이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 표면에서 단백질-단백질 상호작용의 존재 여부를 평가하는 것입니다. 이를 위해 두 개의 관심 수용체를 클로닝하고, 두 번째 단계로 방출 및 스펙트럼이 겹치는 두 개의 형광 단백질에 각각 접합시킵니다. 수용체 발현을 위해 두 벡터를 혈관 내피세포에 동시에 형질전환시킵니다.

이 시점에서 형광 표지는 수용체 국소화뿐만 아니라 전체적인 발현 정도를 평가하는 데 도움을 줍니다. 다음으로, 공초점 현미경을 사용하여 단일 형질전환 세포를 대조군으로 설정하고 이미징 파라미터를 수립합니다. 개별적으로 형질전환된 세포들은 수용체 발현의 상대적 수준과 국소화 상태에 따라 선택됩니다.

그런 다음 이 세포 내의 영역들을 이미징하여 FRET 결과의 정도를 평가합니다. FRET 및 공초점 현미경 분석을 바탕으로 혈관 내피 세포 표면에서의 Tie1 및 Tie2 상호작용을 보여주는 결과입니다. 안녕하세요, Virginia Commonwealth University 생화학 및 분자생물학과의 Dr. William Barton 연구실 소속 Tom Seger입니다.

오늘은 FRET 기반 공초점 현미경을 이용하여 혈관 내피 세포 내의 단백질-단백질 상호작용을 평가하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이를 통해 혈관 신생 과정 중의 수용체 상호작용을 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

FRET 기반 근접 분석법을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 이미지화하려면, 먼저 관심 수용체를 monomeric CFP 또는 YFP가 포함된 pCDA 3.1 hydro 또는 neo 벡터의 Nhe I 및 Eco R I 사이트에 클로닝하십시오. FRET의 결정은 경험적이며, transmembrane spanning 영역과 형광 단백질 시작 부분 사이의 링커 길이에 따라 결정적으로 달라집니다. 따라서 조사하려는 각 새로운 수용체 쌍에 대해 여러 가지 다른 길이의 링커를 탐색해야 합니다. 동봉된 프로토콜에 따라 벡터를 형질전환하고 증폭하십시오.

그다음 트랜스펙션 등급의 DNA를 준비하고, 동봉된 프로토콜에 따라 벡터를 형질전환 및 증폭시키십시오. 이어서 트랜스펙션 등급의 DNA를 준비하고, 작업 농도인 1 µg/µL로 희석하여 트랜스펙션을 위한 세포를 준비합니다. 조직 배양 후드 아래에서 완전 DMEM에서 배양된 EAHY 92 6 세포를 2 mL의 배지가 들어 있는 커버슬립 라인 35 mm 디시에 분할하여 접종하십시오. 각 개별 수용체의 발현을 평가하기 위한 디시 하나와 각 수용체 쌍에 대한 디시 하나를 준비하십시오.

다음 날까지 세포를 37°C, 95% 이산화탄소 분위기에서 배양합니다. transfection 당일의 배양 세포 밀도는 약 70~90% confluence여야 합니다. 2 µg의 chimeric receptor vector DNA를 200 µL의预warm된 Opti-MEM(receptor pair용) 내의 8 µL Fuji N HD와 혼합하여 nucleo-lipid complex를 준비합니다. 각 receptor당 1 µg씩 총 2 µg으로 transfection 하며, 가볍게 도립 혼합한 후 실온에서 30분 동안 배양합니다.

배양 기간 동안, 형질전환(transfection)을 위해 세포를 준비합니다. 신선한 배지를 흡입하여 제거하고, 항생제가 없는 미리 데워둔 완전 DMEM 2 mL를 첨가하기 전에 각 플레이트를 따뜻한 PBS로 부드럽고 짧게 세척합니다. 페니실린과 스트렙토마이신은 처리 과정 중 세포에 상당히 더 독성이 강하므로 이들이 존재하지 않도록 하는 것이 중요합니다. FU gene HD 복합체를 세포에 한 방울씩 떨어뜨리고 20~24시간 동안 추가로 배양합니다. 24시간 후, 세포로부터 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 형질전환 후 항생제가 포함된 신선한 완전 DMEM을 피펫으로 분주합니다.

세포 생존율은 상대적으로 높게 유지되어야 합니다. 부유 세포는 거의 또는 전혀 관찰되지 않아야 합니다. 살아있는 세포 이미징을 수행하기 위해, 청색 다이오드 아르곤 레이저와 녹색, 주황색, 적색 헬륨-네온 레이저가 장착된 A-T-C-S-P two A OBS 공초점 레이저 주사 현미경, H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA 글리세린 침수 렌즈, 전동 XY 스테이지 및 온도, 습도, 이산화탄소가 제어되는 스테이지 인큐베이터를 사용합니다.

실험 대조군은 방출 채널 간의 형광 크로스토크를 제거하고, 발현 문제 및 비특이적 형광 표지를 평가하는 데 매우 중요합니다. 따라서 CFP와 YFP 방출 채널 간의 크로스토크를 제거하기 위해 매 이미지 세션을 설정할 때 단일 형광 단백질 형질전환물을 사용합니다. 백색광을 사용하여 CFP 발현 대조군을 스테이지 인큐베이터에 배치하십시오.

Z 플레이트를 조절하여 세포에 초점을 맞춥니다. 두 방출 채널을 동시에 모니터링하면서 CFP의 방출 검출을 위한 SP 윈도우 설정을 465~505 nm로, YFP를 525~600 nm로 설정하고 CFP를 458 nm에서 여기시킵니다. A OTF를 사용하여 CFP가 YFP 방출 채널로 유의미하게 누출되지 않도록 레이저 출력을 설정합니다.

이 설정을 저장하십시오. 514 nm에서의 여기 파워를 조정하여 CFP 채널에서의 YFP 크로스토크에 대해 동일한 대조군 실험을 수행하십시오. YFP만 발현하는 세포의 이 설정을 저장하십시오.

다음으로, CFP와 YFP를 동시에 발현하는 세포를 스테이지 인큐베이터에 배치합니다. LICO 공초점 소프트웨어의 시퀀스 설정을 사용하여, 소프트웨어 기반 광퇴색 프로그램(photo bleaching program)을 제외한 LICO 소프트웨어를 통해 적절한 막 국소화를 보이며 CFP와 YFP를 유사한 수준으로 발현하는 세포를 찾습니다.

공여체 및 수용체 설정을 각각 저장된 CFP 및 YFP 설정으로 지정하십시오. 세포를 확대한 후, 세포막에서 YFP의 광파괴가 일어날 관심 영역(Region of interest) 또는 ROI를 지정하고 수용체 광파괴 프로그램을 시작하십시오. A OTF를 514 nanometers의 100%로 조정하고, YFP 방출의 70%가 소멸될 때까지 레이저 블리칭을 계속하십시오.

표백을 가속화하기 위해 광표백 중에는 일반적으로 레이저의 래스터 축에서 ROI를 선택합니다. 세포의 움직임을 모니터링하고 XY 평면에서 상당한 움직임이 관찰된 측정값은 배제하십시오. 이러한 측정값은 잘못된 FRET 효율을 보고할 수 있으므로, 공여체와 수용체 모두에 대해 표백 전후 이미지를 기록하며, FRET 효율은 Dpost가 Dpre보다 큰 모든 경우에 대해 (post - DLO) / depost로 계산합니다. 여기서 Dpre와 Dpost는 각각 광표백 전후의 공여체 강도를 의미합니다.

실험적 변동성의 정도를 결정하기 위해 JMP가 사용됩니다. 개별 수용체는 다양한 길이의 인접 막 서열(juxtamembrane sequence)을 포함하여 CFP 및 YFP 모두에 융합되어야 합니다. 최적의 수용체 FRET 파트너 쌍을 식별하기 위해, 타 연구자들의 이전 결과에도 불구하고 일반적으로 형질전환 효율은 30에서 40% 사이로 유지합니다.

한 벡터의 형질전환 및 발현이 다른 벡터의 발현에 유리하게 작용하는 현상은 관찰되지 않았습니다. 실제로, 한 쪽의 형광 단백질만이 단독으로 발현되는 경우가 자주 관찰됩니다. 이 대표 이미지들은 EAHY 9 26 세포 내의 CFP와 YFP 사이에서 발생하는 FRET의 acceptor photobleaching 분석 결과를 보여줍니다.

광퇴색 전후로 CFP 및 YFP 방출 채널을 각각 모니터링하였으며, 계산은 해당 영역으로 제한하였습니다. T 수용체 시스템의 방향 확인을 위해 확대된 A-C-F-P-Y-F-P 병합 이미지 위에 표시된 빨간색 상자 내에서, FRET 효율은 1.0인 높은 효율(빨간색)부터 0인 낮은 효율(보라색)까지의 절대 범위로 표시됩니다. 여기에 나타난 바와 같이, 일반적인 FRET 효율 값은 상피세포의 경우 20~28%, 혈관내피세포의 경우 19~23%입니다.

따라서 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 일반적으로 3~4일이 소요됩니다. 이 실험 과정을 시도할 때, 표적 단백질과 융합 형광 단백질 사이의 링커 길이뿐만 아니라 이들의 발현 수준 및 세포 내 이동이 실험 후 FRET 측정값에 직접적인 영향을 미친다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 실험 개발 후에는 신호 전달 경로에 대한 통찰을 얻기 위해 신호 활성화와 관련된 생화학적 분석을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 약하거나 일시적인 단백질-단백질 상호작용을 연구할 수 있는 분석법을 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 살아있는 세포에서 FRET 기반 근접 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 조직 배양 세포를 다룰 때는 항상 적절한 안전 예방 조치를 준수해야 함을 잊지 마십시오.

시청해주셔서 감사드리며, 앞으로의 FRET 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.