Circadian 리듬을 연구 및 매개 변수 잠을 전위의 활동 시금 Drosophila

다음 실험의 전반적인 목표는 초파리의 일일 운동 활동 리듬을 측정하여 서캐디언(circadian) 및 수면 표현형을 특성화하는 것입니다. 이를 위해 트랜스제닉 초파리를 제작하거나, 특정 돌연변이체를 확보하거나, 실험 동물을 준비하기 위해 필요한 교배를 수행합니다. 두 번째 단계로, 실험 기간 동안 초파리의 서식처 역할을 할 먹이가 포함된 유리 활동 튜브를 준비해야 합니다.

그 다음으로, 부화 후 1일에서 5일 된 초파리를 활동 튜브에 넣고 이를 DAM 활동 모니터에 장착하여 운동 활동 리듬을 측정합니다. DAM 시스템을 사용하고 far sex 및 insomniac과 같은 소프트웨어로 일일 운동 활동 리듬을 분석함으로써, 일주기 리듬 및 수면 파라미터의 결함과 변이 결과가 도출됩니다. 이 방법은 어떤 단백질과 조절 메커니즘이 적절한 리듬을 생성하는 데 관여하는지, 그리고 예를 들어 빛이나 온도와 같은 환경 요인이 특정 분자 경로를 통해 행동 리듬을 어떻게 조절하는지와 같은 일주기 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

운동 능력 모니터링 시스템은 특수 모니터링 장치, 주간 광량 조절 기능이 있는 환경 인큐베이터, 데이터 수집 장치, 컴퓨터 및 배선과 같은 주변 기기 등 수많은 장비로 구성됩니다. 인큐베이터에 과도한 부하가 걸리거나 온도 유지가 안 되는 실패 사례를 방지하기 위해, 통풍이 잘 되고 온도 조절이 가능한 암실에 운동 능력 모니터링 시스템을 설치하십시오. 암실 내부를 외부 광원으로부터 차단하십시오. 초파리의 일주기 시스템은 적외선에 반응하지 않으므로 완전히 어두운 곳에서 작업할 필요는 없습니다.

따라서 암실 내에서 확인이 필요한 경우에는 빨간색 필터가 씌워진 표준 손전등을 사용하며, 활동 모니터링 시스템의 구성 요소에 전원을 공급할 수 있는 충분한 와트 용량을 갖춘 무정전 전원 공급 장치(UPS) 비상 백업 유닛을 사용합니다. 건물 내 전압 급증이나 정전이 발생할 경우, 가능하시다면 UPS 비상 백업 유닛을 건물의 비상 백업 회로에 연결하십시오. 인큐베이터의 조명을 제어하는 시스템이 인큐베이터에 의해 직접 조절되지 않는 경우라면, 몇 초간의 전원 손실이 챔버 온도에 영향을 미치지 않으므로 UPS 없이 인큐베이터를 비상 전원에 연결하는 것만으로도 충분합니다.

다음으로, 데이터 수집 및 인큐베이터 제어 전용의 컴퓨터(PC 또는 Macintosh)를 설정합니다. 활동 모니터링 장치를 쉽게 연결하거나 분리할 수 있도록 환경 제어 인큐베이터의 선반 주변에 전화선 네트워크를 깔끔하게 배치합니다. 여러 개의 전화선이 하나의 메인 라인으로 모여 인큐베이터 외부로 나와 컴퓨터에 연결되도록 구성하며, 인큐베이터 내부의 모니터링 장치들을 전원 공급 인터페이스 유닛을 통해 컴퓨터에 연결합니다. 이 인터페이스 유닛은 전화선을 통해 활동 모니터에 전원을 공급하는 역할을 합니다.

마지막으로, 전자 장치의 LED나 제대로 밀봉되지 않은 배양기 문 등에서 발생할 수 있는 광원을 덕트 테이프나 검은 천으로 가립니다. 이는 원치 않는 빛이 없는 상태에서 자유 수행 리듬(free running rhythms)이 측정되도록 하기 위함입니다. 동일한 환경 조건에서 사육된 동일한 연령의 적절한 대조군 동물을 사용하여 이러한 표현형을 평가하는 것이 매우 중요합니다.

또한, 일주기 리듬성에는 성적 이형성이 존재합니다. 암컷 초파리의 산란 활동이 운동성 측정의 정확도에 영향을 미치기 때문에, 일반적으로 25 °C에서 사육된 1~5일령의 성체 수컷 초파리를 이러한 분석에 사용합니다. 관심 있는 특정 돌연변이 초파리의 일주기 및 수면-휴식 파라미터를 조사할 때는 돌연변이 계통을 동일한 유전적 배경을 가진 야생형 계통과 교배(outcross)하는 것이 바람직합니다.

예를 들어, W 1118 또는 yw를 사용합니다. 초파리 수컷에서는 교차가 일어나지 않으므로, 돌연변이 암컷과 야생형 수컷을 교배하여 외교배(outcross)를 수행하는 것이 더 바람직합니다. 야생형 대조군과 돌연변이 초파리를 동시에 접종하십시오. 운동성 활동 리듬 실험 전, 표준 초파리 배지에서 약 10~14일 동안 배양한 뒤, 자손이 부화하면 1~5일 된 수컷 초파리를 수집하여 실험에 사용할 수 있도록 따로 분리해 둡니다.

활동 튜브는 초파리의 서식지를 나타냅니다. 실험 중에 사용되는 이 튜브들은 지름 5 mm의 얇은 유리관으로, 한쪽 끝에는 먹이 물질이 들어 있고 다른 쪽 끝은 실이나 플라스틱 마개로 막혀 있습니다. 가급적 최근에 제작된 활동 튜브를 사용하는 것이 좋습니다.

실험 시작 며칠 전에서 일주일 전에 일반적으로 준비합니다. 유리 활성 튜브는 여러 번 재사용할 수 있으므로, 다음의 준비 절차는 이전에 사용되어 세척되지 않은 활성 튜브를 시작점으로 하여 설명합니다. 새 활성 튜브를 사용하는 경우, 뒤에 나오는 튜브 오토클레이브 단계로 바로 넘어가십시오.

사용한 활성 튜브에서 마개를 제거하고 큰 유리 비커에 넣습니다. 튜브는 비커의 절반까지만 채워야 합니다. 튜브가 완전히 잠기도록 비커에 수돗물을 채웁니다.

유리관이 들어 있는 비커를 물이 완전히 빠르게 끓을 때까지 전자레인지로 가열합니다. 왁스와 한천 먹이를 녹일 때 물이 뜨거우므로 주의하십시오. 비커를 전자레인지에서 꺼내고 스패튤라나 플라스틱 도구로 유리관을 젓습니다.

갇힌 왁스가 위로 뜰 수 있도록 10 millimeter 피펫을 사용하십시오. 그런 다음 전자레인지 가열 단계를 반복합니다. 비커를 전자레인지에서 꺼내고 식을 때까지 기다리십시오.

비커를 저온실에 두면 공정이 더 빠르게 진행됩니다. 물이 식으면서 왁스가 수면에 모여 서서히 응고됩니다. 응고된 왁스를 손으로 제거하십시오.

이렇게 하면 튜브에 묻은 왁스의 대부분이 제거될 것입니다. 활성 튜브를 신선한 수돗물이 담긴 새 비커로 옮기고, 전자레인지 가열 및 왁스 제거 과정을 반복하십시오. 이전 단계에서 대부분의 왁스가 제거되었으므로, 왁스가 응고될 때까지 기다릴 필요는 없습니다.

비커에서 물을 간단히 따라 버리고 튜브를 새 비커로 옮깁니다. 물이 여전히 뜨거우므로 주의하십시오. 전자레인지 가열 과정을 마지막으로 한 번 더 반복합니다.

비커에서 물을 따라내고 활성 튜브가 식을 때까지 기다립니다. 그다음, 활성 튜브를 250 milliliter 또는 500 milliliter 유리 비커에 수직으로 넣습니다. 이때 튜브들이 너무 빽빽하게 들어가지 않도록 주의하십시오.

건조 사이클이 있는 오토클레이브를 사용하여 멸균하거나, 단순히 건조 오븐에서 튜브를 건조하여 활성 튜브에 넣을 먹이를 준비합니다. 증류수 또는 수돗물에 5% sucrose와 2% bact to agar 용액을 만듭니다. 해당 용액을 오토클레이브로 멸균합니다. 멸균된 먹이는 즉시 사용하거나 4°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.

이상적으로, 먹이는 activity tube를 채울 때 약 65 °C 정도여야 합니다. 10 mL 피펫을 사용하여 액체 먹이 용액을 유리 비커의 내부 벽면을 따라 피펫팅하여, 튜브 바닥에서부터 1/3이 찰 때까지 채웁니다. 모든 튜브에 먹이 용액이 균일하게 채워졌는지 확인하기 위해 비커를 조심스럽게 살살 흔들어 줍니다.

먹이가 실온 또는 4°C에서 완전히 응고될 때까지 기다립니다. 유리관 내부의 응결 현상이 사라지면 비커에서 관을 꺼낼 수 있습니다. 비커에서 활성 관을 제거하려면, 관을 비커 바닥 쪽으로 누르면서 동시에 관을 비틀어 관 내부의 응고된 먹이와 비커 바닥이 분리되도록 합니다.

튜브들을 비커에서 꺼내며, 가급적 한꺼번에 묶어서 꺼냅니다. 다음으로, 튜브 외벽에 묻은 과잉 먹이를 제거하기 위해 종이 타월로 튜브를 하나씩 닦아냅니다. 닦아낸 튜브들은 깨끗한 용기에 따로 보관합니다.

튜브 홀더가 없는 일반 실험실용 블록 히터를 준비하고 가열 웰을 조심스럽게 덮습니다. 강한 알루미늄 호일을 여러 겹으로 깔아 가열 웰 내부를 라이닝한 후, 파라핀 펠릿을 넣어 녹입니다. 튜브의 비식품 쪽 끝을 잡고 식품 쪽 끝을 녹은 왁스에 담급니다. 왁스 부분을 찬물이 담긴 유리 비커에 담가 왁스의 응고를 가속화합니다. 이 과정을 반복합니다.

왁스 튜브를 물에 한 번 담그면 튜브끼리 서로 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 튜브는 즉시 사용하거나 밀폐 용기에 담아 4°C에서 보관하여 사용할 수 있습니다. 일주일 이상 장기간 보관하면 식품이 과도하게 건조될 수 있습니다.

튜브를 4°C에서 보관한 경우, 사용 전에 벤치 위에 두어 상온으로 가온하십시오. 초파리를 활동 튜브에 넣기 전, 활동 모니터를 수용할 인큐베이터의 전원을 켭니다. 인큐베이터 컨트롤러를 사용하여 온도를 조절하고, 원하는 실험 설계에 따라 DAM 시스템 조명 컨트롤러 또는 인큐베이터 자체 조명 제어 시스템을 사용하여 명암 주기를 설정하십시오.

다음으로, 초파리를 이산화탄소로 마취합니다. 그런 다음 세밀한 붓을 사용하여 초파리 한 마리를 활동 튜브(activity tube)로 조심스럽게 옮깁니다. 미세 핀셋으로 약 0.5인치 길이의 실 한 가닥의 중간 부분을 잡고, 실을 활동 튜브의 먹이가 없는 쪽 끝에 삽입하여 입구를 막아 실험 중에 초파리가 탈출하지 못하도록 합니다.

튜브 내로 공기가 유입되도록 하면서, 초파리가 깰 때까지 튜브를 옆으로 눕혀 둡니다. 초파리가 먹이에 달라붙는 것을 방지하기 위해, 튜브를 활동량 모니터에 삽입합니다. 더 새롭고 소형화된 모델인 Tri Kinetics 모니터의 경우, 적외선 빔이 튜브의 중앙 위치를 통과하도록 고무줄로 튜브를 고정해야 합니다. 마지막으로, 활동량 모니터를 인큐베이터에 넣고 전화선을 통해 데이터 수집 시스템에 연결한 후 확인합니다.

DAM 시스템 수집 소프트웨어를 사용하여 모든 모니터가 제대로 연결되었으며 각 모니터에서 데이터가 수집되고 있는지 확인합니다. 초파리를 활동 튜브에 넣고 운동 능력 모니터링 시스템 준비가 완료되었으므로, 이제 데이터를 기록할 수 있습니다. 초파리를 원하는 광주기, 암주기 또는 LD 주기 및 온도 조건에 2~5일 동안 완전히 노출시켜 동기화 및 훈련시킵니다.

가장 일반적으로 사용되는 동조 조건은 25°C에서 12시간 명기 및 12시간 암기로 이루어진 명암 주기입니다. 본 프로토콜과 관련된 일주기 리듬 연구에서 인큐베이터의 점등 시간은 ZT 0으로 정의하며, 모든 다른 시간은 이 값을 기준으로 설정합니다. 표준 12:12 LD 조건에서 야생형 *Drosophila melanogaster*는 일반적으로 ZT 0을 중심으로 하는 '아침 정점(morning peak)'과 ZT 12를 중심으로 하는 '저녁 정점(evening peak)'이라는 두 차례의 활동기를 보입니다. 자유 주행 운동 활동 리듬은 동조 기간 이후 일정한 암흑 및 온도 조건 하에서 측정합니다.

광주기 설정은 ld 마지막 날의 암기 중에 언제든지 변경할 수 있으며, 그렇게 하면 실험의 다음 날이 dd의 첫 번째 날이 됩니다. 7일간의 DD 데이터 수집이면 초파리의 일주기 주기와 진폭 또는 리듬의 강도를 계산하기에 충분합니다. 일반적으로 특정 유전자형에 대해 신뢰할 수 있는 자유 주행 주기를 얻으려면 최소 16마리 이상의 표본 크기가 필요합니다.

실험이 종료되면 DAM 시스템 소프트웨어를 통해 수집된 원시 이진 데이터를 휴대용 데이터 저장 장치(예: USB 메모리)로 다운로드합니다. 원시 이진 데이터는 DAM 파일 스캔 1 0 2 x를 사용하여 처리하며, 일주기 파라미터를 분석할 때는 15분 및 30분 단위로, 수면을 분석할 때는 1분에서 5분 단위의 빈(bin)으로 합산합니다.

휴식 파라미터. 현재 초파리에서 수면 휴식의 표준 정의는 5분 동안 연속적으로 활동이 없는 상태입니다. 이 프로토콜을 완료하면, 동일한 데이터 세트를 사용하여 실험군과 대조군 동물의 서카디안 및 수면 파라미터를 서카디안 파라미터 기준으로 비교할 수 있습니다.

LD 또는 DD 조건에서 며칠 동안 초파리의 일일 운동 활동 또는 평균 활동을 보여주는 유도 그래프(induction graphs)는 fast x oph melanogaster를 사용하여 생성할 수 있습니다. 일반적으로 초파리는 ZT 0을 중심으로 하는 오전 피크(morning peak)와 ZT 12를 중심으로 하는 오후 피크(evening peak)라는 두 차례의 활동 시간을 보입니다. 이 두 번의 활동 시기는 내인성 시계에 의해 조절되며, 자유 주행 DD 조건에서도 관찰될 수 있습니다. 이러한 활동 피크 타이밍의 변화는 유도 그래프에서 쉽게 관찰할 수 있으며, 이는 내인성 시계의 특성 변화를 나타낼 수 있습니다.

적절한 생체 시계 기능의 또 다른 지표는 실제 암기에서 명기로, 또는 명기에서 암기로 전환되기 전에 LD 주기에서 관찰되는 운동성 활동의 예측적 증가입니다. 이러한 행동은 야생형 초파리에서는 명확하게 관찰되지만, per zero 돌연변이체에서는 나타나지 않으며 비주기적입니다. 이 돌연변이체에서는.

LD 조건에서 관찰되는 오전 및 오후의 정점은 빛과 어둠 조건의 갑작스러운 변화에 따른 단순한 놀람 반응입니다. 시계 유전자가 결핍된 초파리는 환경 변화를 예측하지 못하고 단지 그에 반응할 뿐입니다. 행동 리듬성의 상실은 DD 조건에서 훨씬 더 뚜렷하게 나타나며, 일반적으로 per zero 초파리에서 볼 수 있듯이 운동 활성의 오전 또는 오후 정점이 완전히 사라지는 형태로 나타납니다.

유도 그래프 외에도, 운동 능력 데이터는 개별 초파리 또는 초파리 유전자형별로 더블 플롯 그램(double plot gram)으로 나타낼 수 있습니다. 이 방식에서는 각 줄에 이틀 치의 데이터가 순차적으로 표시되지만, 마지막 날의 프로필이 다음 줄의 이틀 분량 활동의 시작점이 됩니다. 예를 들어, ACTO 그램의 첫 번째 줄에는 LD 1일과 2일이 표시됩니다. 다음 줄은 LD 2일의 반복으로 시작하여 LD 3일이 뒤따르는 방식으로 구성됩니다.

이러한 형식을 따라, 전체 실험 기간 동안의 운동 활성 데이터가 ACTO gram에 표시되어 있습니다. 감소 그래프에 비해 ACTO gram이 갖는 한 가지 장점은 일일 활성 리듬의 주기 길이 변화를 쉽게 관찰할 수 있다는 점입니다. 유도 그래프 및 ACTO gram을 생성하는 것 외에도 말입니다.

DD 조건에서 얻은 운동 활성 데이터는 여러 가지 프로그램을 통해 주기 길이를 계산하기 위해 far X에 제출할 수 있으며, 여기에는 5분 연속 무활동으로 정의되는 수면 및 휴식 매개변수 분석을 위한 cycle P가 포함됩니다. 운동 활성 분석에서 기록된 데이터를 분석하고 MATLAB 기반 프로그램인 insomniac을 사용하여 여러 수면 매개변수를 조사할 수 있으며, 초파리가 수면 상태로 지내는 시간의 비율을 다양한 시간 간격으로 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 매 시간 또는 12시간마다의 수면 비율을 계산할 수 있습니다.

조사할 수 있는 다른 일반적인 수면 파라미터로는 수면의 응집도를 측정하여 수면의 질을 나타낼 수 있는 평균 휴식 지속 시간(mean rest bout length)이 있습니다. 또 다른 파라미터는 초파리가 깨어 있을 때의 활동률을 측정하는 각성 활동 횟수(wake activity count)입니다. 이 파라미터는 수면 및 휴식 행동에 진정으로 영향을 받은 초파리와 단순히 병들었거나 과잉 행동을 보이는 초파리를 구분하는 데 도움이 됩니다.

예를 들어, 단순히 병든 초파리는 활동성이 떨어지기 때문에 더 많이 자는 것처럼 보일 수 있습니다. 이러한 초파리의 경우, 대조군 동물에 비해 각성 상태의 활동량이 더 낮게 나타날 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 분석법을 통해 초파리의 서카디안 리듬 및 수면 표현형을 특성 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 운동 활동의 일주기 리듬.