단백질-단백질 상호작용을 평가하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이를 통해 혈관 신생 과정 중의 수용체 상호작용을 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.FRET 기반 근접 분석법을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 이미지화하려면, 먼저 관심 수용체를 monomeric CFP 또는 YFP가 포함된 pCDA 3.1 hydro 또는 neo 벡터의 Nhe I 및 Eco R I 사이트에 클로닝하십시오. FRET의 결정은 경험적이며, transmembrane spanning 영역과 형광 단백질 시작 부분 사이의 링커 길이에 따라 결정적으로 달라집니다. 따라서 조사하려는 각 새로운 수용체 쌍에 대해 여러 가지 다른 길이의 링커를 탐색해야 합니다. 동봉된 프로토콜에 따라 벡터를 형질전환하고 증폭하십시오.그다음 트랜스펙션 등급의 DNA를 준비하고, 동봉된 프로토콜에 따라 벡터를 형질전환 및 증폭시키십시오. 이어서 트랜스펙션 등급의 DNA를 준비하고, 작업 농도인 1 µg/µL로 희석하여 트랜스펙션을 위한 세포를 준비합니다. 조직 배양 후드 아래에서 완전 DMEM에서 배양된 EAHY 92 6 세포를 2 mL의 배지가 들어 있는 커버슬립 라인 35 mm 디시에 분할하여 접종하십시오. 각 개별 수용체의 발현을 평가하기 위한 디시 하나와 각 수용체 쌍에 대한 디시 하나를 준비하십시오.다음 날까지 세포를 37°C, 95% 이산화탄소 분위기에서 배양합니다. transfection 당일의 배양 세포 밀도는 약 70~90% confluence여야 합니다. 2 µg의 chimeric receptor vector DNA를 200 µL의预warm된 Opti-MEM(receptor pair용) 내의 8 µL Fuji N HD와 혼합하여 nucleo-lipid complex를 준비합니다. 각 receptor당 1 µg씩 총 2 µg으로 transfection 하며, 가볍게 도립 혼합한 후 실온에서 30분 동안 배양합니다.배양 기간 동안, 형질전환(transfection)을 위해 세포를 준비합니다. 신선한 배지를 흡입하여 제거하고, 항생제가 없는 미리 데워둔 완전 DMEM 2 mL를 첨가하기 전에 각 플레이트를 따뜻한 PBS로 부드럽고 짧게 세척합니다. 페니실린과 스트렙토마이신은 처리 과정 중 세포에 상당히 더 독성이 강하므로 이들이 존재하지 않도록 하는 것이 중요합니다. FU gene HD 복합체를 세포에 한 방울씩 떨어뜨리고 20~24시간 동안 추가로 배양합니다. 24시간 후, 세포로부터 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 형질전환 후 항생제가 포함된 신선한 완전 DMEM을 피펫으로 분주합니다.세포 생존율은 상대적으로 높게 유지되어야 합니다. 부유 세포는 거의 또는 전혀 관찰되지 않아야 합니다. 살아있는 세포 이미징을 수행하기 위해, 청색 다이오드 아르곤 레이저와 녹색, 주황색, 적색 헬륨-네온 레이저가 장착된 A-T-C-S-P two A OBS 공초점 레이저 주사 현미경, H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA 글리세린 침수 렌즈, 전동 XY 스테이지 및 온도, 습도, 이산화탄소가 제어되는 스테이지 인큐베이터를 사용합니다.실험 대조군은 방출 채널 간의 형광 크로스토크를 제거하고, 발현 문제 및 비특이적 형광 표지를 평가하는 데 매우 중요합니다. 따라서 CFP와 YFP 방출 채널 간의 크로스토크를 제거하기 위해 매 이미지 세션을 설정할 때 단일 형광 단백질 형질전환물을 사용합니다. 백색광을 사용하여 CFP 발현 대조군을 스테이지 인큐베이터에 배치하십시오.Z 플레이트를 조절하여 세포에 초점을 맞춥니다. 두 방출 채널을 동시에 모니터링하면서 CFP의 방출 검출을 위한 SP 윈도우 설정을 465~505 nm로, YFP를 525~600 nm로 설정하고 CFP를 458 nm에서 여기시킵니다. A OTF를 사용하여 CFP가 YFP 방출 채널로 유의미하게 누출되지 않도록 레이저 출력을 설정합니다.이 설정을 저장하십시오. 514 nm에서의 여기 파워를 조정하여 CFP 채널에서의 YFP 크로스토크에 대해 동일한 대조군 실험을 수행하십시오. YFP만 발현하는 세포의 이 설정을 저장하십시오.다음으로, CFP와 YFP를 동시에 발현하는 세포를 스테이지 인큐베이터에 배치합니다. LICO 공초점 소프트웨어의 시퀀스 설정을 사용하여, 소프트웨어 기반 광퇴색 프로그램(photo bleaching program)을 제외한 LICO 소프트웨어를 통해 적절한 막 국소화를 보이며 CFP와 YFP를 유사한 수준으로 발현하는 세포를 찾습니다.공여체 및 수용체 설정을 각각 저장된 CFP 및 YFP 설정으로 지정하십시오. 세포를 확대한 후, 세포막에서 YFP의 광파괴가 일어날 관심 영역(Region of interest) 또는 ROI를 지정하고 수용체 광파괴 프로그램을 시작하십시오. A OTF를 514 nanometers의 100%로 조정하고, YFP 방출의 70%가 소멸될 때까지 레이저 블리칭을 계속하십시오.표백을 가속화하기 위해 광표백 중에는 일반적으로 레이저의 래스터 축에서 ROI를 선택합니다. 세포의 움직임을 모니터링하고 XY 평면에서 상당한 움직임이 관찰된 측정값은 배제하십시오. 이러한 측정값은 잘못된 FRET 효율을 보고할 수 있으므로, 공여체와 수용체 모두에 대해 표백 전후 이미지를 기록하며, FRET 효율은 Dpost가 Dpre보다 큰 모든 경우에 대해 (post - DLO) / depost로 계산합니다. 여기서 Dpre와 Dpost는 각각 광표백 전후의 공여체 강도를 의미합니다.실험적 변동성의 정도를 결정하기 위해 JMP가 사용됩니다. 개별 수용체는 다양한 길이의 인접 막 서열(juxtamembrane sequence)을 포함하여 CFP 및 YFP 모두에 융합되어야 합니다. 최적의 수용체 FRET 파트너 쌍을 식별하기 위해, 타 연구자들의 이전 결과에도 불구하고 일반적으로 형질전환 효율은 30에서 40% 사이로 유지합니다.한 벡터의 형질전환 및 발현이 다른 벡터의 발현에 유리하게 작용하는 현상은 관찰되지 않았습니다. 실제로, 한 쪽의 형광 단백질만이 단독으로 발현되는 경우가 자주 관찰됩니다. 이 대표 이미지들은 EAHY 9 26 세포 내의 CFP와 YFP 사이에서 발생하는 FRET의 acceptor photobleaching 분석 결과를 보여줍니다.광퇴색 전후로 CFP 및 YFP 방출 채널을 각각 모니터링하였으며, 계산은 해당 영역으로 제한하였습니다. T 수용체 시스템의 방향 확인을 위해 확대된 A-C-F-P-Y-F-P 병합 이미지 위에 표시된 빨간색 상자 내에서, FRET 효율은 1.0인 높은 효율(빨간색)부터 0인 낮은 효율(보라색)까지의 절대 범위로 표시됩니다. 여기에 나타난 바와 같이, 일반적인 FRET 효율 값은 상피세포의 경우 20~28%, 혈관내피세포의 경우 19~23%입니다.따라서 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 일반적으로 3~4일이 소요됩니다. 이 실험 과정을 시도할 때, 표적 단백질과 융합 형광 단백질 사이의 링커 길이뿐만 아니라 이들의 발현 수준 및 세포 내 이동이 실험 후 FRET 측정값에 직접적인 영향을 미친다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 실험 개발 후에는 신호 전달 경로에 대한 통찰을 얻기 위해 신호 활성화와 관련된 생화학적 분석을 수행할 수 있습니다.이 기술은 약하거나 일시적인 단백질-단백질 상호작용을 연구할 수 있는 분석법을 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 살아있는 세포에서 FRET 기반 근접 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 조직 배양 세포를 다룰 때는 항상 적절한 안전 예방 조치를 준수해야 함을 잊지 마십시오.시청해주셔서 감사드리며, 앞으로의 FRET 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는...

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

이 프로토콜은 관심 단백질에 융합된 비오틴 리가아제에 대한 근접성을 기반으로 단백질에 비오틴의 생체 내 공유 결합 방법을 제시합니다. 이 변형을 통해 단백질 상호작용 연구에서 필요에 따라 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단백질을 선택적으로 농축할 수 있습니다.

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

배우세요 혈관내피세포에서 FRET 기반 근접 분석을 이용한 단백질-단백질 상호작용 이미징 방법을. 이 기법은 혈관신생 과정에서 수용체 상호작용을 연구하고 세포 표면에서의 신호전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에

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